CN100999756A - 用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ－聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ－聚谷氨酸的方法，该方法采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株与谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌株，在含有碳源、氮源、无机盐和生物素的培养基中培养，经优化条件得到γ－聚谷氨酸发酵液，通过有机溶剂沉淀、透析、干燥得到γ－聚谷氨酸。本发明在发酵过程中不需要在培养基中加入L－谷氨酸前体，降低了生产成本，而且产量高。
Description
本发明涉及一种利用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(Poly γ-glutamnic acid，γ-PGA)是一种可以通过微生物合成的均氨基酸化合物。作为一种生物高分子材料，γ-聚谷氨酸具有生物可降解性好、可食、对人体和环境无毒害的优点。因此，γ-聚谷氨酸及其衍生物在食品、化妆品、医药和水处理等方面具有广泛的用途。
目前合成γ-聚谷氨酸的方法主要有化学合成法、提取法和微生物合成法等。但是化学合成法合成路线长、副产物多、收率低，并且产物的分子量小、难于满足作为新型药物载体材料的要求，没有工业应用价值。而提取法由于γ-聚谷氨酸浓度较低，且随条件不同，含量变化大。因此，提取工艺十分复杂，生产成本甚高，同样难以进行大规模的工业生产。
目前主要采用微生物发酵法生产γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸是1937年Ivanovics在Bacillus anthracis的荚膜中首先发现(Ivanovics G，Bruckner V.Immunit atsforch.1937，90，304～318)。韩国研究人员在2.5升发酵罐中对Bacilluslicheniformis ATCC9945a采用流加高密度培养的方法，发酵35小时后可达到35g/L的最终产量(Yoon SH，DO JH，Lee SY.Biotechnol.Lett，2000，22：585～588)。Ogawa对Bacillus subtilis MR 141的大规模生产进行的研究表明在30L的发酵罐中优化培养条件可使γ-聚谷氨酸最大产量达到35g/L(Ogawa Y，Yamaguchi F，Yuasa K.Biosci Biotec Biochem，1997，61：1684～1687)。Kubota在Osaka City University土壤中分离得到的一株Bacillus subtilis F201，该菌株在最佳发酵生产条件下可以达到50g/L的最高产量，这是文献报道的最高产产量(Kubota H.Biosci Biotec Biochem，1993：1212～1213)。该菌株已被Meiji SeikaKaisha公司成功用于工业化大规模生产γ-聚谷氨酸(Tanaka T，Yaguchi T，HirutaO，et al.Biosci Biotechnol Biochem，1993，57，1809～1810；Tanaka T，Hiruta O，Futamura T，et al.Biosci Biotechnol Biochem，1993，57，2148～2153)。
虽然γ-聚谷氨酸的发酵生产取得了较大的进展，但是仍然存在需要大量的外源性谷氨酸的添加，耗用原材料较多，生产周期较长，生产效率低下等缺点，从而导致生产成本较高的问题，严重制约了聚谷氨酸产品的大规模的工业应用。因此，高效、低成本生产γ-聚谷氨酸的新技术和新工艺需要进一步研究和开发。
味精是一种常用的调味品，2004年全世界味精的产量达到200万吨。目前工业化生产味精的主要菌种是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，该菌L-谷氨酸的生产能力高达70～130g/L(Kumagai H.Advances in BiochemicalEngineering/Biotechtechnology，vol.69，Springer-Verlag，Berlin Heidelberg，2000，71-85)。在γ-聚谷氨酸的发酵生产中，绝大部分微生物菌种需要加入L-谷氨酸作为前体，才能高水平生产γ-聚谷氨酸。因此，如果直接将产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌与具有γ-聚谷氨酸合成能力的枯草芽孢杆菌进行混合培养，将二个发酵过程整合为一个发酵过程，将无需添加或少量添加外源L-谷氨酸，并能直接利用葡萄糖做碳源生产γ-聚谷氨酸，从而能大幅度降低聚谷氨酸的生产成本。另外，在以前枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)生产γ-聚谷氨酸的过程中，蛋白胨的消耗较大，导致生产成本增加，在本发明的二菌混合培养体系中，发酵培养基主要基于谷氨酸棒杆菌培养基，能够大幅度减少了蛋白胨的用量，从而能进一步降低γ-聚谷氨酸的生产成本。本项目发明是一种新型的聚谷氨酸的发酵新技术和新工艺，具有重要的工业应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、低成本，用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ-聚谷氨酸的方法。
本发明的用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
下述的各培养基成分按质量体积百分数计量，以水补足体积，
1)草芽孢杆菌种子液的制备：
第一步：选择能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)菌种，经28℃～40℃斜面固体培养6～12小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，pH 6.0～8.0；
第二步：从上述成熟的固体斜面上接种能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌于液体种子培养基，经28℃～40℃培养6～14小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为0.5～3，该液体种子培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，pH6.0～8.0；
2)谷氨酸棒杆菌种子液的制备
第一步选择能够产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌种，经28℃～40℃斜面固体培养6～12小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为0.02％～4％，pH 6.0～8.0；
第二步从上述成熟的固体斜面上接种谷氨酸棒杆菌菌体于液体种子培养基，经28℃～40℃培养6～14小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为0.5～5，该液体种子培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为0.2％～4％，生物素0.005％，pH 6.0～8.0；
3)枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和发酵生产聚谷氨酸：
第一步在摇瓶中加入谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入谷氨酸棒杆菌液体种子，在28～40℃培养6-12小时，然后接入枯草芽孢杆菌液体种子，两种菌体的数量比为20∶1到40∶1，菌体总量在108-1012(个/毫升)范围内，进行混合培养发酵12～28小时，谷氨酸棒杆菌的发酵培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，生物素0.005％，pH6.0～8.0；
或者在小型发酵罐中加入谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入谷氨酸棒杆菌液体种子，控制溶解氧在20％以上，在28～40℃培养6-12小时，然后接入枯草芽孢杆菌液体种子混合培养发酵18～40小时；
第二步发酵结束后，用离心的方法去除发酵液中的菌体，将上清液的pH值调至3～5，然后加入有机溶剂，加入量为上清液体积的2～5倍，沉淀，将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥或者真空干燥得到γ-聚谷氨酸。
本发明中，所说的能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7；该菌株系本发明人从酱油生产废料中分离选育而得，于2004年11月15日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1250。
所说的能够产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌种为谷氨酸棒杆菌S9114，该菌株系天津科技大学惠赠。
本发明中，枯草芽孢杆菌种子和发酵培养基的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉和淀粉中的一种或其混合物；氮源是有机氮源：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、黄豆饼粉或玉米粉，或是无机氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4或尿素；无机盐为MgSO4，NaCl或K2HPO4。
本发明中，谷氨酸棒杆菌种子和发酵培养基的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉和淀粉中的一种或其混合物，以葡萄糖较为合适；氮源是有机氮源：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、黄豆饼粉或玉米粉，或是无机氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4或尿素；无机盐为MgSO4，NaCl或K2HPO4。
本发明步骤3)混合培养体系中的菌体总量采用结晶紫测定，枯草芽孢杆菌菌量用荚膜染色法测定。所说的有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。
为了降低步骤3)中发酵液的粘度，可以在发酵液中添加NaCl。
本发明的主要影响因素包括混合菌种的种龄、菌体混合比例、培养基比例等。谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114的种龄过短，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7将对其产生生长抑制，反之亦然。一般将混合时谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114的OD600控制在1～4，将混合时枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7的OD600控制在0.5～3之间。另外，如果两种菌体混合比例过大，优势菌体也对另一菌株产生抑制作用，不利于γ-聚谷氨酸产生。一般将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7的数量比控制在20∶1到40∶1。
γ-聚谷氨酸的分离纯化方法采用有机溶剂沉淀法。利用离心的方法去除发酵液中的菌体，用盐酸将上清液的pH值调至3～5，然后加入有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮，加入量为上清液体积的2～5倍，沉淀，将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得到白色粉末状物质，此白色物质为γ-聚谷氨酸。
本发明得到的γ-聚谷氨酸具有以下理化性质：
1)本产品溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂；
2)本产品茚三酮反应呈阴性，用6MHCl水解后茚三酮反应呈阳性；
3)6MHCl水解后用HPLC和薄层层析法检测，发现水解物中生成单一的氨基酸—谷氨酸。证明本产品为谷氨酸的高分子聚合物；
4)通过SDS-PAGE和凝胶过滤色谱等方法证明本产物的分子量为200～1000KDa；
本发明制备的γ-聚谷氨酸分子上具有大量的游离羧基，因而具有良好的吸湿性能和保湿性能，可以作为难溶性药物载体、食品增稠剂、淀粉防老化剂和化妆品的保湿剂。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1)本发明使用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7微生物菌株可以高效率的发酵生产γ-聚谷氨酸；
2)本发明在发酵过程中不需要在培养基中加入L-谷氨酸前体，降低了生产成本；
3)通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7菌株和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114菌株混合培养条件的优化，使发酵液中的γ-聚谷氨酸的含量高达11～32g/L，从而提供了一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
下述的各培养基成分按质量体积百分数计量，以水补足体积。
1)枯草芽孢杆菌种子液的制备：
第一步：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7，经37℃斜面固体培养8小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，谷氨酸3％，MgSO4 0.1％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％，PH7；
第二步：从上述成熟的固体斜面上接种能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌于液体种子培养基，经37℃摇瓶培养13小时，转速200rpm，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为3，该液体种子培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1.5％，谷氨酸3％，MgSO4 0.1％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％，pH7，装液量20ml/500ml摇瓶，115℃灭菌20分钟。
2)谷氨酸棒杆菌种子液的制备
第一步将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114，经37℃斜面固体培养8小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，MgSO4 0.01％，K2HPO4 0.01％，pH7；
第二步从上述成熟的固体斜面上接种谷氨酸棒杆菌菌体于液体种子培养基，经37℃培养10小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为1，该液体种子培养基：葡萄糖5％，尿素0.5％，玉米淀粉水解液0.5％，K2HPO4 0.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.04％，FeSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·H2O0.001％，生物素0.005％，pH7；
3)枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和发酵生产聚谷氨酸：
在摇瓶(500ml)中加入20ml谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入OD600为1的谷氨酸棒杆菌液体种子，在37℃培养12小时，然后接入OD600为3的枯草芽孢杆菌液体种子，两种菌体的数量比为20∶1，菌体总量在108-1012(个/毫升)范围内，进行混合培养发酵24小时，谷氨酸棒杆菌的发酵培养基：葡萄糖10％，尿素0.5％，玉米淀粉水解液0.5％，K2HPO4 0.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O0.04％，FeSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·H2O 0.001％，生物素0.005％，pH7；
发酵结束后，用离心的方法去除发酵液中的菌体，将上清液的PH值调至4，然后加入甲醇，加入量为上清液体积的4倍，沉淀，将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得到15.1g/Lγ-聚谷氨酸。
实施例2
同实施例1，将混合培养体系中谷氨酸棒杆菌发酵培养基中的葡萄糖更换成蔗糖。发酵结束后，同实施例1分离纯化γ-聚谷氨酸，产量可达到18.3g/L。
实施例3
1)枯草芽孢杆菌种子液的制备：
第一步：将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7，经37℃斜面固体培养8小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，谷氨酸3％，MgSO4 0.1％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％，pH7；
第二步：从上述成熟的固体斜面上接种能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌于液体种子培养基，经37℃摇瓶培养12小时，转速200rpm，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为0.5，该液体种子培养基：葡萄糖2％，蛋白胨1.5％，谷氨酸3％，MgSO4 0.1％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％，pH7，装液量20ml/500ml摇瓶，115℃灭菌20分钟。
2)谷氨酸棒杆菌种子液的制备
第一步将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114，经37℃斜面固体培养8小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，MgSO4 0.01％，K2HPO4 0.01％，pH7；
第二步从上述成熟的固体斜面上接种谷氨酸棒杆菌菌体于液体种子培养基，经37℃培养12小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为4.0，该液体种子培养基：葡萄糖5％，尿素0.5％，玉米淀粉水解液0.5％，K2HPO40.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.04％，FeSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·H2O0.001％，生物素0.005％，pH7；
3)枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和发酵生产聚谷氨酸：
在摇瓶(500ml)中加入20ml谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入OD600为4.0的谷氨酸棒杆菌液体种子，在37℃培养12小时，然后接入OD600为0.5的枯草芽孢杆菌液体种子，两种菌体的数量比为20∶1，菌体总量在108-1012(个/毫升)范围内，进行混合培养发酵24小时，加入10ml枯草芽孢杆菌(Bacillussubtills)zju-7的发酵培养基(不含L-谷氨酸)，同时流加尿素保持混合培养体系pH值为7，谷氨酸棒杆菌的发酵培养基：葡萄糖10％，尿素0.5％，玉米淀粉水解液0.5％，K2HPO4 0.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.04％，FeSO4·7H2O0.001％，MnSO4·H2O 0.001％，生物素0.005％，pH 7；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtills)zju-7的发酵培养基(不含L-谷氨酸)：发酵培养基：蔗糖6％，蛋白胨6％，谷氨酸8％，NaCl 1％，MgSO4 0.1％，NaCl 1％，K2HPO4 0.01％；
发酵结束后，用离心的方法去除发酵液中的菌体，将上清液的pH值调至4，然后加入甲醇，加入量为上清液体积的4倍，沉淀，将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得到13.8g/L γ-聚谷氨酸。
实施例4
同实施例3，将摇瓶培养基中的葡萄糖以蔗糖代替，结果得到18.1 g/L的γ-聚谷氨酸，
实施例5
同实施例1，将菌体OD600为0.5的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7接入装液量为200ml/500ml的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114发酵培养基中，其中谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114菌体OD600为3.0，两种菌体的数量比为40∶1，菌体总量106-109(个/毫升)。将上述混合培养体系于37℃培养24小时，加入5ml枯草芽孢杆菌(Bacillussubtills)zju-7的发酵培养基(不含L-谷氨酸)，同时流加尿素保持混合培养体系pH值为7。
发酵结束后，离心去除发酵液中的菌体，用盐酸将上清液的pH值调至4，然后加入4倍体积甲醇，沉淀，将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，最后将溶液冷冻干燥得到28.5g/L的γ-聚谷氨酸。
实施例6
同实施例5，将摇瓶培养基中的葡萄糖以蔗糖代替，发酵结束后，按照实施例1的方法分离纯化γ-聚谷氨酸，其产量可达到31.7g/L。
实施例7
同实施例5，将混合培养体系培养温度调整为35℃培养24小时。
发酵结束后，同实施例1分离纯化γ-聚谷氨酸，产量可达到17.2g/L。
实施例8
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7经37℃斜面活化12小时，斜面培养基为：葡萄糖1％，蛋白胨2％，谷氨酸2％，MgSO4 0.05％，NaCl 1％，K2HPO40.01％，。
在斜面上挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7单菌落至一级种子培养基中，37℃转速200rpm培养12小时获得枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7一级种子，一级种子培养基为：葡萄糖2％，蛋白胨2％，谷氨酸3％，MgSO40.05％，NaCl 1％，K2HPO4 0.1％，pH.7，装液量10ml/100ml摇瓶，115灭菌15～30分钟。
以蔗糖1％，蛋白胨1％，谷氨酸4％，MgSO4 0.1％，NaCl.0.5％，K2HPO40.05％为二级种子培养基，pH7，装液量100ml/1000ml摇瓶，115℃灭菌20分钟，灭菌结束后，冷却，接入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7一级种子，接种量为3％，37℃摇瓶培养，200rpm，培养至菌体OD600为0.5。
将谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114经37℃斜面活化8小时，斜面培养基：葡萄糖1.5％，蛋白胨1％，MgSO4 0.01％，K2HPO4 0.01％。
将活化后的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114接种于含葡萄糖5％，尿素0.5％，玉米淀粉水解液0.5％，K2HPO4 0.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.04％，FeSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·H2O 0.001％，生物素0.005％的种子培养基中37℃培养12小时。
以葡萄糖10％，尿素0.5％，玉米淀粉水解液0.5％，K2HPO40.1％，KH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.04％，FeSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·H2O 0.001％，生物素0.005％为发酵培养基，pH7，装液量2.0L/5L发酵罐，115℃灭菌20分钟，接入谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)S9114活化后的种子，接种量为1％，控制发酵液pH值为6.5～7.0，通气量为3.0vvm，温度为37℃，培养至菌体OD600为3.0，接入菌体OD600为0.5的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7二级种子40ml，同时加入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)zju-7的发酵培养基500ml。将上述混合培养体系于37℃培养24小时，同时流加尿素保持混合培养体系pH值为7。
发酵结束后，同实施例1分离纯化γ-聚谷氨酸，产量可达到32.1g/L。
Claims (7)
1、用枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和培养体系制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是包括以下步骤，下述的各培养基成分按质量体积百分数计量，以水补足体积：
1)枯草芽孢杆菌种子液的制备：
第一步：选择能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)菌种，经28℃～40℃斜面固体培养6～12小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，pH6.0～8.0；
第二步：从上述成熟的固体斜面上接种能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌于液体种子培养基，经28℃～40℃培养6～14小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为0.5～3，该液体种子培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，pH 6.0～8.0；
2)谷氨酸棒杆菌种子液的制备
第一步选择能够产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌种，经28℃～40℃斜面固体培养6～12小时，制备成熟的斜面种子，斜面营养培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为0.02％～4％，pH6.0～8.0；
第二步从上述成熟的固体斜面上接种谷氨酸棒杆菌菌体于液体种子培养基，经28℃～40℃培养6～14小时，制备用于混合菌种发酵的液体种子，OD600为0.5～5，该液体种子培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为0.2％～4％，生物素0.005％，pH6.0～8.0；
3)枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌混和发酵生产聚谷氨酸：
第一步在摇瓶中加入谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入谷氨酸棒杆菌液体种子，在28～40℃培养6-12小时，然后接入枯草芽孢杆菌液体种子，两种菌体的数量比为20∶1到40∶1，菌体总量在108-1012(个/毫升)范围内，进行混合培养发酵12～28小时，谷氨酸棒杆菌的发酵培养基：碳源为1.0～9％，氮源为1.0～5.0％，无机盐为1.0～4％，生物素0.005％，pH6.0～8.0；
或者在小型发酵罐中加入谷氨酸棒杆菌发酵培养基，然后接入谷氨酸棒杆菌液体种子，控制溶解氧在20％以上，在28～40℃培养6-12小时，然后接入枯草芽孢杆菌液体种子混合培养发酵18～40小时；
第二步发酵结束后，用离心的方法去除发酵液中的菌体，将上清液的pH值调至3～5，然后加入有机溶剂，加入量为上清液体积的2～5倍，沉淀，将沉淀物重新溶解在100倍体积水中，过滤除去不溶物，然后透析除去小分子物质，
最后将溶液冷冻干燥或者真空干燥得到γ-聚谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是所说的能够产聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)菌种为枯草芽孢杆菌zju-7。
3.根据权利要求1所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是能够产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)菌种为谷氨酸棒杆菌S9114。
4.根据权利要求1所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是枯草芽孢杆菌种子和发酵培养基的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉和淀粉中的一种或其混合物；氮源是有机氮源：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、黄豆饼粉或玉米粉，或是无机氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4或尿素；无机盐为MgSO4，NaCl或K2HPO4。
5.根据权利要求1所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是谷氨酸棒杆菌种子和发酵培养基的碳源是葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉和淀粉中的一种或其混合物；氮源是有机氮源：蛋白胨、酵母膏、玉米浆、黄豆饼粉或玉米粉，或是无机氮源：NH4NO3、(NH4)2SO4或尿素；无机盐为MgSO4，NaCl或K2HPO4。
6.根据权利要求1所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是步骤3)混合培养体系中菌体总量采用结晶紫测定，枯草芽孢杆菌菌量用荚膜染色法测定。
7.根据权利要求1所述的制备γ-聚谷氨酸的方法，其特征是有机溶剂为甲醇、乙醇或丙酮。
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