CN101880703B - 一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，在发酵罐培养过程中，通过流加5.0％的癸酸钾溶液或10.0％的癸酸钠溶液或8.0％的癸酸铵溶液补料生产达托霉素，即以这几种癸酸盐作为发酵达托霉素的前体物。本发明的优点在于：本发明在拓宽了发酵达托霉素路径的同时，因几种前体物不仅对细胞的毒性较小，且其在常温下能够以液体的形式存在，不会因温度低而易产生结晶，从而保证了流加的效果。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种微生物发酵方法，尤其涉及一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法。
【背景技术】
随着抗生素在临床上的广泛应用，细菌耐药性问题日趋严重，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)、耐大环内酯革兰氏阳性菌和其他革兰氏阳性致病菌感染一样，正呈惊人的上升趋势。以万古霉素为代表的糖肽类抗生素对几乎所有的革兰氏阳性(G+)细菌有抗菌作用，应用于严重的G+细菌及耐药菌的感染，万古霉素是对付这类难治性疾病的最后防线。但是随着20世纪80年代VRE的出现，糖肽耐药性肠球菌不断增多。甚至出现了糖肽耐药基因从肠球菌向其他细菌转移的现象，由于缺乏有效治疗糖肽耐药菌感染的药物，糖肽耐药性细菌的感染已成为威胁人类生存和健康的一大难题。研制和开发对付这些耐药菌的抗生素迫在眉睫，目前已有多种抗生素已经开发或正在开发中，其中一种是美国Cubist制药公司开发的环脂肽类药物“达托霉素”。
达托霉素是从玫瑰孢链霉菌发酵液中提取得到的一个环脂肽类物质，它由连接到一个环状13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸酰基侧链构成。达托霉素具有新颖的化学结构，其作用模式独特：可扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀灭细菌的目的。
达托霉素(daptomycin)最早由礼来公司于二十世纪80年代发现，1997年Cubist制药公司受让获得全球范围的开发权，2003年9月在美国首次上市用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。2006年美国食品药品管理局(FDA)经优先审批程序批准了达托霉素的一项补充新药申请，即1日1次静脉内给药治疗金黄色葡萄球菌血液感染，包括由对甲氧西林敏感和耐药金黄色葡萄球菌引起的右侧心内膜炎。
临床研究证实达托霉素与苯唑西林、萘夫西林钠法疗效相当，即：对临床可评价患者，达托霉素治疗的临床成功率为83.4％，而对照药物的相应值是84.2％。且在临床研究中极少致使病原菌产生耐药性。
达托霉素可以通过玫瑰孢链霉菌NRRL11379(ATCC31568)、NRRL15998及其它突变菌株、基因重组菌生产。我所已于1999年筛选到达托霉素产生菌FW99608，并对FW99608的发酵工艺条件进行了详细的研究。已尝试对该菌种进行紫外辐射、NTG诱变、离子束辐射等选育工作。通过菌种诱变选育及发酵条件优化取得了较好的效果，其中突变株mut1208遗传性状稳定、产量最高。美国专利US4331594和US4800157最先提到利用深层发酵法生产达托霉素。美国专利US4885243提到通过将癸酸溶解于油酸甲酯然后添加到发酵液中生产达托霉素的方法。由于癸酸对细胞具有毒性，而且其在常温下是呈固体状。所以必须通过溶剂溶解后再由补料的方式流加。一般采用油酸甲酯、乙醇等溶解癸酸，但是溶解在油酸甲酯或乙醇中的癸酸仍然对细胞具有较大毒性，并且温度低时容易结晶析出，影响流加效果。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，在拓宽了发酵达托霉素路径的同时，保证了流加的效果。
本发明是通过以下几种技术方案解决上述技术问题的：
技术方案之一
一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，包括发酵培养，在发酵培养12～36h后，于每升发酵液中以1.0～3.0ml//h的流速往发酵罐中补料流加5.0％的癸酸钾溶液，直至发酵结束。
技术方案之二
一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，包括发酵培养，在发酵培养12～36h后，于每升发酵液中以0.5～1.5ml//h的流速往发酵罐中补料流加10.0％的癸酸钠溶液，直至发酵结束。
技术方案之三
一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，包括发酵培养，在发酵培养12～36h后，于每升发酵液中以1.0～2.0ml//h的流速往发酵罐中补料流加8.0％的癸酸铵溶液，直至发酵结束。
本发明一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法的有益效果在于：在拓宽了发酵达托霉素路径的同时，因几种前体物不仅对细胞的毒性较小，且其在常温下能够以液体的形式存在，不会因温度低而易产生结晶，从而保证了流加的效果。
【具体实施方式】
本发明通过玫瑰孢链霉菌的突变株mut1208发酵生产达托霉素，一般先将玫瑰孢链霉菌mut1208制成15％得甘油菌悬液，并于-20℃下长期保藏以待生产所需。
实施例1
流加癸酸钾作为前体物发酵达托霉素
(1)摇瓶培养
表1摇瓶培养基配方
| 培养基组分 | 含量(％) |
| 胰酶大豆肉汤 | 3.0 |
| 马铃薯淀粉 | 3.0 |
| 去离子水 | 94.0 |
于250ml三角瓶中盛装按表1配方配制的培养基30ml，装好后用蒸汽灭菌，冷却至30℃时往每瓶中接种0.5ml孢子悬液，摇床转速为220rpm，培养温度30℃，培养时间24h。
(2)种子罐培养
在10L的种子罐中，按表2配方配制7L培养基，培养基灭菌后，待温度降至30℃时接入已摇好的摇瓶孢子悬液，接种量2％左右，培养温度30±1℃，罐压0.03-0.05MPa，空气流量1：1vvm，搅拌转速300～400rpm，并保证发酵过程高峰期溶氧不低于20％，培养时间28～36h，发酵过程PH值通过流加氨水来控制，PH值控制在6.5-7.0之间。
表2种子罐培养基配方
| 培养基组分 | 含量(％) |
| 黄豆饼粉 | 1.0 |
| 酵母粉 | 0.5 |
| 马铃薯淀粉 | 3.0 |
| 葡萄糖 | 1.0 |
| 糖蜜 | 0.5 |
| (NH4)2SO4·FeSO4·6H2O | 0.04 |
| K2SO4 | 0.1 |
| 消泡剂 | 0.02 |
| 去离子水 | 93.84 |
(3)发酵罐培养
在100L发酵罐中，按表3配方配制70L培养基，培养基灭菌后，待温度降至30℃，且种子液菌容达到30％左右(即种子约生长36h)时，把种子罐中已培养好的种子移入100L发酵罐中，移种量10％左右，培养温度30±1℃，罐压0.03-0.05MPa，空气流量1：1vvm，搅拌转速200～400rpm，在发酵过程可用浓氨水调节pH值，使其不低于6.5，且保证发酵高峰期溶氧不低于20％，在培养28h左右，开始在每升发酵液中以1.0～3.0ml//h的流速往发酵罐中补料流加5.0％的癸酸钾溶液，直至发酵结束。一般在140h左右，总糖达到0.5以下，菌丝自溶，发酵液的pH值开始快速上升，此时发酵液中达托霉素效价达到1200U/ml。
表3发酵罐培养基配方
| 培养基组分 | 含量(％) |
| 花生饼粉 | 2.0 |
| 黄豆饼粉 | 0.5 |
| 马铃薯淀粉 | 5.0 |
| 糖蜜 | 0.5 |
| (NH4)2SO4·FeSO4·6H2O | 0.04 |
| K2SO4 | 0.1 |
| 消泡剂 | 0.02 |
| 自来水 | 91.84 |
为了简化说明并便于比较本发明各实施例的相异处，在以下另外几个实施例的说明中，仅针对相异处进行说明，而不再对相同处作重复赘述。
实施例2
流加癸酸钠作为前体物发酵达托霉素
较之实施例1，本实施例的不同之处在于：在发酵罐培养过程中，在培养28h左右，开始在每升发酵液中以0.5～1.5ml//h的流速往发酵罐中补料流加10.0％的癸酸钠溶液，直至发酵结束，且一般在120h左右，总糖达到0.5以下，菌丝自溶，发酵液的pH值开始快速上升，此时发酵液中达托霉素效价达到1000U/ml。
实施例3
流加癸酸铵作为前体物发酵达托霉素
较之实施例1，本实施例的不同之处在于：在发酵罐培养过程中，在培养28h左右，开始在每升发酵液中以1.0～2.0ml//h的流速往发酵罐中补料流加8.0％的癸酸铵溶液，直至发酵结束，且一般在160h左右，总糖达到0.5以下，菌丝自溶，发酵液的pH值开始快速上升，此时发酵液中达托霉素效价达到1700U/ml左右。
另外，本发明不仅适用于小罐发酵达托霉素，而且还适用于大罐发酵达托霉素。
综上，本发明以5.0％的癸酸钾溶液或10.0％的癸酸钠溶液或8.0％的癸酸铵溶液作为发酵达托霉素的前体物，拓宽了发酵达托霉素的路径，且本发明中的几种前体物不仅对细胞的毒性较小，而且因其在常温下能够以液体的形式存在，不会因温度低而易产生结晶，从而保证了流加的效果。
Claims (3)
1.一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，包括发酵培养，其特征在于：在发酵培养12～36h后，于每升发酵液中以1.0～3.0ml//h的流速往发酵罐中补料流加5.0％的癸酸钾溶液，直至发酵结束。
2.一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，包括发酵培养，其特征在于：在发酵培养12～36h后，于每升发酵液中以0.5～1.5ml//h的流速往发酵罐中补料流加10.0％的癸酸钠溶液，直至发酵结束。
3.一种流加癸酸盐发酵达托霉素的方法，包括发酵培养，其特征在于：在发酵培养12～36h后，于每升发酵液中以1.0～2.0ml//h的流速往发酵罐中补料流加8.0％的癸酸铵溶液，直至发酵结束。
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