CN108424870A - 一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产N‑乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。本发明以谷氨酸棒状杆菌S9114作为出发菌株，使用谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌的穿梭表达载体pJYW‑4表达了乙酰氨基葡萄糖合成途径中的一个关键酶基因：来源于秀丽隐杆线虫来源的氨基葡萄糖‑6‑磷酸乙酰转移酶GNA1，并通过在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列来加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，提高乙酰氨基葡萄糖的产量，得到了产乙酰氨基葡萄糖重组谷氨酸棒杆菌，产量达到6.1g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。

Description

一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用，属于代谢工程领域。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)是氨基葡萄糖的一种衍生物，具有还原性，也是合成双岐因子和透明质酸的重要前体物质，又称2-(乙酰氨基)-2-脱氧-葡萄糖及N-乙酰葡萄糖胺，是生物体内多种多糖的基本组成单位，在生物体内具有重要的生理功能。G1cNAc是新型的生化药品，在食品、医药和化妆品等领域都具有广泛应用。G1cNAc在自然界中存在范围广泛，尤其是海洋生物类动物的外骨骼中含量最高，所有生物均可以合成GlcNAc。GlcNAc是缔结组织、软骨组织及关节液等的关键组成物质，具有重要的药用效果。GlcNAc在临床上是关节炎类疾病的关键药物，其科学性己经临床试验相继验证。GlcNAc可以提高关节抗炎活性和蛋白活性，其效果好于透明质酸。GlcNAc可以诱导白血病细胞的分化，很可能成为新的低毒、高效的治疗白血的候选药物。同时GlcNAc能够促进人体粘多糖的合成，可以增强人体的抵抗力和人体免疫力。

谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性菌，它作为一种食品级的微生物已经应用于诸多氨基酸的工业化发酵生产中，如谷氨酸、缬氨酸、赖氨酸等等。近年来学者们开始研究利用谷氨酸棒杆菌生产非氨基酸物质。相比于大肠杆菌来说，谷氨酸棒杆菌具有高安全性，低致病性，高抗逆性，而且受噬菌体污染的概率较低等优点，因此它也基因工程领域发挥着重要作用。在谷氨酸棒状杆菌中因为不存在氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶，不存在通过葡萄糖合成N－乙酰氨基葡萄糖的途径。因此只有高效表达外源氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶基因才能使得谷氨酸棒状杆菌具有合成N-乙酰氨基葡萄糖的能力。

发明内容

本发明通过在谷氨酸棒杆菌中表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶，并在基因3’UTR添加了重复性回文序列以后在不影响谷氨酸棒杆菌生长情况的同时也提高了其GlcNAc产量。

本发明的第一个目的是提供一种重组谷氨酸棒杆菌，表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶。

在本发明的一种实施方式中，还在所述重组谷氨酸棒杆菌的GNA1基因终止密码子下游位置添加重复性回文序列，重复性回文序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组谷氨酸棒杆菌的出发菌株为谷氨酸棒杆菌S9114。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶的基因如NCBI-Gene ID:179437。

在本发明的一种实施方式中，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因通过表达载体pJYW-4进行表达，以启动子P_tac控制葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子P_tac由P_Trp启动子和P_lac启动子杂合而成，具有更高的转录效率，启动子P_tac的构建过程参见2014年公开的论文Construction of anovel expression system for use in Corynebacterium glutamicum.Plasmid 75,18-26.。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述谷氨酸棒杆菌工程菌的方法，具体方法如下:

(1)构建pJYW-4-ceN(表达GNAI基因)和pJYW-4-ceN-REP(在GNA1基因的3’非翻译区插入重复性回文序列)两个表达载体；(2)将两个表达载体转入宿主菌谷氨酸棒杆菌S9114，得到最终生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的葡萄糖乙酰化酶来源于秀丽隐杆线虫。

本发明的第三个目的是提供一种发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，应用所述重组谷氨酸棒杆菌进行发酵生产。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将28～30℃,220rpm下培养16h的种子以使得发酵培养基的初始OD₅₆₂为1.6的接种量转入发酵培养基，于28～30℃,220rpm条件下培养72～100h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基每L含有葡萄糖100.0g，玉米浆10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，(NH₄)₂SO₄ 20.0g，MgSO4 0.5g，CaCO₃ 20.0g,FeSO₄ 0.18g,pH 7.0。

有益效果：本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌可实现乙酰氨基葡萄糖在胞外积累，其浓度最高可达6.0g/L，为进一步代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌构建方法简单，便于使用，具有很好地应用前景。

附图说明

图1为构建重组pJYW-4-ceN质粒图谱。

图2为构建重组pJYW-4-ceN-REP质粒图谱。

图3为不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况。

图4为不同菌株摇瓶发酵上清液中GlcNAc的产量过程图。

图5为发酵条件优化后不同菌株摇瓶发酵的细胞生长情况。

图6为发酵条件优化后不同菌株摇瓶发酵上清液中GlcNAc的产量过程图。

具体实施方式

乙酰氨基葡萄糖的测定方法：

高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent 1260,RID检测器，HPX-87H柱(Bio-RadHercules,CA)，流动相:5mM H₂S0₄，流速0.6mL/min，柱温35℃，进样体积为10μL。

种子活化培养基液体(LBG)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0,葡萄糖5.0，装液量20ml每250ml三角瓶。

种子活化培养基固体(LBG固体)(g/L)：蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0,葡萄糖5.0，营养琼脂15.0-20.0。

感受态培养基(g/L):：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，NaCl 10.0,甘氨酸30.0，异烟肼4.0，同时加入10ml的Tween80,装液量50ml每500ml三角瓶。

电击转化后恢复培养基LBHIS(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0,脑心浸液18.5，山梨醇91.0。

转化子检出培养基固体(g/L)：蛋白胨5.0，酵母膏2.5，NaCl 5.0,脑心浸液18.5，山梨醇91.0,营养琼脂15.0-20.0。

种子培养基(g/L)：葡萄糖25.0,玉米浆20.0，KH₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄ 0.5，尿素1.25，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖40.0，玉米浆20.0,KH₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄ 20.0，MgSO40.5，CaCO₃ 20.0,pH 7.0。

优化发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆10.0,KH₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄ 20.0，MgSO40.5，CaCO₃ 20.0,FeSO₄ 0.18,pH 7.0。

灭菌条件：115℃，20min,所有培养基用于转化子检出或用于重组菌培养时加入25mg/L硫卡那霉素。

实施例1重组质粒pJYW-4-ceN和pJYW-4-ceN-REP的构建。

使用引物cegna1F(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)所示和cegna1R(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)将来自线虫的葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶(GNA1)基因从pP43-HA-ceN-RBS4质粒上扩增下来，使用的酶切位点是PstI和NotI，pP43-HA-ceN-RBS4质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

使用质粒pJYW-4作为表达载体来表达GNA1，pJYW-4具体构建过程参见文献Hu,J.等,(2014)Construction of a novel expression system for use in Corynebacteriumglutamicum.Plasmid 75,18-26.。

使用LA Taq HS DNA聚合酶扩增GNA1基因。

以提取的pP43-HA-ceN-RBS4质粒为模板，PCR条件为：95℃预变性3min；98℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸45s，反应30个循环；最后72℃延伸l0min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，获得GNA1基因。

用限制性内切酶Pst I和Not I切上一步所得GNA1基因PCR产物，验证用酶切体系为：PCR产物DNA 5μL，Pst I 0.5μL，Not I 0.5μL，10×H buffer 2μL，加入双蒸水至20μL；回收用酶切体系为：质粒DNA 16μL，Pst I 1μL，Not I I 1μL，10×H buffer 2μL。进行1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物或回收目的片段。同时将质粒pJYW-4做同样的双酶切处理，然后胶回收酶切产物。

连接插入片段和质粒,采用连接试剂盒。将载体和插入片段按1∶1到1∶10的分子数比混合，加入等量的连接混合溶液，16℃下采用T4连接酶连接1h或过夜。然后转化E.coli.BL21(DE3)感受态细胞。挑选菌落PCR正确的转化子进行测序验证，得到重组质粒pJYW-4-ceN(图1)。

在质粒pJYW-4-ceN的基础上用引物PJYWREP(JG)F(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)和PJYWREP(JG)R(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)将带有间隔区序列的REP序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.1)加GNA1基因的3'UTR处，以测序正确的pJYW-4-ceN质粒为模板，PCR条件为：95℃预变性3min；98℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸7min40s，反应30个循环；最后72℃延伸l0min。PCR产物用DNA纯化试剂盒回收，然后转化E.coli.BL21(DE3)感受态细胞(感受态制备方法详见Takara大肠杆菌感受态试剂盒说明书)。

测序正确后得到重组质粒pJYW-4-ceN-REP(图2)。

将质粒pJYW-4-ceN和pJYW-4-ceN-REP分别通过电击转化法转化到谷氨酸棒杆菌S9114菌株中。

谷氨酸棒杆菌电转感受态的制备：

(1)C.glutamicum接种于LBG培养基(需要新鲜培养的斜面上进行挑选，否则会影响菌体的生长)，置于巡回式摇床(200rpm)上，30℃培养16h,OD₅₆₂达到3.0。

(2)10％转接入感受态培养基中OD₅₆₂达到0.3，置于巡回式摇床(200rpm)上，30℃培养至OD₅₆₂达到0.9(培养约3-5h，处于对数生长期即可，一般如果菌浓的持续较低约0.6左右也可以继续后续操作)。需要保证菌体浓度尽量要浓，一般浓缩倍数为100倍(50mL感受态培养基浓缩至0.5mL制备5管感受态细胞)。

(3)菌液冰水浴15min,4,000rpm,4℃离心10min，小心的弃去上清。

(4)用30mL预冷10％甘油充分悬浮菌体，4,000rpm，4℃离心10min，小心的弃去上清，重复洗涤四次。

(5)用500μL预冷10％甘油重悬细胞(浓缩100倍)，1.5mL无菌离心管分装，每管100μL。

(6)-80℃保存待用，为保证感受态的转化效率最好现用现做，不能放置超过1周，否则由于感受态细胞裂解细胞内容物释放，在后续电击转化过程中造成电转杯的击穿，同时影响转化效率。

谷氨酸棒杆菌的电击转化：

(1)-80℃保存的谷氨酸棒状杆菌感受态，冰浴中融化。

(2)加入1-5.0μL质粒混匀(DNA总量约为1.0μg)，冰浴5-10min。

(3)加入于预冷的0.1cm电击杯中，1.8KV电压5ms电击2次。

(4)迅速加入预热的恢复用培养基(LBWS)1.0mL混匀并转移到新的1.5mL无菌离心管中，46℃水浴6min，后放入冰浴中。

(5)将菌体置于巡回式摇床(100rpm)上，30℃后培养2h。

(6)6,000rpm，常温离心1min，涂布到加入对应抗性的转化子检出平板中，于30℃恒温培养箱，培养2-3天。

(7)感受态效率验证:加入5.0μL无菌ddH₂O作为阴性对照，无菌落，阳性对照加入1-5μL质粒pXMJl9(DNA总量约为1.0μg)，长出大量菌落。

实施例2重组谷氨酸棒杆菌生产乙酰氨基葡萄糖及重复性回文序列对乙酰氨基葡糖糖产量的影响

将测序结果正确的分别含有将质粒pJYW-4-ceN和pJYW-4-ceN-REP的重组谷氨酸棒杆菌菌株于甘油管接种划线LBG平板(添加硫卡那霉素25mg/L),30℃下220rpm培养18h后再挑选单菌落重新划线LBG平板直至长出大量菌落。

接种一环单菌落至种子培养基，30℃下220rpm培养16至18h至细胞生长对数前期。

按10％的接种量将种子培养液接种至发酵培养基中，30℃220rpm培养100h。每隔10h取一次菌液，测量OD₅₆₂，葡萄糖剩余量及GlcNAc生成量。

由图3可以看出100h内不同菌株摇瓶发酵的细胞生长趋势相似。

以含有质粒pJYW-4-ceN的重组菌为对照，在相同条件下培养、发酵，100h后GlcNAc产量为0.65g/L，而含有添加了REP序列的质粒pJYW-4-ceN-REP的菌株100h GlcNAc产量为0.83g/L，相比对照菌株提高了27.7％(图4)。

实施例3发酵条件优化对重组谷氨酸棒杆菌生产乙酰氨基葡糖糖产量的影响

发酵培养基的成分配及接种量比对菌株生长和代谢产物的积累有很大的影响，因此在实施例2的基础上将培养基成分改变为(g/L)：葡萄糖100.0，玉米浆10.0,KH₂PO₄ 1.0，(NH₄)₂SO₄20.0，MgSO4 0.5，CaCO₃ 20.0,FeSO₄ 0.18,pH 7.0。发酵培养基接种量由10％改变为使得发酵培养基初始OD₅₆₂为1.6的接种量，其他培养及发酵后检测方法同实施例2一致。

由图5可以看出100h内不同菌株摇瓶发酵的细胞生长趋势相似。

以含有质粒pJYW-4-ceN的重组菌为对照，在相同条件下培养、发酵，100h后GlcNAc产量为4.1g/L，而含有添加了REP序列的质粒pJYW-4-ceN-REP的菌株100h GlcNAc产量为6.0g/L，相比对照菌株提高了46.3％(图6)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的谷氨酸棒杆菌及其应用

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

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tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 5100

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 5160

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 5220

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 5280

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 5340

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 5400

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 5460

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 5520

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 5580

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 5640

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 5700

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 5760

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 5820

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct 5880

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 5940

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 6000

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 6060

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 6120

taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 6180

caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 6240

gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 6300

gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 6360

ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 6420

attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 6480

gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 6540

tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 6600

agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 6660

gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 6720

actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 6780

tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 6840

attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 6900

tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 6960

tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 7020

aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 7080

tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 7140

cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 7200

acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 7237

Claims (10)

1.一种重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，表达氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶；所述氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶来源于秀丽隐杆线虫。

2.根据权利要求1所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，编码所述氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶的基因Gene ID为179437。

3.根据权利要求1或2所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，还在氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因终止密码子下游位置添加重复性回文序列，重复性回文序列含有如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1～3任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株。

5.根据权利要求1～4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌，其特征在于，以pJYW-4为载体表达氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶，以启动子P_tac控制葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因的表达。

6.一种构建权利要求5所述谷氨酸棒杆菌工程菌的方法，具体方法如下:

(1)构建表达氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶的表达载体和/或在氨基葡萄糖-6磷酸乙酰化酶基因的3’非翻译区插入重复性回文序列的表达载体；(2)将步骤(1)的表达载体转入宿主菌谷氨酸棒杆菌S9114。

7.一种发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，应用权利要求1～5任一所述的重组谷氨酸棒杆菌进行发酵生产。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵是在28～30℃下发酵72～100h。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，用于发酵的发酵培养基每L含有葡萄糖、玉米浆、KH₂PO₄、(NH₄)₂SO₄、MgSO4、CaCO₃和FeSO₄。

10.权利要求1～4任一所述的重组谷氨酸棒杆菌在制备含N-乙酰氨基葡萄糖的食品、药品、保健品方面的应用。