CN1908178B - 利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：1、菌种保藏；2、种子液的制备；3、使用摇瓶固体发酵法发酵种子液；4、γ-PGA的提取和纯化。本发明提供的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，可使γ-PGA的产量达到100g/kg培养基以上，纯化后的γ-PGA纯度达到95％以上，对于不同纯度的γ-PGA的生产成本在1.5万—3万/吨之间，大大低于采用现有技术的生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物高分子材料的生物发酵技术，具体的说，是涉及一种利用农副产品低成本固体发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
现有技术
γ-聚谷氨酸(γ-Poly-glutamic acid，PGA)是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基间的酰胺键结合而成的一种多功能生物可降解高分子材料。由于γ-PGA及其衍生物具有优良的水溶性和吸附性，能彻底被生物降解，对人和动物安全无毒，可以食用等优点，可作为保水剂、增稠剂、絮凝剂、重金属吸附剂、药物/肥料缓释剂及药物载体等，在农业、食品、医药、化妆品，环保，合成纤维和涂膜等领域具有广阔的应用前景(Shih and Van，2001)。随着化工合成材料造成的环境污染日益加重，开发生物可降解材料在一定程度上代替化学材料已成为整个国际社会的迫切需要。
聚谷氨酸的制备方法有化学合成、提取和微生物发酵三种方法。微生物发酵法比两种方法的生产成本低，生产过程对环境的污染小，所以现在主要采用微生物发酵法生产γ-PGA。国内外对γ-PGA的发酵生产工艺进行了广泛研究，主要以液体深层发酵为主。日本市九公司使用以液体培养的工艺生产γ-PGA，并用于化妆品原料(见国际化妆品配料术语汇编，美国化妆品工业协会编著)。台湾味丹总公司研发出高吸水效能的聚谷氨酸，计划在越南投产。南京工业大学筛选得一株γ-PGA高产菌株Bacillus subtilis NX-2，并对液体发酵生产γ-PGA做了较为全面的研究，改进了原有生产工艺并申请了专利。华中农业大学也进行了γ-PGA产生菌的筛选和工艺开发的工作，其菌种和液体生产工艺也已申请了专利。然而很多研究者发现(Ashiuchi et al.2001)，液体发酵生产γ-PGA存在许多问题：发酵过程中的发酵液粘度增大，氧气的供应不足，限制了微生物合成γ-PGA的能力，γ-PGA的产量有限，目前报道的最高产量为48g/L，发酵时间为96小时。液体发酵过程中出现大量泡沫，过程控制艰难，容易出现的培养液溢出细菌污染等情况的发生。而且，液体发酵普遍采用完全合成培养基发酵，原料成本高，直接导致了γ-PGA的高生产成本。
以农副产品为生产原料，采用固体发酵方式，通过分级超滤的生产工艺能够实现以低成本和简易工艺生产高纯度，不同分子量的γ-PGA。固体发酵是在湿性固态培养基中进行的生物反应。沙长青等人(2004)利用纳豆杆菌，以大豆为原料固体发酵生产γ-PGA，经过纯化后能够得到纯度为95％以上的γ-PGA。可见固体发酵生产γ-PGA的方法是十分可行的。但是直接用大豆为原料，菌体只能在大豆表面生长，只有大豆表面部分才能被利用作为γ-PGA合成的原料，显然原料使用率低。另外，大豆等农产品的价值也较高。如果能开发出一种以粉碎的农副产品为原料的生产γ-PGA的工艺，既能提高原料利用率，又可以将γ-PGA的生产成本降至最低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其采用固体发酵的方式以及分级超滤纯化的生产工艺，能够大幅降低γ-PGA成本，且其过程控制难度小，设备厂房等固定资产投入低，能耗消耗低。
为达到上述目的，本发明提供的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏：在富含营养的固体培养基斜面上于25-38℃培养，可于2-8℃短期保藏，
固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.种子液的制备：
2.1.将上述种子转入含富含营养的液体培养基的三角瓶中，25-38℃，150-250rpm培养3-10小时至对数生长中期；液体培养基的成分是蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.2.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖10-60克；蛋白胨0.5-20克；谷氨酸5-80克；柠檬酸4-30克，氯化铵2-30克；K2HPO4 0.1-4克；MgSO4·7H2O 0.1-4克；FeCl3·6H2O 0.01-1克；CaCl2·2H2O 0.05-4克；MnSO4·H2O 0.05-1克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前pH 5.5-8.0；250ml的三角摇瓶中分装50ml的培养基；并按0.1-10％的接种量将上述活化好的菌种转入，25-38℃下培养3-10小时至对数中期；
3.摇瓶固体发酵，
3.1发酵培养基：固体发酵培养基分包含固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.6-2.5。营养液成分为(g/L)：甘油5-80，柠檬酸7-40，谷氨酸5-80，氯化铵2-30，MgSO4·7H2O 0.1-1.0，FeCl3·6H2O 0.01-1，CaCl2·2H2O 0.05-0.2，MnSO4·H2O 0.01-0.4，K2HPO4·3H2O0.01-2.0，PH为5.5-8.0；用营养液调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前培养基湿度在50％以上；
3.2：发酵条件，摇瓶中装入步骤3.1得到的固体发酵培养基10-30g，种子液的接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物1-3次；
3.3：摇瓶内装入按要求配制的固体发酵培养基，充分混合后用纱布封口，100℃-121℃灭菌10-40分钟；将步骤2得到的种子液接入已灭菌的含固体发酵培养基的摇瓶中，充分混合；置恒温箱中静置培养，恒温箱中保持50％以上的湿度以防止培养基过度失水；每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体基中生长均匀。
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿、200,000道尔顿、20,000道尔顿、10,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；有必要时用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
本发明还提供一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏，
1.1.将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，可于2-8℃短期保藏，固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
1.2.以冷冻甘油管长期保藏，将培养好的γ-PGA产生菌移至无菌10-40％甘油保藏管中，40-80℃水浴处理5分钟以上，-20℃～-80℃冷冻保藏作为原始菌种；生产菌种需从原始菌种中转接；
2.种子液的制备；
2.1.将冷冻保藏的菌种接种于固体培养基的斜面上，25-38℃培养24-72小时；
2.2.将上述活化的种子转入含富含营养的液体培养基的三角瓶中，25-38℃，150-250rpm培养3-10小时至对数生长中期；液体培养基的成分为蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.3.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖10-60克；蛋白胨0.5-20克；谷氨酸5-80克；柠檬酸4-30克，氯化铵2-30克；K2HPO4 0.1-4克；MgSO4·7H2O 0.1-4克；FeCl3·6H2O 0.01-1克；CaCl2·2H2O 0.05-4克；MnSO4·H2O 0.05-1克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前pH 5.5-8.0；250ml的三角摇瓶中分装50ml的培养基。并按0.1-10％的接种量将上述活化好的菌种转入，25-38℃下培养3-10小时至对数中期；
3.摇瓶固体发酵，
3.1发酵培养基：固体发酵培养基分包含固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.6-2.5。营养液成分为(g/L)：甘油5-80，柠檬酸7-40，谷氨酸5-80，氯化铵2-30，MgSO4·7H2O 0.1-1.0，FeCl3·6H2O 0.01-1，CaCl2·2H2O 0.05-0.2，MnSO4·H2O 0.01-0.4，K2HPO4·3H2O0.01-2.0，pH 5.5-8.0；用营养液调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前培养基湿度在50％以上；
3.2.发酵条件，摇瓶中装入步骤3.1得到的固体发酵培养基10-30g，种子液的接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物1-3次；
3.3.摇瓶内装入按要求配制的固体发酵培养基，充分混合后用纱布封口，100℃-121℃灭菌10-40分钟；将步骤2得到的种子液接入已灭菌的含培养基的摇瓶中，充分混合；置恒温箱中静置培养，恒温箱中保持50％以上的湿度以防止培养基过度失水；每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体基中生长均匀；
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿、200,000道尔顿、20,000道尔顿、10,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；有必要时用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
本发明还提供一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏：在富含营养的固体培养基斜面上于25-38℃培养，可于2-8℃短期保藏，
固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.种子液的制备；
2.1.将上述种子转入含富含营养的液体培养基的三角瓶中，25-38℃，150-250rpm培养3-10小时至对数生长中期；液体培养基的成分是蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.2.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖10-60克；蛋白胨0.5-20克；谷氨酸5-80克；柠檬酸4-30克，氯化铵2-30克；K2HPO4 0.1-4克；MgSO4·7H2O 0.1-4克；FeCl3·6H2O 0.01-1克；CaCl2·2H2O 0.05-4克；MnSO4·H2O 0.05-1克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为5.5-8.0；250ml的三角摇瓶中分装50ml的培养基。并按0.1-10％的接种量将上述活化好的菌种转入，25-38℃下培养3-10小时至对数中期；
3.浅盘固体发酵
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.6-2.5；液料成分为(g/L)：甘油10-100，柠檬酸3-28，谷氨酸10-50，氯化铵7-30，MgSO4·7H2O 0.1-1.0，FeCl3·6H2O 0.01-0.1，CaCl2·2H2O 0.05-0.2，MnSO4·H2O 0.05-0.2，K2HPO4·3H2O0.1-1.0，PH为6.0-8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在50％-75％之间；
3.2.发酵条件：使用面积为0.2-1平方米的平底托盘或类似容器，装料固体发酵培养基厚度1-10cm，种子液的接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度30-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物；
3.3.将按要求配制的培养固体发酵培养基经充分混合，均匀的平铺于盘中，用多层纱布覆盖培养基，100℃-121℃灭菌10-40分钟；将上述步骤2得到的种子液接入已灭菌的固体发酵培养基中，经过充分混合后均匀地铺开，尽量保持厚度一致，再盖上湿润的无菌纱布；置恒温箱或洁净恒温培养室中静置培养，恒温箱中保持50％以上的湿度以防止培养基过度失水，必要时向纱布上喷无菌水保持培养基的湿度。每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体基中生长均匀。
步骤3.3可以为步骤3.4取代：将配制好的固体发酵培养基先放于其他容器中灭菌，灭完后在无菌环境中按要求分装入多个盘中。将上述步骤2得到的种子液接入已灭菌的固体发酵培养基中，经过充分混合后均匀地铺开，尽量保持厚度一致，再盖上湿润的无菌纱布。置恒温箱或洁净恒温培养室中静置培养，恒温箱中保持50％以上的湿度以防止培养基过度失水，有必要时可以向纱布上喷无菌水保持培养基的湿度。每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体基中生长均匀。
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿、200,000道尔顿、20,000道尔顿、10,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；有必要时用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
本发明还提供一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏，
1.1.将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，可于2-8℃短期保藏，固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，pH 5.5-8.5；
1.2.以冷冻甘油管长期保藏，将培养好的γ-PGA产生菌移至无菌10-40％甘油保藏管中，40-80℃水浴处理5分钟以上，-20℃～-80℃冷冻保藏作为原始菌种；生产菌种需从原始菌种中转接；
2.种子液的制备，
2.1.将冷冻保藏的菌种接种于固体培养基的斜面上，25-38℃培养24-72小时；
2.2.将上述活化的种子转入含液体培养基的瓶中，25-38℃，150-250rpm培养3-10小时至对数生长中期；液体培养基的成分为蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.3.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖10-60克；蛋白胨0.5-20克；谷氨酸5-80克；柠檬酸4-30克，氯化铵2-30克；K2HPO4 0.1-4克；MgSO4·7H2O 0.1-4克；FeCl3·6H2O 0.01-1克；CaCl2·2H2O 0.05-4克；MnSO4·H2O 0.05-1克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前pH 5.5-8.0；250ml的三角摇瓶中分装50ml的培养基；并按0.1-10％的接种量将上述活化好的菌种转入，25-38℃下培养3-10小时至对数中期；
3.浅盘固体发酵
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.6-2.5；液料成分为(g/L)：甘油10-100，柠檬酸3-28，谷氨酸10-50，氯化铵7-30，MgSO4·7H2O 0.1-1.0，FeCl3·6H2O 0.01-0.1，CaCl2·2H2O 0.05-0.2，MnSO4·H2O 0.05-0.2，K2HPO4·3H2O0.1-1.0，PH为6.0-8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在50％-75％之间；
3.2.发酵条件：使用面积为0.2-1平方米的平底托盘或类似容器，装料固体发酵培养基厚度1-10cm，种子液的接种量1％-10％(g/ml)，发酵温度30-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物；
3.3.将按要求配制的培养固体发酵培养基经充分混合，均匀的平铺于盘中，用多层纱布覆盖培养基，100℃-121℃灭菌10-40分钟；将上述步骤2得到的种子液接入已灭菌的固体发酵培养基中，经过充分混合后均匀地铺开，尽量保持厚度一致，再盖上湿润的无菌纱布；置恒温箱或洁净恒温培养室中静置培养，恒温箱中保持50％以上的湿度以防止培养基过度失水，必要时向纱布上喷无菌水保持培养基的湿度。每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体基中生长均匀。
步骤3.3可以为步骤3.4取代：将配制好的固体发酵培养基先放于其他容器中灭菌，灭完后在无菌环境中按要求分装入多个盘中。将上述步骤2得到的种子液接入已灭菌的固体发酵培养基中，经过充分混合后均匀地铺开，尽量保持厚度一致，再盖上湿润的无菌纱布。置恒温箱或洁净恒温培养室中静置培养，恒温箱中保持50％以上的湿度以防止培养基过度失水，有必要时可以向纱布上喷无菌水保持培养基的湿度。每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体基中生长均匀。
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿、200,000道尔顿、20,000道尔顿、10,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；有必要时用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
本发明还提供一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏：在富含营养的固体培养基斜面上于25-38℃培养，可于2-8℃短期保藏，
固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.种子液的制备；
2.1.将上述种子转入含富含营养的液体培养基的三角瓶中，25-38℃，150-250rpm培养3-10小时至对数生长中期；液体培养基的成分是蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.2.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖10-60克；蛋白胨0.5-20克；谷氨酸5-80克；柠檬酸4-30克，氯化铵2-30克；K2HPO4 0.1-4克；MgSO4·7H2O 0.1-4克；FeCl3·6H2O 0.01-1克；CaCl2·2H2O 0.05-4克；MnSO4·H2O 0.05-1克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为5.5-8.0；250ml的三角摇瓶中分装50ml的培养基；并按0.1-10％的接种量将上述活化好的菌种转入，25-38℃下培养3-10小时至对数中期；
3.固体发酵罐发酵：
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分为固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.4-3之间；液料成分为(g/L)：甘油15-100，柠檬酸5-40，谷氨酸10-50，氯化铵10-70，MgSO4·7H2O 0.05-2.0，FeCl3·6H2O 0.01-0.1，CaCl2·2H2O 0.05-0.5，MnSO4·H2O 0.05-0.4，K2HPO4·3H2O0.1-1.0，PH为5.5-8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在50％以上；
3.2.发酵条件：采用固体发酵罐，能实现温度、湿度和通气量的控制，可以自动翻动培养物，便于清洗，节约空间和减低劳动强度，适合大规模生产；装料厚度1-20cm，接种量0.5％-10％，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物；
3.3.将要求配制固体发酵培养基装入发酵罐，通蒸汽高压灭菌，100℃-121℃灭菌10-40分钟。将步骤2得到的种子液喷入已灭菌的固体发酵培养基中，充分混合。静置发酵，发酵罐中保持30％以上的湿度以防止培养基过度失水。每隔12-24小时用进行翻动培养物保证菌体在固体基中生长均匀。发酵结束后出料；
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整pH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿、200,000道尔顿、20,000道尔顿、10,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；有必要时用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
本发明还提供一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏：
1.1.将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，可于2-8℃短期保藏，固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％， NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，pH 5.5-8.5；
1.2.以冷冻甘油管长期保藏，将培养好的γ-PGA产生菌移至无菌10-40％甘油保藏管中，40-80℃水浴处理5分钟以上，-20℃～-80℃冷冻保藏作为原始菌种；生产菌种需从原始菌种中转接；
2.种子液的制备：
2.1.将冷冻保藏的菌种接种于固体培养基的斜面上，25-38℃培养24-72小时；
2.2.将上述活化的种子转入含液体培养基的瓶中，25-38℃，150-250rpm培养3-10小时至对数生长中期；液体培养基的成分为蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.3.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖10-60克；蛋白胨0.5-20克；谷氨酸5-80克；柠檬酸4-30克，氯化铵2-30克；K2HPO4 0.1-4克；MgSO4·7H2O 0.1-4克；FeCl3·6H2O 0.01-1克；CaCl2·2H2O 0.05-4克；MnSO4·H2O 0.05-1克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为5.5-8.0；250ml的三角摇瓶中分装50ml的培养基。并按0.1-10％的接种量将上述活化好的菌种转入，25-38℃下培养3-10小时至对数中期；
3.固体发酵罐发酵：
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分为固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.4-3之间；液料成分为(g/L)：甘油15-100，柠檬酸5-40，谷氨酸10-50，氯化铵10-70，MgSO4·7H2O 0.05-2.0，FeCl3·6H2O 0.01-0.1，CaCl2·2H2O 0.05-0.5，MnSO4·H2O 0.05-0.4，K2HPO4·3H2O0.1-1.0，PH为5.5-8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在50％以上；
3.2.发酵条件：采用固体发酵罐，能实现温度、湿度和通气量的控制，可以自动翻动培养物，便于清洗，节约空间和减低劳动强度，适合大规模生产；装料厚度1-20cm，接种量0.5％-10％，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物；
3.3.将要求配制固体发酵培养基装入发酵罐，通蒸汽高压灭菌，100℃-121℃灭菌10-40分钟。将步骤2得到的种子液喷入已灭菌的固体发酵培养基中，充分混合。静置发酵，发酵罐中保持30％以上的湿度以防止培养基过度失水。每隔12-24小时用进行翻动培养物保证菌体在固体基中生长均匀。发酵结束后出料。
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿、200,000道尔顿、20,000道尔顿、10,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；有必要时用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
本发明使γ-PGA的产量达到100g/kg培养基以上，纯化后的γ-PGA纯度达到95％以上，对于不同纯度的γ-PGA的生产成本在1.5万-3万/吨之间，大大低于采用现有技术的生产成本。
具体实施方式
实施例一：摇瓶固体发酵法生产γ-PGA
将冷冻保藏的γ-PGA产生菌的菌种接种于固体培养基的斜面上，28℃培养24小时；将上述活化的种子转入含液体培养基(蛋白胨0.5％，酵母抽提物0.1％，NaCl 3％，PH为6.0)的三角瓶中，28℃，200rpm培养3小时至对数生长中期；之前按照每1升培养基的加入量配制种子培养基：谷氨酸15克；葡萄糖40克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO4 0.5克；MgSO4·7H2O0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克，蛋白胨10克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为7.0-7.5；按50ml的装液量分装于250ml的三角摇瓶中。按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，37℃下培养3小时至对数中期。
配制固体发酵培养基，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8。液料成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，NH4Cl 30，MgSO4·7H2O1.0，FeCl3·6H2O 0.10，CaCl2·2H2O 0.20，MnSO4·H2O 0.20，K2HPO4·3H2O 1.0，PH为8.0。用营养液调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在75％。将相当于10g的培养基分装于250ml三角摇瓶内，充分混合后用8层纱布封口，121℃灭菌30分钟。灭菌后按接种量1％将种子液转入固体发酵培养基中，充分混合。置恒温箱中28℃静置培养30小时，恒温箱中保持90％的湿度。
发酵结束后，收集培养物，加入5倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡混匀60分钟。过滤出浸提液，滤渣再进行一次浸提，过滤出浸提液，重复3次，合并各次的浸提液。将浸提液调整PH至3，以10000rpm离心30分钟，收集上层聚谷氨酸溶液。用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液。加入3倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀。沉淀经过-30℃冷冻干燥后，装入密封容器中，放在干燥器中保存。经检测γ-PGA的产量达到121g/kg固体成分，纯度为95.2％，估计成本为2.6万/吨。
实施例二：平底盘固体发酵法生产γ-PGA
将冷冻保藏的γ-PGA产生菌的菌种接种于富含营养的固体培养基的斜面上，28℃培养24小时；将上述活化的种子转入含富含营养的液体培养基(蛋白胨1.0％，酵母抽提物0.5％，NaCl 1.0％，PH为7.0-7.5)的三角瓶中，28℃，200rpm培养3小时至对数生长中期；之前按照每1升培养基的加入量配制种子培养基：谷氨酸15克；葡萄糖40克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O0.104克，蛋白胨10克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为7.0-7.5；按50ml的装液量分装于250ml的三角摇瓶中。按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，28℃下培养8小时至对数中期。
配制固体发酵培养基，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8。液料成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，NH4Cl 30，MgSO4·7H2O1.0，FeCl3·6H2O 0.1，CaCl2·2H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 1.0，PH为8.0。用营养液调整培养基的湿度，使灭菌前湿度在75％。将培养基均匀的平铺于盘中，用二层纱布覆盖培养基，121℃灭菌30分钟。活化好的种子液接入已灭菌的固体培养基中，经过充分混合后均匀地铺开，尽量保持厚度一致，再盖上湿润的无菌纱布。将平盘置恒温箱或洁净恒温培养室中静置培养，恒温箱中保持90％湿度，每隔6小时向纱布上喷无菌水保持培养基的湿度。
发酵结束后，收集固体基，加入5倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡数分钟后，在振荡器上或用搅拌器混匀60分钟。用双层纱布过滤出浸提液，滤渣再进行一次浸提，过滤出浸提液，重复3次，合并各次的浸提液。将浸提液调整pH至3，以10000rpm离心30分钟，收集上层聚谷氨酸溶液。用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液。加入3倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀。沉淀经过-30℃冷冻干燥后，装入密封容器中，放在干燥器中保存。经检测γ-PGA的产量达到119g/kg培养基，纯度为96.1％，估计成本为2.1万/吨。
实施例三：固体发酵罐发酵法生产γ-PGA
将冷冻保藏的γ-PGA产生菌的菌种接种于富含营养的固体培养基的斜面上，28℃培养24小时；将上述活化的种子转入含富含营养的液体培养基(蛋白胨1.0％，酵母抽提物0.5％，NaCl 1.0％，PH为7.0-7.5)的三角瓶中，28℃，200rpm培养6小时至对数生长中期；之前按照每1升培养基的加入量配制种子培养基：谷氨酸15克；葡萄糖40克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O 0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O0.104克，蛋白胨10克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为7.0-7.5；按50ml的装液量分装于250ml的三角摇瓶中。按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，37℃下培养8小时至对数中期。
配制固体发酵培养基，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8。液料成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，NH4Cl 30，MgSO4·7H2O1.0，FeCl3·6H2O 0.10，CaCl2·2H2O 0.20，MnSO4·H2O 0.20，K2HPO4·3H2O 1.0，PH为8.0。用营养液调整培养基的湿度，使灭菌前湿度在75％。将配好的培养基装入发酵罐，装料厚度10cm，通蒸汽高压灭菌121℃灭菌30分钟，按0.5％的接种量将种子液喷入已灭菌的培养基中，充分混合，发酵温度28℃，发酵时间30小时左右。发酵罐中保持90％的湿度，发酵结束后出料。
发酵结束后，收集培养物，加入5倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡混匀，过滤出浸提液，滤渣再进行一次浸提，过滤出浸提液，重复3次，合并各次的浸提液。将浸提液调整PH至3，以10000rpm离心30分钟，收集上层聚谷氨酸溶液。用不同孔径(截留分子量2,000,000道尔顿、1,000,000道尔顿、500,000道尔顿、300,000道尔顿等)的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液。加入3倍的冷乙醇或甲醇等有机溶剂至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀。沉淀经过-30℃冷冻干燥后，装入密封容器中，放在干燥器中保存。经检测γ-PGA的产量达到131g/kg培养基，纯度为95.2％，估计成本为18.2万/吨。
γ-PGA的应用范围很广，在医药，食品，农业，环保，化妆品，合成塑料纤维和涂膜，油漆等方面都有应用。本发明使γ-PGA的产量达到100g/kg培养基以上，纯化后的γ-PGA纯度达到95％以上，对于不同纯度的γ-PGA的生产成本在1.5万-3万/吨之间，大大低于采用现有技术的生产成本。
Claims (16)
1.一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏：将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，于2-8℃短期保藏，
固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.种子液的制备：
2.1.将上述种子转入含液体培养基的瓶中，在28℃，200rpm培养3小时至对数生长中期；液体培养基的成分是蛋白胨0.5％，酵母抽提物0.1％，NaCl 3％，PH为6.0；
2.2.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖40克；蛋白胨10克；谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO4 0.5克；MgSO4·7H2O0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH为7.0-7.5；250ml的摇瓶中分装50ml的培养基；并按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，37℃下培养3小时至对数中期；
3.摇瓶固体发酵：
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分包含固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8；营养液成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，氯化铵30，MgSO4·7H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.10，CaCl2·2H2O 0.20，MnSO4·H2O 0.20，K2HPO4·3H2O 1.0，pH 8.0；用营养液调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前固体发酵培养基湿度在75％；
3.2.发酵条件，摇瓶中装入步骤3.1得到的固体发酵培养基10-30g，种子液的接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物1-3次；
3.3.摇瓶内装入按要求配制的固体发酵培养基，充分混合后用纱布封口，100℃-121℃灭菌10-40分钟；将步骤2得到的种子液接入已灭菌的含培养基的摇瓶中，充分混合；置恒温箱中静置培养，恒温箱中保持90％的湿度以防止培养基过度失水；每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体发酵培养基中生长均匀；
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
2.如权利要求1所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤4.4中，孔径的截留分子量为2,000,000道尔顿，或者1,000,000道尔顿，或500,000道尔顿，或300,000道尔顿，或200,000道尔顿，或20,000道尔顿，或10,000道尔顿。
3.一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏，
1.1.将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，于2-8℃短期保藏，固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
1.2.以冷冻甘油管长期保藏，将培养好的γ-PGA产生菌移至无菌10-40％甘油保藏管中，40-80℃水浴处理5分钟以上，-20℃～-80℃冷冻保藏作为原始菌种；生产菌种需从原始菌种中转接；
2.种子液的制备，
2.1.将冷冻保藏的菌种接种于固体培养基的斜面上，28℃培养24小时；
2.2.将上述活化的种子转入含液体培养基的瓶中，28℃，200rpm培养3小时至对数生长中期；液体培养基的成分为蛋白胨0.5％，酵母抽提物0.1％，NaCl 3％，PH为6.0；
2.3.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖40克；蛋白胨10克；谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO4 0.5克；MgSO4·7H2O0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH7.0-7.5；250ml的摇瓶中分装50ml的培养基；并按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，37℃下培养3小时至对数中期；
3.摇瓶固体发酵，
3.1发酵培养基：固体发酵培养基分包含固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8；营养液成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，氯化铵30，MgSO4·7H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.10，CaCl2·2H2O 0.20，MnSO4·H2O 0.20，K2HPO4·3H2O 1.0，PH 8.0；用营养液调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前培养基湿度在75％；
3.2.发酵条件，摇瓶中装入步骤3.1得到的固体发酵培养基10-30g，种子液的接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物1-3次；
3.3.摇瓶内装入按要求配制的固体发酵培养基，充分混合后用纱布封口，100℃-121℃灭菌10-40分钟；将步骤2得到的种子液接入已灭菌的含培养基的摇瓶中，充分混合；置恒温箱中静置培养，恒温箱中保持90％的湿度以防止培养基过度失水；每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体发酵培养基中生长均匀；
4.γ-PGA的提取和纯化，
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA 溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
4.如权利要求3所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤4.4中，孔径的截留分子量为2,000,000道尔顿，或者1,000,000道尔顿，或500,000道尔顿，或300,000道尔顿，或200,000道尔顿，或20,000道尔顿或10,000道尔顿。
5.一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏：γ-聚谷氨酸产生菌在固体培养基斜面上于28℃培养，于2-8℃短期保藏，
固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
2.种子液的制备；
2.1.将上述种子转入含液体培养基的三角瓶中，28℃，200rpm培养3小时至对数生长中期；液体培养基的成分是蛋白胨1.0％，酵母抽提物0.5％，NaCl 1.0％，PH为7.0-7.5；
2.2.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖40克；蛋白胨10克；谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO4 0.5克；MgSO4·7H2O0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH7.0-7.5；250ml的摇瓶中分装50ml的培养基；并按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，28℃下培养8小时至对数中期；
3.浅盘固体发酵
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8；液料成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，氯化铵30，MgSO4·7H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.1，CaCl2·2H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 1.0，PH为8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在75％之间；
3.2.发酵条件：使用面积为0.2-1平方米的平底托盘，装料固体发酵培养基厚度1-10cm，种子液接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度30-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物；
3.3.将按要求配制的培养固体发酵培养基经充分混合，进行灭菌，将上述步骤2得到的种子液接入已灭菌的固体发酵培养基中，经过充分混合后均匀地铺开，尽量保持厚度一致，再盖上湿润的无菌纱布；置恒温箱或洁净恒温培养室中静置培养，恒温箱中保持90％的湿度以防止培养基过度失水，向纱布上喷无菌水保持培养基的湿度；每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体发酵培养基中生长均匀；
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
6.如权利要求5所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤4.4中，孔径的截留分子量为2,000,000道尔顿，或者1,000,000道尔顿，或500,000道尔顿，或300,000道尔顿，或200,000道尔顿，或20,000道尔顿或10,000道尔顿。
7.如权利要求5所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤3.3中，灭菌的步骤是：将充分混合好的培养固体发酵培养基均匀的平铺于盘中，用多层纱布覆盖培养基，100℃-121℃灭菌10-40分钟。
8.如权利要求5所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤3.3中，灭菌的步骤是：将配制好的固体发酵培养基先放于其他容器中灭菌，灭完后在无菌环境中按要求分装入多个盘中。
9.一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏，
1.1.将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，于2-8℃短期保藏，固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH为5.5-8.5；
1.2.以冷冻甘油管长期保藏，将培养好的γ-PGA产生菌移至无菌10-40％甘油保藏管中，40-80℃水浴处理5分钟以上，-20℃～-80℃冷冻保藏作为原始菌种；生产菌种需从原始菌种中转接；
2.种子液的制备，
2.1.将冷冻保藏的菌种接种于固体培养基的斜面上，28℃培养24小时；
2.2.将上述活化的种子转入含液体培养基的瓶中，28℃，200rpm培养3小时至对数生长中期；液体培养基的成分为蛋白胨1.0％，酵母抽提物0.5％，NaCl 1.0％，PH 7.0-7.5；
2.3.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖40克；蛋白胨10克；谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH 7.0-7.5；250ml的摇瓶中分装50ml的培养基；并按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，28℃下培养8小时至对数中期；
3.浅盘固体发酵
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分固体成分和营养液两部分，固体成 分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8；液料成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，氯化铵30，MgSO4·7H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.1，CaCl2·2H2O0.2，MnSO4·H2O 0.2，K2HPO4·3H2O 1.0，PH 8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在75％；
3.2.发酵条件：使用面积为0.2-1平方米的平底托盘，装料固体发酵培养基厚度1-10cm，种子液的接种量为1％-10％(ml/g)，发酵温度30-45℃，发酵时间24-72小时，发酵过程中翻动培养物；
3.3.将按要求配制的培养固体发酵培养基经充分混合，进行灭菌，将上述步骤2得到的种子液接入已灭菌的固体发酵培养基中，经过充分混合后均匀地铺开，尽量保持厚度一致，再盖上湿润的无菌纱布；置恒温箱或洁净恒温培养室中静置培养，恒温箱中保持90％的湿度以防止培养基过度失水，向纱布上喷无菌水保持培养基的湿度；每隔12-24小时翻动培养物，保证菌体在固体发酵培养基中生长均匀；
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后能得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
10.如权利要求9所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤4.4中，孔径的截留分子量为2,000,000道尔顿，或者1,000,000道尔顿，或500,000道尔顿，或300,000道尔顿，或200,000 道尔顿，或20,000道尔顿，或10,000道尔顿。
11.如权利要求9所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤3.3中，灭菌的步骤是：将充分混合好的培养固体发酵培养基均匀的平铺于盘中，用多层纱布覆盖培养基，100℃-121℃灭菌10-40分钟。
12.如权利要求9所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤3.3中，灭菌的步骤是：将配制好的固体发酵培养基先放于其他容器中灭菌，灭完后在无菌环境中按要求分装入多个盘中。
13.一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏：将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，于2-8℃短期保藏，
固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH 5.5-8.5；
2.种子液的制备：
2.1.将上述种子转入含液体培养基的瓶中，在28℃，200rpm培养6小时至对数生长中期；液体培养基的成分是蛋白胨1.0％，酵母抽提物0.5％，NaCl 1.0％，PH 7.0-7.5；
2.2.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖40克；蛋白胨10克；谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH 7.0-7.5；250ml的摇瓶中分装50ml的培养基；并按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，37℃下培养8小时至对数中期；
3.固体发酵罐发酵：
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分为固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8；液料成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，氯化铵30，MgSO4·7H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.10， CaCl2·2H2O 0.20，MnSO4·H2O 0.20，K2HPO4·3H2O 1.0，PH 8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在75％；
3.2.发酵条件：采用固体发酵罐，能实现温度、湿度和通气量的控制，自动翻动培养物，便于清洗，节约空间和减低劳动强度，适合大规模生产；装料厚度1-20cm，接种量0.5％-10％，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时；
3.3.将要求配制固体发酵培养基装入发酵罐，通蒸汽高压灭菌，100℃-121℃灭菌10-40分钟；将步骤2得到的种子液喷入已灭菌的固体发酵培养基中，充分混合；静置发酵，发酵罐中保持90％的湿度以防止培养基过度失水；每隔12-24小时用进行翻动培养物保证菌体在固体发酵培养基中生长均匀；发酵结束后出料；
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
14.如权利要求13所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤4.4中，孔径的截留分子量为2,000,000道尔顿，或者1,000,000道尔顿，或500,000道尔顿，或300,000道尔顿，或200,000道尔顿，或20,000道尔顿，或10,000道尔顿。
15.一种利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其包含以下步骤：
1.菌种的保藏，
1.1.将能产生γ-PGA的微生物的菌种在固体培养基斜面上于25-38℃培养，于2-8℃短期保藏，固体培养基的成分包含：蛋白胨0.5-1.0％，酵母粉0.1-1％，NaCl 0.1-5％，琼脂1-2％，PH 5.5-8.5；
1.2.以冷冻甘油管长期保藏，将培养好的γ-PGA产生菌移至无菌10-40％甘油保藏管中，40-80℃水浴处理5分钟以上，-20℃～-80℃冷冻保藏作为原始菌种；生产菌种需从原始菌种中转接；
2.种子液的制备，
2.1.将冷冻保藏的菌种接种于固体培养基的斜面上，28℃培养24小时；
2.2.将上述活化的种子转入含液体培养基的瓶中，28℃，200rpm培养6小时至对数生长中期；液体培养基的成分为蛋白胨1.0％，酵母抽提物0.5％，NaCl 1.0％，PH 7.0-7.5；
2.3.按照每升培养基的加入量配制种子培养基：葡萄糖40克；蛋白胨10克；谷氨酸15克；柠檬酸10克，氯化铵7克；K2HPO40.5克；MgSO4·7H2O0.5克；FeCl3·6H2O 0.04克；CaCl2·2H2O 0.5克；MnSO4·H2O 0.104克；补充蒸馏水至1000ml，灭菌前PH 7.0-7.5；250ml的摇瓶中分装50ml的培养基；并按1％的接种量将上述活化好的菌种转入，37℃下培养8小时至对数中期；
3.固体发酵罐发酵：
3.1.发酵培养基：固体发酵培养基分为固体成分和营养液两部分，固体成分为黄豆饼粉和麸皮，它们的质量比为0.8；液料成分为(g/L)：甘油80，柠檬酸28，谷氨酸50，氯化铵30，MgSO4·7H2O 1.0，FeCl3·6H2O 0.10，CaCl2·2H2O 0.20，MnSO4·H2O 0.20，K2HPO4·3H2O 1.0，PH 8.0；用液料调整固体发酵培养基的湿度，使灭菌前湿度在75％；
3.2.发酵条件：采用固体发酵罐，能实现温度、湿度和通气量的控制，自动翻动培养物，便于清洗，节约空间和减低劳动强度，适合大规模生产；装料厚度1-20cm，接种量0.5％-10％，发酵温度25-45℃，发酵时间24-72小时；
3.3.将要求配制固体发酵培养基装入发酵罐，通蒸汽高压灭菌，100℃ -121℃灭菌10-40分钟；将步骤2得到的种子液喷入已灭菌的固体发酵培养基中，充分混合；静置发酵，发酵罐中保持90％的湿度以防止培养基过度失水；每隔12-24小时用进行翻动培养物保证菌体在固体发酵培养基中生长均匀；发酵结束后出料；
4.γ-PGA的提取和纯化
4.1.提取：收集发酵好的培养物，加入5-20倍的蒸馏水或生理盐水，充分混合，浸泡后混匀；
4.2.过滤：过滤出浸提液，滤渣再按步骤4.1的方式浸提，过滤出浸提液，重复2-4次；且合并各次的浸提液；
4.3.离心：将浸提液调整PH至2-8，以5000-15000rpm离心5-80分钟，收集上层聚谷氨酸溶液；
4.4.超滤：用不同孔径的超滤膜进行超滤，得到不同分子量分布的γ-PGA溶液；
4.5.有机溶剂沉淀：加入2-5倍的冷乙醇或甲醇至γ-PGA溶液中，放置过夜，收集沉淀；用蒸馏水溶解沉淀，再用有机溶剂沉淀，经过多次反复后得到高纯度γ-PGA；
4.6.冷冻干燥：沉淀经过冷冻干燥后密封在干燥器中保存，防止吸水。
16.如权利要求15所述的利用农副产品固体发酵低成本生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，步骤4.4中，孔径的截留分子量为2,000,000道尔顿，或1,000,000道尔顿，或500,000道尔顿，或者300,000道尔顿，或者200,000道尔顿，或20,000道尔顿，或10,000道尔顿。
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