CN106929461A

CN106929461A - 一种提高n‑乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌

Info

Publication number: CN106929461A
Application number: CN201710277428.4A
Authority: CN
Inventors: 陈坚; 堵国成; 刘延峰; 张晓龙
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: CN106929461B

Abstract

本发明公开了一种提高N‑乙酰神经氨酸产量的枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagA ΔnagB Δ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43‑Gna1，pP43NMK‑AGE‑NeuB)作为表达宿主，通过敲除磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件ptsG，增加N‑乙酰神经氨酸合成途径中磷酸烯醇式丙酮酸的供给，加强合成途径，本发明的重组枯草芽孢杆菌与出发菌株相比，其N‑乙酰神经氨酸产量从190mg/L提高到660mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N‑乙酰神经氨酸奠定了基础。

Description

一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌，属于遗传工程领域。

背景技术

N-乙酰神经氨酸是生物体内的一种糖类物质，广泛存在于微生物以及哺乳动物体内。在人体中，N-乙酰神经氨酸是细胞信息传递关键物质，参与细胞识别、信号转导、受精等多个生理过程。因此，N-乙酰神经氨酸被广泛应用于抗炎，增强婴儿免疫力，促进婴儿大脑发育，维持老年人大脑健康。目前，N-乙酰神经氨酸主要采用从酪蛋白、燕窝等含量相对丰富的天然材料中提取，得到的产品容易引起过敏反应，或是通过严苛条件的化学法合成，高温、高压工艺复杂，中间产物等难以分离，而且对环境污染严重。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded as safe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级N-乙酰神经氨酸的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌合成代谢流通量不足，影响N-乙酰神经氨酸代谢合成。如何调整枯草芽孢杆菌代谢流供给，增加前体供给以提高N-乙酰神经氨酸产量，是一个值得深入探讨的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明构建了一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌。

本发明的高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌，通过敲除磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG得到。

在本发明的一种实施方式中，所述磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG，表达的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌，是以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB为宿主构建得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB宿主是通过氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因重组于Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72(Liu Y,Zhu Y,Li J,Shin H-D,Chen RR,Du G,Liu L,Chen J.Modular pathway engineering of Bacillus subtilisfor improved N-acetylglucosamine production.Metabolic engineering,2014.23:42-52)基因组上整合表达，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、N-乙酰神经氨酸合酶编码基因重组于质粒pP43NMK(Zhang XZ,Cui ZL,Hong Q,Li SP.High-level expression andsecretion of methyl parathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800.Appliedand environmental microbiology.2005；71(7):4101-3.)上游离表达得到。

在本发明的一种实施方式中，所述氨基葡萄糖乙酰化酶的氨基酸序列为SEQ IDNO.2，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)构建重组敲除片段

克隆磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG两侧同源臂基因，克隆Spectinomycin抗性基因，3段基因通过融合PCR组装。

2)构建高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌

将上述重组敲除片段转化枯草芽孢杆菌，得到高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌。

本发明还提供了一种上述重组枯草芽孢杆菌在营养保健品方面的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌用于发酵生产N-乙酰神经氨酸是将35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-50h。

本发明的有益效果

本发明的宿主细胞中构建了利用N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因AGE以及N-乙酰神经氨酸合酶编码基因NeuB合成N-乙酰神经氨酸的新途径，利用枯草芽孢杆菌自有的代谢途径，从底物葡萄糖到N-乙酰神经氨酸的前体物质N-乙酰氨基葡萄糖仅需要强化氨基葡萄糖-果糖-6-磷酸转氨酶(glmS)和氨基葡萄糖乙酰化酶(GNA1)两个酶的作用即可，有助于强化合成代谢流。

本发明进一步通过改造PTS系统不仅可以提高葡萄糖利用率，并且可以调整枯草芽孢杆菌合成代谢途径中的底物浓度，使N-乙酰神经氨酸产量提高。

本发明提供的重组枯草芽孢杆菌可实现N-乙酰神经氨酸在胞外积累，其含量可达到660mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产N-乙酰神经氨酸奠定了基础。本发明提供的重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

具体实施方式

重组枯草芽孢杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

培养条件：将37℃、200rpm下培养16h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养45h。

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1200，UV检测器，HPX-87H柱(300×7.8mm，5μm)，流动相：5mM稀硫酸，流速0.50mL/min，柱温60℃，进样体积为10μL。

实施例1宿主细胞构建

1)构建重组片段

通过融合PCR，将氨基酸序列为SEQ ID NO.2的氨基葡萄糖乙酰化酶的编码基因GNA1克隆片段，与重组同源臂以及zeocin抗性基因融合；

2)构建重组质粒

克隆氨基酸序列为SEQ ID NO.3的N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的编码基因AGE，以及氨基酸序列为SEQ ID NO.4的N-乙酰神经氨酸合酶的编码基因NeuB，连接到重组表达质粒pP43NMK上；

3)构建产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌

将上述步骤1)中重组片段转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72)，重组到基因组上，获得重组枯草芽孢杆菌工程菌，命名为B6C；而后将上述步骤2)中重组质粒转化到B6C菌株中，得到产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB。

实施例2重组质粒的构建

根据NCBI上公布的磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG，设计其上游914bp同源臂序列，设计序列分别为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的引物：ptsG-1F:5’-TAAAAGACGAGAAGGAACAAAAGCAG-3’，ptsG-1R:5’-TCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAAGAATTGACCTCCTCTTTTTACTAGTCTG-3’；设计其下游927bp同源臂序列，设计序列分别为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的引物：ptsG-2F:5’-CGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGGGGTGTTAGTACGCCGTGCTTGT-3’，ptsG-2R:5’-AGATGTGCGTCCGCCGATAT-3’；根据P7S6质粒(Yan,X.,Yu,H.J.,Hong,Q.&Li,S.P.Cre/loxsystem and PCR-based genome engineering in Bacillus subtilis.AppliedandEnvironmental Microbiology 74,5556-5562,doi:10.1128/aem.01156-08(2008))序列信息扩增Spectinomycin抗性基因，设计序列分别为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10的引物：Spc-F:5’-TAGTAAAAAGAGGAGGTCAATTCTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’，Spc-R:5’-TGACAAGCACGGCGTACTAACACCCCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’。通过融合PCR，将以上3段基因融合成重组敲除片段。

实施例3重组枯草芽孢杆菌的构建

将构建好的重组敲除片段转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168ΔnagPΔnagPΔgamPΔgamAΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB)。采用Spc-F及Spc-R引物挑选转化子进行菌落PCR，出现1264bp条带，验证重组枯草芽孢杆菌构建成功。

实施例4宿主菌株发酵生产N-乙酰神经氨酸

将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养35h。最终发酵上清液中N-乙酰神经氨酸含量达到190mg/L。过量表达氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因GNA1，N-乙酰氨基葡萄糖异构酶基因AGE，N-乙酰神经氨酸合酶基因NeuB，实现了N-乙酰神经氨酸在重组枯草芽孢杆菌胞外的积累。

实施例5重组菌株发酵生产N-乙酰神经氨酸

将37℃、200rpm下培养10h的种子以15％的接种量转入发酵培养基，于37℃、200rpm条件下培养35h，最终发酵上清液中N-乙酰神经氨酸含量达到660mg/L。敲除磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG，实现了构建高产N-乙酰神经氨酸重组工程菌，较出发菌株产量190mg/L，有了较大提高。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权力要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 699

<212> PRT

<213> 磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG氨基酸序列

<400> 1

Met Phe Lys Ala Leu Phe Gly Val Leu Gln Lys Ile Gly Arg Ala Leu

1 5 10 15

Met Leu Pro Val Ala Ile Leu Pro Ala Ala Gly Ile Leu Leu Ala Ile

20 25 30

Gly Asn Ala Met Gln Asn Lys Asp Met Ile Gln Val Leu His Phe Leu

35 40 45

Ser Asn Asp Asn Val Gln Leu Val Ala Gly Val Met Glu Ser Ala Gly

50 55 60

Gln Ile Val Phe Asp Asn Leu Pro Leu Leu Phe Ala Val Gly Val Ala

65 70 75 80

Ile Gly Leu Ala Asn Gly Asp Gly Val Ala Gly Ile Ala Ala Ile Ile

85 90 95

Gly Tyr Leu Val Met Asn Val Ser Met Ser Ala Val Leu Leu Ala Asn

100 105 110

Gly Thr Ile Pro Ser Asp Ser Val Glu Arg Ala Lys Phe Phe Thr Glu

115 120 125

Asn His Pro Ala Tyr Val Asn Met Leu Gly Ile Pro Thr Leu Ala Thr

130 135 140

Gly Val Phe Gly Gly Ile Ile Val Gly Val Leu Ala Ala Leu Leu Phe

145 150 155 160

Asn Arg Phe Tyr Thr Ile Glu Leu Pro Gln Tyr Leu Gly Phe Phe Ala

165 170 175

Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Val Thr Ser Ile Ser Ala Leu Ile Leu

180 185 190

Gly Leu Ile Met Leu Val Ile Trp Pro Pro Ile Gln His Gly Leu Asn

195 200 205

Ala Phe Ser Thr Gly Leu Val Glu Ala Asn Pro Thr Leu Ala Ala Phe

210 215 220

Ile Phe Gly Val Ile Glu Arg Ser Leu Ile Pro Phe Gly Leu His His

225 230 235 240

Ile Phe Tyr Ser Pro Phe Trp Tyr Glu Phe Phe Ser Tyr Lys Ser Ala

245 250 255

Ala Gly Glu Ile Ile Arg Gly Asp Gln Arg Ile Phe Met Ala Gln Ile

260 265 270

Lys Asp Gly Val Gln Leu Thr Ala Gly Thr Phe Met Thr Gly Lys Tyr

275 280 285

Pro Phe Met Met Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Ile Tyr His

290 295 300

Glu Ala Lys Pro Gln Asn Lys Lys Leu Val Ala Gly Ile Met Gly Ser

305 310 315 320

Ala Ala Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Leu Glu Phe

325 330 335

Ser Phe Leu Phe Val Ala Pro Val Leu Phe Ala Ile His Cys Leu Phe

340 345 350

Ala Gly Leu Ser Phe Met Val Met Gln Leu Leu Asn Val Lys Ile Gly

355 360 365

Met Thr Phe Ser Gly Gly Leu Ile Asp Tyr Phe Leu Phe Gly Ile Leu

370 375 380

Pro Asn Arg Thr Ala Trp Trp Leu Val Ile Pro Val Gly Leu Gly Leu

385 390 395 400

Ala Val Ile Tyr Tyr Phe Gly Phe Arg Phe Ala Ile Arg Lys Phe Asn

405 410 415

Leu Lys Thr Pro Gly Arg Glu Asp Ala Ala Glu Glu Thr Ala Ala Pro

420 425 430

Gly Lys Thr Gly Glu Ala Gly Asp Leu Pro Tyr Glu Ile Leu Gln Ala

435 440 445

Met Gly Asp Gln Glu Asn Ile Lys His Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg

450 455 460

Leu Arg Val Thr Val Asn Asp Gln Lys Lys Val Asp Lys Asp Arg Leu

465 470 475 480

Lys Gln Leu Gly Ala Ser Gly Val Leu Glu Val Gly Asn Asn Ile Gln

485 490 495

Ala Ile Phe Gly Pro Arg Ser Asp Gly Leu Lys Thr Gln Met Gln Asp

500 505 510

Ile Ile Ala Gly Arg Lys Pro Arg Pro Glu Pro Lys Thr Ser Ala Gln

515 520 525

Glu Glu Val Gly Gln Gln Val Glu Glu Val Ile Ala Glu Pro Leu Gln

530 535 540

Asn Glu Ile Gly Glu Glu Val Phe Val Ser Pro Ile Thr Gly Glu Ile

545 550 555 560

His Pro Ile Thr Asp Val Pro Asp Gln Val Phe Ser Gly Lys Met Met

565 570 575

Gly Asp Gly Phe Ala Ile Leu Pro Ser Glu Gly Ile Val Val Ser Pro

580 585 590

Val Arg Gly Lys Ile Leu Asn Val Phe Pro Thr Lys His Ala Ile Gly

595 600 605

Leu Gln Ser Asp Gly Gly Arg Glu Ile Leu Ile His Phe Gly Ile Asp

610 615 620

Thr Val Ser Leu Lys Gly Glu Gly Phe Thr Ser Phe Val Ser Glu Gly

625 630 635 640

Asp Arg Val Glu Pro Gly Gln Lys Leu Leu Glu Val Asp Leu Asp Ala

645 650 655

Val Lys Pro Asn Val Pro Ser Leu Met Thr Pro Ile Val Phe Thr Asn

660 665 670

Leu Ala Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Lys Ala Ser Gly Ser Val Asn

675 680 685

Arg Glu Gln Glu Asp Ile Val Lys Ile Glu Lys

690 695

<210> 2

<211> 159

<212> PRT

<213> 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae S288C）

<400> 2

Met Ser Leu Pro Asp Gly Phe Tyr Ile Arg Arg Met Glu Glu Gly Asp

1 5 10 15

Leu Glu Gln Val Thr Glu Thr Leu Lys Val Leu Thr Thr Val Gly Thr

20 25 30

Ile Thr Pro Glu Ser Phe Ser Lys Leu Ile Lys Tyr Trp Asn Glu Ala

35 40 45

Thr Val Trp Asn Asp Asn Glu Asp Lys Lys Ile Met Gln Tyr Asn Pro

50 55 60

Met Val Ile Val Asp Lys Arg Thr Glu Thr Val Ala Ala Thr Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ile Ile Glu Arg Lys Ile Ile His Glu Leu Gly Leu Cys Gly His

85 90 95

Ile Glu Asp Ile Ala Val Asn Ser Lys Tyr Gln Gly Gln Gly Leu Gly

100 105 110

Lys Leu Leu Ile Asp Gln Leu Val Thr Ile Gly Phe Asp Tyr Gly Cys

115 120 125

Tyr Lys Ile Ile Leu Asp Cys Asp Glu Lys Asn Val Lys Phe Tyr Glu

130 135 140

Lys Cys Gly Phe Ser Asn Ala Gly Val Glu Met Gln Ile Arg Lys

145 150 155

<210> 3

<211> 388

<212> PRT

<213> 念珠藻（Anabaena sp.CH1）

<400> 3

Met Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Asn Ala Leu

1 5 10 15

Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn His Ser Leu Asp Ser Glu

20 25 30

Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Gln Gly Lys Val Tyr Asp Thr

35 40 45

Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Thr Phe Ser Met

50 55 60

Leu Cys Asn Gln Leu Glu Lys Arg Glu Asn Trp Leu Lys Ile Ala Arg

65 70 75 80

Asn Gly Ala Lys Phe Leu Ala Gln His Gly Arg Asp Asp Glu Gly Asn

85 90 95

Trp Tyr Phe Ala Leu Thr Arg Gly Gly Glu Pro Leu Val Gln Pro Tyr

100 105 110

Asn Ile Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln Tyr Ala

115 120 125

Leu Ala Ser Gly Glu Glu Trp Ala Lys Asp Val Ala Met Gln Ala Tyr

130 135 140

Asn Asn Val Leu Arg Arg Lys Asp Asn Pro Lys Gly Lys Tyr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Met Lys Ala Leu Ala Val Pro Met Ile

165 170 175

Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Gln Glu Thr

180 185 190

Leu Glu Asn Val Leu Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Met Gly Asp Phe

195 200 205

Leu Asp Gln Glu Gln Gly Leu Met Tyr Glu Asn Val Ala Pro Asp Gly

210 215 220

Ser His Ile Asp Cys Phe Glu Gly Arg Leu Ile Asn Pro Gly His Gly

225 230 235 240

Ile Glu Ala Met Trp Phe Ile Met Asp Ile Ala Arg Arg Lys Asn Asp

245 250 255

Ser Lys Thr Ile Asn Gln Ala Val Asp Val Val Leu Asn Ile Leu Asn

260 265 270

Phe Ala Trp Asp Asn Glu Tyr Gly Gly Leu Tyr Tyr Phe Met Asp Ala

275 280 285

Ala Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu Trp Trp

290 295 300

Val His Leu Glu Ser Leu Val Ala Leu Ala Met Gly Tyr Arg Leu Thr

305 310 315 320

Gly Arg Asp Ala Cys Trp Ala Trp Tyr Gln Lys Met His Asp Tyr Ser

325 330 335

Trp Gln His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu

340 345 350

Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys Trp Lys

355 360 365

Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Met Tyr Leu Cys Trp Gln Gln Phe

370 375 380

Glu Ala Leu Ser

385

<210> 4

<211> 346

<212> PRT

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli K1）

<400> 4

Met Ser Asn Ile Tyr Ile Val Ala Glu Ile Gly Cys Asn His Asn Gly

1 5 10 15

Ser Val Asp Ile Ala Arg Glu Met Ile Leu Lys Ala Lys Glu Ala Gly

20 25 30

Val Asn Ala Val Lys Phe Gln Thr Phe Lys Ala Asp Lys Leu Ile Ser

35 40 45

Ala Ile Ala Pro Lys Ala Glu Tyr Gln Ile Lys Asn Thr Gly Glu Leu

50 55 60

Glu Ser Gln Leu Glu Met Thr Lys Lys Leu Glu Met Lys Tyr Asp Asp

65 70 75 80

Tyr Leu His Leu Met Glu Tyr Ala Val Ser Leu Asn Leu Asp Val Phe

85 90 95

Ser Thr Pro Phe Asp Glu Asp Ser Ile Asp Phe Leu Ala Ser Leu Lys

100 105 110

Gln Lys Ile Trp Lys Ile Pro Ser Gly Glu Leu Leu Asn Leu Pro Tyr

115 120 125

Leu Glu Lys Ile Ala Lys Leu Pro Ile Pro Asp Lys Lys Ile Ile Ile

130 135 140

Ser Thr Gly Met Ala Thr Ile Asp Glu Ile Lys Gln Ser Val Ser Ile

145 150 155 160

Phe Ile Asn Asn Lys Val Pro Val Gly Asn Ile Thr Ile Leu His Cys

165 170 175

Asn Thr Glu Tyr Pro Thr Pro Phe Glu Asp Val Asn Leu Asn Ala Ile

180 185 190

Asn Asp Leu Lys Lys His Phe Pro Lys Asn Asn Ile Gly Phe Ser Asp

195 200 205

His Ser Ser Gly Phe Tyr Ala Ala Ile Ala Ala Val Pro Tyr Gly Ile

210 215 220

Thr Phe Ile Glu Lys His Phe Thr Leu Asp Lys Ser Met Ser Gly Pro

225 230 235 240

Asp His Leu Ala Ser Ile Glu Pro Asp Glu Leu Lys His Leu Cys Ile

245 250 255

Gly Val Arg Cys Val Glu Lys Ser Leu Gly Ser Asn Ser Lys Val Val

260 265 270

Thr Ala Ser Glu Arg Lys Asn Lys Ile Val Ala Arg Lys Ser Ile Ile

275 280 285

Ala Lys Thr Glu Ile Lys Lys Gly Glu Val Phe Ser Glu Lys Asn Ile

290 295 300

Thr Thr Lys Arg Pro Gly Asn Gly Ile Ser Pro Met Glu Trp Tyr Asn

305 310 315 320

Leu Leu Gly Lys Ile Ala Glu Gln Asp Phe Ile Pro Asp Glu Leu Ile

325 330 335

Ile His Ser Glu Phe Lys Asn Gln Gly Glu

340 345

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

taaaagacga gaaggaacaa aagcag 26

<210> 6

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tcctgtgtga aattgttatc cgctcaagaa ttgacctcct ctttttacta gtctg 55

<210> 7

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcggggtg ttagtacgcc gtgcttgt 48

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

agatgtgcgt ccgccgatat 20

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tagtaaaaag aggaggtcaa ttcttgagcg gataacaatt tcacacagg 49

<210> 10

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

tgacaagcac ggcgtactaa caccccgcca gggttttccc agtcacgac 49

Claims

1.一种提高N-乙酰神经氨酸产量的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是通过敲除磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG得到的。

2.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB为宿主构建得到的。

4.根据权利要求3所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述宿主是通过将氨基葡萄糖乙酰化酶编码基因重组于Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72基因组上进行整合表达，且将N-乙酰氨基葡萄糖异构酶编码基因、N-乙酰神经氨酸合酶编码基因重组于表达质粒pP43NMK上进行游离表达得到的。

5.根据权利要求4所述的重组芽孢杆菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖乙酰化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.2，所述N-乙酰氨基葡萄糖异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，所述N-乙酰神经氨酸合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

6.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)构建敲除片段

克隆磷酸转移酶系统葡萄糖特异性酶EIICBA组件编码基因ptsG两侧同源臂基因及Spectinomycin抗性基因片段，构建重组敲除片段；

2)构建高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌

将上述重组敲除片段转化枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB，得到高产N-乙酰神经氨酸重组枯草芽孢杆菌。

7.权利要求1所述重组枯草芽孢杆菌在营养保健品方面的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌用于生产N-乙酰神经氨酸。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生产，是将35-38℃、180-220rpm下培养10-20h的重组枯草芽孢杆菌以10％-20％的接种量转入发酵培养基，于35-38℃、180-220rpm条件下发酵30-50h。