CN101109010B - 一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株γ-聚谷氨酸的高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)CGMCC No.2108,本发明还提供了该菌株的培养方法及适用的培养基。本发明提供的产γ-聚谷氨酸的菌株营养要求简单,传代稳定,γ-聚谷氨酸的最高产量可达34.1g/l,而且培养方法简便易行,所用培养基的原料来源广泛,价格低廉,有效降低了生产成本,适合大规模的工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及γ-聚谷氨酸的生产领域,具体地涉及一株产γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是谷氨酸单体之间以其α-氨基和γ-羧基缩合而成的一种高分子聚合物,聚合度一般大于30万。γ-PGA可由微生物合成、水溶性好、吸水性强、且生物可降解、对人体无毒害作用,因而被广泛用于食品、化妆品、水处理、农业和医药等领域。例如,γ-PGA是一种理想的药物载体,γ-PGA分子链上具有高活性的羧基(-COOH),可与一些药物结合生成较稳定的复合物,该复合物在体内可被降解为内源性谷氨酸并释放出药物。又如γ-PGA的两次重复吸水可达到1108.4倍,比市售的聚丙烯酸盐类树脂高2.85倍,因此γ-PGA可用于制备高吸水树脂,该树脂对土壤改良、促进土壤中团粒结构的形成、增强土壤通透性和防止土壤侵蚀具有很好的作用。
国内外对于γ-PGA生物合成的研究主要集中在芽孢杆菌属(Bacillus),例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。目前,芽孢菌属微生物发酵生产γ-PGA产量低、生产成本高,所以未能实现大规模工业生产。
本发明利用诱变技术筛选得到一株γ-PGA的高产菌株,并优化其发酵工艺,提高γ-PGA的产量,有效降低了生产成本,实现了γ-PGA的工业化生产。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一株γ-PGA的高产菌株,本发明的又一目的是提供该菌株的培养方法及适用的培养基。
(二)技术方案
本发明通过物理诱变,筛选出一株高产γ-PGA的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis),该菌株已于2007年7月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.2108。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的形态学特征为:
菌体形态:杆状,数个菌体可连成链状,在细胞生长后期生成芽孢;
菌落特征:乳白色,培养24小时后菌落直径大小为0.3-0.8cm,表面凸起、有褶皱,挑起时有粘稠感。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养特征为:
好氧,在有氧条件下才能生长,在γ-PGA的合成阶段要有充足的氧气。最适生长温度为37℃,最适pH为7,在菌体的生长期pH会降低到5-6,当γ-PGA开始合成时pH升高,可达到8以上。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的诱变筛选方法为:挑取出发菌株CICC 10023(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的单菌落,接入装有玻璃珠的无菌三角瓶内,加30毫升无菌水,以170r/min的转数振荡20min,将菌落打散,制成菌悬液。将装有菌悬液的平皿置于磁力搅拌器上,用40瓦的紫光灯分别照射1min、2min、3min,然后将三个处理的菌悬液分别稀释至10-5和10-3,涂发酵培养基固体平板,避光培养24小时,然后筛选出菌落形态特征发生改变的突变株。将初步筛选得到的菌株反复诱变多次,最终得到本发明所述的γ-PGA高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)CGMCC No..2108。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养方法为:
(1)菌种的活化:接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108至斜面培养基,在28℃下培养48小时或在37℃下培养24小时;
(2)种子培养:在500ml灭菌的三角瓶内装100ml液体种子培养基,然后将活化的菌种接至种子培养基中,在37℃下、以215-220r/min的转数振荡培养24小时,制得种子液;
(3)发酵培养:以体积比3%的接种量将种子液接入发酵培养基中,37℃,215r-220r/min振荡培养48-60小时。
其中,所用到的培养基组成为:
(1)斜面培养基:葡萄糖20g/l,琼脂15g/l,马铃薯200g/l(制法为:将200g马铃薯去皮洗净,切成直径1厘米小块加水800ml,用500瓦的电炉煮沸20分钟,纱布过滤,再用去离子水补足至1000ml),pH自然;
(2)种子培养基:葡萄糖20-30g/l,酵母膏5-7g/l,谷氨酸钠20-30g/l,磷酸氢二钾2g/l,硫酸镁0.25g/l,pH=7;
(3)发酵培养基:葡萄糖40-60g/l,酵母膏5-9g/l,谷氨酸钠40-60g/l,磷酸氢二钾2-6g/l,硫酸镁0.25g/l,pH=7。
(三)有益效果
本发明提供的γ-PGA高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCCNO.2108是由购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的纳豆芽孢杆菌CICC10023经紫外诱变所得,原纳豆芽孢杆菌CICC 10023发酵生产γ-PGA的产量为10.2g/l,经过反复诱变筛选后,目前的γ-PGA高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC NO.2108的最高产量可达34.1g/l,较原菌株的产量有飞跃性的提高,且该菌株营养要求简单,传代稳定,高于目前报道的发酵生产γ-PGA的产量。
本发明所述的培养方法简便易行,所用培养基的原料来源广泛,价格低廉,有效降低了生产成本,适合大规模的工业化生产。
本发明所述的γ-PGA的高产菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)LX-3,该菌株已于2007年7月13日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,简称CGMCC,保藏编号为CGMCC No.2108。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1 γ-PGA高产菌株的诱变筛选
挑取出发菌株纳豆芽孢杆菌CICC 10023(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的单菌落,接入装有玻璃珠的无菌250ml三角瓶内,加入30毫升无菌水,在HZQ-X100摇床(尔滨东联电子公司)上以170r/min的转数振荡20min,将菌落打碎,制成菌悬液。将装有30ml菌悬液的平皿置于78-1磁力搅拌器(国华电器公司)上,用40瓦紫光灯分别照射1min、2min、3min,然后将三个不同照射剂量的菌悬液分别制成10-5和10-3的稀释液,涂板(发酵培养基固体平板的配方见技术方案部分),避光培养24小时,筛选出菌落形态特征发生改变的突变株。对上述突变体进行发酵检测,复筛高产菌株。
本发明依此方法诱变筛选得到高产突变体枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)CGMCC No.2108。经传代试验证明,在100代以内其生产性能稳定。
实施例2 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测
(1)菌种活化:挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上,斜面培养基成分为:马铃薯200g/l,葡萄糖20g/l,琼脂15g/l,pH值自然。将接种后的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时。
(2)种子培养:取活化好的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCCNo.2108一环接于种子培养基中(500ml三角瓶放100ml培养液),种子培养基成分为:葡萄糖20g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠20g/l,磷酸氢二钾2g/l,硫酸镁0.25g/l。将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
(3)发酵培养:将培养好的种子培养液取3ml接入发酵培养基中(500ml三角瓶装100ml发酵液),发酵培养基成分为:甘油40-60g/l,酵母膏5-9g/l,谷氨酸钠40-60g/l,磷酸氢二钾2g/l,硫酸镁0.25g/l。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
(4)γ-PGA产量的测定:取20ml发酵液放于500ml三角瓶中,加入已经在冰箱中放置过夜的冰无水乙醇40ml,震荡,直至有沉淀产生,将沉淀取出,放入50℃烘箱中烘烤12小时,取出称取重量。
检测结果:用以上培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为6.5g/l。
实施例3 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测
挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上,放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中,将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液取3ml接入发酵培养基中。其中,发酵培养基成分为:柠檬酸40-60g/l,其余组分同实施例2。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果:用以上培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为8.2g/l。
实施例4 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测
挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上,将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液接入发酵培养基中,发酵培养基成分为:葡萄糖40-60g/l,其余组分同实施例2。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果:用以上培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为26.5g/l。检测结果说明用葡萄糖作为碳源的培养方法最终获得的γ-PGA产量高。
实施例5 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测
(1)菌种活化:挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上,斜面培养基成分为:马铃薯200g/l,葡萄糖20g/l,琼脂15g/l,pH值自然。将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时。
(2)γ-PGA种子培养:取活化好的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环接于种子培养基中(500ml三角瓶放100ml培养液),种子培养基成分为:葡萄糖20g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠20g/l,磷酸氢二钾2g/l,硫酸镁0.25g/l。将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
(3)发酵培养:将培养好的种子培养液取3ml接入发酵培养基中(500ml三角瓶装100ml发酵液),发酵培养基成分为:葡萄糖50g/l,氯化铵5-9g/l,谷氨酸钠40g/l,磷酸氢二钾2g/l,硫酸镁0.25g/l。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
(4)γ-PGA产量的测定:取20ml发酵液放于500ml三角瓶中,加入已经在冰箱中放置过夜的冰无水乙醇40ml,震荡,直至有沉淀产生,将沉淀取出,放入50℃烘箱中烘烤12小时,取出称取重量。
检测结果:用氯化铵为氮源的培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为10.2g/l。
实施例6 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测
挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上,将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中,将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液接入发酵培养基中,发酵培养基成分为:硫酸铵5-9g/l,其余组分同实施例5。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果:用硫酸铵为氮源的培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为12.2g/l。
实施例7 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测
挑取枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108一环于斜面培养基上,将涂好的斜面放入恒温培养箱28℃培养48小时后取一环接于种子培养基中,将接种好的种子培养液放入37℃恒温摇床中218r/min培养24小时。
将培养好的种子培养液接入发酵培养基中,发酵培养基成分为:酵母膏5-9g/l,其余组分同实施例5。将接好的发酵培养基放入37℃恒温摇床上218r/min培养36-72小时。
检测结果:用酵母膏为氮源的培养基成分和培养方法发酵生产的γ-PGA产量为26.5g/l。检测结果说明用酵母膏为氮源的方法最终获得的γ-PGA产量高。
实施例8 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108的培养及γ-PGA检测
将发酵培养基中磷酸氢二钾调为2-6g/l,培养基其余成分和发酵工艺同实施例7。
检测结果:用提高磷酸氢二钾的培养基和培养方法发酵获得的γ-PGA产量为34.1g/l。
Claims (2)
1.一株产γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCC No.2108。
2.根据权利要求1所述菌株的培养方法为:
(1)菌种的活化:接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)CGMCCNo.2108至斜面培养基,在28℃下培养48小时或在37℃下培养24小时;所述斜面培养基的组成是葡萄糖20g/l、琼脂15g/l和马铃薯200g/l,pH自然;
(2)种子培养:在500ml灭菌的三角瓶内装100ml液体种子培养基,然后将活化的菌种接至种子培养基中,在37℃下、以215-220r/min的转数振荡培养24小时,制得种子液;所述种子培养基的组成是葡萄糖20-30g/l、酵母膏5-7g/l、谷氨酸钠20-30g/l、磷酸氢二钾2g/l和硫酸镁0.25g/l,pH=7;
(3)发酵培养:以体积比3%的接种量将种子液接入发酵培养基中,37℃,215-220r/min振荡培养48-60小时;所述发酵培养基的组成是葡萄糖40-60g/l、酵母膏5-9g/l、谷氨酸钠40-60g/l、磷酸氢二钾2-6g/l和硫酸镁0.25g/l,pH=7。
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