CN101603066B

CN101603066B - 一种阿卡波糖的制备方法

Info

Publication number: CN101603066B
Application number: CN 200810038903
Authority: CN
Inventors: 胡海峰; 张琴
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2008-06-13
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2028-06-13
Also published as: CN101603066A

Abstract

本发明公开了一种阿卡波糖的制备方法，其包含下述步骤：(1)将游动放线菌斜面接种于斜面培养基进行斜面培养；(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基进行种子培养；(3)发酵罐培养，在培养过程中向发酵培养基中流加葡萄糖和麦芽糖；其特征在于：步骤(3)中还流加氮源，控制流加氮源后培养基中氨基氮的含量小于或等于0.15mg/ml，但不包括0mg/ml。本发明克服现有技术中杂质C组分难分离的缺陷，在发酵过程中补入氮源，并控制氮源的含量，能在大幅提高阿卡波糖的产量的同时降低杂质C的形成。

Description

一种阿卡波糖的制备方法

技术领域

本发明涉及一种α-葡糖苷酶抑制剂活性成分的制备方法，尤其涉及一种阿卡波糖的制备方法。

背景技术

阿卡波糖(acarbose)是有效的α-葡糖苷酶抑制剂，其分子结构见下式1，临床上广泛用于治疗非胰岛素依赖的II型糖尿病。阿卡波糖的发酵生产必须优化发酵条件来提高发酵单位，降低成本。但是游动放线菌(Actinoplanessp.)发酵生产的同时，生成一系列的同分异构体：组分A、B、C、D、E、F、G和H(欧洲药典5.1P2873-2874)。欧洲药典明确规定杂质的限度：组分A＜0.6％，B＜0.5％，C＜1.5％，D＜1.0％，E＜0.2％，F＜0.3％，G＜0.3％，H＜0.2％，别的杂质均小于0.2％。其中杂质A组分和C组分(如式2)的高压液相检测其保留时间与阿卡波糖十分接近，在提取过程中很难分离。因此在发酵过程中，提高发酵单位的同时控制杂质A组分和C组分的含量变得尤为重要。

式1

式2

对用游动放线菌生产阿卡波糖的研究表明，葡萄糖和麦芽糖为它的前体。其中葡萄糖不仅是阿卡波糖的前体，还是整个发酵过程的能量来源。因此发酵培养2天后开始流加葡萄糖和麦芽糖。但高浓度葡萄糖会对游动放线菌次级代谢产生反馈抑制作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中阿卡波糖产量不高和C组分难分离的缺陷，在发酵过程中补入本发明所述的氮源，能大幅提高阿卡波糖的产量，并通过控制该氮源的流加量，降低杂质C的形成。

本发明中，阿卡波糖的制备方法为：

(1)将游动放线菌斜面接种于斜面培养基进行斜面培养；

(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基进行种子培养；

(3)发酵罐培养，在培养过程中向发酵培养基中流加葡萄糖和麦芽糖；其中，步骤(3)中还流加氮源，控制流加氮源后培养基中氨基氮的含量小于或等于0.15mg/ml，较佳的为0.13-0.15mg/mg，最佳的为0.135-0.145mg/ml。

本发明中，所述的氮源为本领域制备阿卡波糖常规添加的氮源，包括有机氮源和铵态无机氮源中的一种或多种。有机氮源如蛋白胨、酵母粉、玉米浆和各类氨基酸等，较佳的为氨基酸及其盐中的一种或多种；所述的氨基酸较佳的为谷氨酸和/或天门冬氨酸；所述的盐较佳的为钠盐或钾盐；所述的铵态无机氮较佳的为铵盐，优选为氯化铵、氨水和硫酸铵中的一种或多种。

因为发酵中后期当流加过多的氮源时，阿卡波糖的发酵单位提高有限，但杂质C组分的含量却快速上升。由于C组分与阿卡波糖很难分离，因此会给提取工作带来很大的困难。本发明通过调节氮源的流加量，使阿卡波糖产物中杂质C组分的含量小于0.5wt％。

在本发明另一较佳实施例中，在步骤(3)中，流加葡萄糖和麦芽糖后控制葡萄糖的含量为5-10mg/ml，更佳的为8-9mg/mL；麦芽糖的含量为20-25mg/ml，更佳的为23-24mg/ml。

步骤(1)中，斜面培养采用现有的游动放线菌斜面培养的常规条件，优选条件如下：在25-28℃培养6-7天；斜面培养基较佳的含有淀粉水解液30-50mg/ml、蛋白胨4-6mg/ml、磷酸氢二钾0.4-0.6mg/ml、硫酸镁0.4-0.6mg/ml和琼脂15-20mg/ml；其消前pH(消毒灭菌前的pH)为7.0；斜面培养基装量为12-20％(百分比为体积百分比)。

步骤(2)中，种子培养采用现有的游动放线菌种子培养的常规条件，优选条件如下：在25-28℃、200-240rpm培养44-48小时；种子培养基较佳地含有淀粉8-12mg/ml、甘油15-25mg/ml、热炸黄豆饼粉15-25mg/ml和碳酸钙2-3mg/ml；其消前pH为6.8；种子培养基装量为12-20％(百分比为体积百分比)。

步骤(3)中，发酵罐培养采用现有的游动放线菌发酵罐培养的常规条件，优选条件如下：

温度为25-28℃；接种量4-5％(百分比为体积百分比)；发酵罐装量40-50％(百分比为体积百分比)；罐压0.07-0.13Mpa；搅拌速度300-600rpm；通气速率400L/hr；发酵培养基含有下述物质：淀粉水解液40-80mg/ml；葡萄糖30mg/ml；有机氮源10-20mg/ml；无机氮源0.8-1.2mg/ml；谷氨酸钠4-6mg/ml；三价铁盐0.05-0.15mg/ml；磷酸盐0.5-1.5mg/ml；碳酸钙2-4mg/ml；其消前pH为6.8。

其中，氮源为游动放线菌发酵所必须的基本物质，有机氮源较佳的为酵母粉、酵母提取物、酵母膏、黄豆饼粉、玉米浆中的一种或几种；无机氮源为铵盐，最佳的是氯化铵；铁是菌体有氧氧化必不可少的元素，当使用非铁制发酵罐如玻璃或不锈钢罐时，需要添加三价铁元素，较佳的为氯化铁或硫酸铁；磷酸盐能促进微生物的生长繁殖，较佳的为磷酸氢二钾；碳酸钙能改善细胞的通透性和调节发酵液的pH。

本发明所述的淀粉水解液由淀粉，较佳的为玉米淀粉经α-淀粉酶于95-100℃水解反应30分钟得到的。主要产物为葡萄糖、麦芽糖及少许麦芽三糖，其中葡萄糖含量为40-50％。

另外，在步骤(3)的发酵罐培养开始40-72小时后，每隔6-12小时取样检测发酵培养基中葡萄糖、麦芽糖和氨基氮的含量。取样检测时还可用高压液相检测阿卡波糖的放罐单位；8天后放罐单位为2286-3300μg/ml。

本发明所有原料及试剂均市售可得。

本发明的积极进步效果是在用游动放线菌发酵生产阿卡波糖时，在发酵罐培养过程中流加氮源，控制培养基中氨基氮的含量小于或等于0.15mg/ml，使得阿卡波糖的产量大幅提高的同时降低杂质C的生成。

附图说明

图1是流加不同氮源的发酵时间-阿卡波糖产量图。

图2是氨基氮含量-阿卡波糖产量和纯度图。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。

下述各实施例中的游动放线菌(Actinoplanes species)ATCC 31044。下述各实施例中的百分比皆为体积百分比。

实施例1

(1)将游动放线菌斜面接种于斜面培养基，28℃培养6天；斜面培养基：淀粉水解液30mg/ml；蛋白胨5mg/ml；磷酸氢二钾0.6mg/ml；硫酸镁0.6mg/ml；琼脂20mg/ml；消前pH＝7.0；培养基装量为20％；

(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基，于28℃、200rpm培养44小时；种子培养基：淀粉10mg/ml；甘油20mg/ml；黄豆饼粉(热炸)20mg/ml；碳酸钙2mg/ml；消前pH＝6.8；750ml摇瓶种子培养基装量为90ml；

(3)发酵罐培养，40小时后每隔6小时取样检测葡萄糖、麦芽糖和氨基氮含量，根据测定结果流加葡萄糖、麦芽糖和谷氨酸，使其含量控制在葡萄糖5mg/ml、麦芽糖20mg/ml和氨基氮0.13mg/ml；同时用高压液相检测阿卡波糖的单位，8天后放罐单位为2840μg/ml，C组分含量为11.6μg/ml(占阿卡波糖产物0.41wt％)；发酵培养基：淀粉水解液40mg/ml；葡萄糖30mg/ml；黄豆饼粉10mg/ml；酵母粉10mg/ml；谷氨酸钠4mg/ml；三氯化铁0.05mg/ml；磷酸氢二钾0.5mg/ml；氯化铵0.8mg/ml；碳酸钙2mg/ml；消前pH＝6.8；发酵温度25℃；10L发酵罐装量为4.5L；接种量4％；罐压：0.07Mpa；搅拌：300rpm；通气速率：400L/hr。

实施例2

(1)将游动放线菌斜面接种于斜面培养基，25℃培养7天；斜面培养基：淀粉水解液50mg/ml；蛋白胨4mg/ml；磷酸氢二钾0.4mg/ml；硫酸镁0.4mg/ml；琼脂15mg/ml；消前pH＝7.0；斜面培养基装量为12％；

(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基，于25℃、240rpm培养48小时；种子培养基：淀粉8mg/ml；甘油15mg/ml；黄豆饼粉(热炸)20mg/ml；碳酸钙2mg/ml；消前pH＝6.8；750ml摇瓶种子培养基装量为150ml；

(3)发酵罐培养，70小时后每隔12小时取样检测葡萄糖、麦芽糖和氯化铵，根据测定结果流加葡萄糖、麦芽糖和氯化铵，使其含量控制在葡萄糖10mg/ml、麦芽糖25mg/ml和氨基氮0.05mg/ml；同时用高压液相检测阿卡波糖的单位，8天后放罐单位为2286μg/ml，C组分含量为5.1μg/ml(占阿卡波糖产物0.22wt％)；发酵培养基：麦芽糖80mg/ml；葡萄糖30mg/ml；黄豆饼粉10mg/ml；玉米浆3mg/ml；谷氨酸钠6mg/ml；三氯化铁0.15mg/ml；磷酸氢二钾1.5mg/ml；氯化铵1.2mg/ml；碳酸钙4mg/ml；消前pH＝6.8；发酵温度为28℃；10L发酵罐装量为5L；接种量5％；罐压：0.13Mpa；搅拌：600rpm；通气速率：400L/hr。

实施例3

(1)将游动放线菌斜面接种于斜面培养基，25℃培养6天；斜面培养基：淀粉水解液30mg/ml；蛋白胨6mg/ml；磷酸氢二钾0.5mg/ml；硫酸镁0.5mg/ml；琼脂16mg/ml；消前pH＝7.0；斜面培养基装量为15％；

(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基，于25℃、220rpm培养46小时；种子培养基：淀粉12mg/ml；甘油25mg/ml；黄豆饼粉(热炸)15mg/ml；碳酸钙2mg/ml；消前pH＝6.8；750ml摇瓶种子培养基装量为100ml；

(3)发酵罐培养，48小时后每隔6小时取样检测葡萄糖、麦芽糖和氨基氮含量，根据测定结果流加葡萄糖、麦芽糖和天门冬氨酸，使其含量控制在葡萄糖8mg/ml、麦芽糖23mg/ml和氨基氮0.15mg/ml；同时用高压液相检测阿卡波糖的单位，8天后放罐单位为3300μg/ml，C组分含量为16.1μg/ml(占阿卡波糖产物0.49wt％)；发酵培养基：淀粉水解液80mg/ml；葡萄糖30mg/ml；酵母粉10mg/ml；玉米浆3mg/ml；谷氨酸钠5mg/ml三氯化铁0.1mg/ml；磷酸氢二钾1mg/ml；氯化铵1mg/ml；碳酸钙3mg/ml；消前pH＝6.8；发酵温度25℃；10L发酵罐装量为4L；接种量4.5％；罐压0.10Mpa；搅拌：400rpm；通气速率：400L/hr。

实施例4

(1)将游动放线菌斜面接种于斜面培养基，25℃培养7天；斜面培养基：淀粉水解液30mg/ml；蛋白胨5mg/ml；磷酸氢二钾0.5mg/ml；硫酸镁0.5mg/ml；琼脂16mg/ml；消前pH＝7.0；斜面培养基装量为12％；

(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基，于25℃、220rpm培养48小时；种子培养基：淀粉10mg/ml；甘油20mg/ml；黄豆饼粉(热炸)25mg/ml；碳酸钙3mg/ml；消前pH＝6.8750ml摇瓶种子培养基装量为100ml；

(3)发酵罐培养，48小时后每隔6小时取样检测葡萄糖、麦芽糖和氨基氮含量，根据测定结果流加葡萄糖、麦芽糖和谷氨酸钠，使其含量控制在葡萄糖9mg/ml、麦芽糖24mg/ml和氨基氮0.145mg/ml，同时用高压液相检测阿卡波糖的产量和纯度；发酵培养基：淀粉水解液60mg/ml；葡萄糖30mg/ml；黄豆饼粉10mg/ml；谷氨酸钠5mg/ml；三氯化铁0.1mg/ml；磷酸氢二钾1mg/ml；氯化铵1mg/ml；碳酸钙3mg/ml；消前pH＝6.8；发酵温度为25℃；10L发酵罐装量为4.5L；接种量：4％；罐压：0.07Mpa；搅拌：500rpm；通气速率：400L/hr。

实施例5

(3)发酵罐培养，40小时后每隔6小时取样检测葡萄糖、麦芽糖和氨基氮含量，根据测定结果流加葡萄糖、麦芽糖和谷氨酸，使其含量控制在葡萄糖5mg/ml、麦芽糖20mg/ml和氨基氮0.135mg/ml；同时用高压液相检测阿卡波糖的单位，8天后放罐单位为2790μg/ml，C组分含量为10.6μg/ml(占阿卡波糖产物0.38wt％)；发酵培养基：淀粉水解液40mg/ml；葡萄糖30mg/ml；黄豆饼粉10mg/ml；酵母粉10mg/ml；谷氨酸钠4mg/ml；三氯化铁0.05mg/ml；磷酸氢二钾0.5mg/ml；氯化铵0.8mg/ml；碳酸钙2mg/ml；消前pH＝6.8；发酵温度25℃；10L发酵罐装量为4.5L；接种量4％；罐压：0.07Mpa；搅拌：300rpm；通气速率：400L/hr。

实施例6-12

(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基，于28℃、220rpm培养48小时；种子培养基：淀粉10mg/ml；甘油20mg/ml；黄豆饼粉(热炸)20mg/ml；碳酸钙2mg/ml；消前pH＝6.8；750ml摇瓶种子培养基装量为100ml；

(3)摇瓶中培养，发酵培养基：淀粉水解液60mg/ml；葡萄糖30mg/ml；酵母粉10mg/ml；黄豆饼粉5mg/ml；谷氨酸钠5mg/ml；三氯化铁0.1mg/ml；磷酸氢二钾1mg/ml；氯化铵1mg/ml；碳酸钙3mg/ml；消前pH＝6.8；750ml摇瓶发酵培养基装量为100ml；接种量6％；发酵温度为27℃，250rpm培养；48小时后每隔24添加葡萄糖、麦芽糖和氮源，葡萄糖添加量为2mg/ml、麦芽糖17mg/ml和氮源0.4mg/ml，7天后放瓶，HPLC检测阿卡波糖发酵单位。

上述步骤(3)中添加的氮源种类列于表1中：

表1

实施例	7	8	9	10	11	12	13
								氮源	黄豆饼粉	玉米浆	酵母粉	谷氨酸钠	天门冬氨酸	氯化铵	酪蛋白水解液

对比实施例1

(3)发酵培养基：淀粉水解液60mg/ml；葡萄糖30mg/ml；酵母粉10mg/ml；黄豆饼粉5mg/ml；谷氨酸钠5mg/ml；三氯化铁0.1mg/ml；磷酸氢二钾1mg/ml；氯化铵1mg/ml；碳酸钙3mg/ml；消前pH＝6.8；750ml摇瓶发酵培养基装量为100ml；接种量6％；发酵温度为27℃，250rpm培养；48小时后每隔24小时添加葡萄糖、麦芽糖和无菌水，葡萄糖添加量为200mg、麦芽糖1700mg和无菌水2ml，7天后放瓶，HPLC检测阿卡波糖发酵单位。

对比实施例2

(2)挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基，于25℃、220rpm培养48小时；种子培养基：淀粉10mg/ml；甘油20mg/ml；黄豆饼粉(热炸)20mg/ml；碳酸钙2mg/ml；消前pH＝6.8；750ml摇瓶种子培养基装量为100ml；

(3)发酵罐培养，48小时后每隔6小时取样检测葡萄糖、麦芽糖，根据测定结果流加葡萄糖、麦芽糖，使其含量控制在葡萄糖9g/L、麦芽糖24g/L，同时用高压液相检测阿卡波糖的产量和纯度；发酵培养基：淀粉水解液60mg/ml；葡萄糖30mg/ml；黄豆饼粉10mg/ml；谷氨酸钠5mg/ml；三氯化铁0.1mg/ml；磷酸氢二钾1mg/ml；氯化铵1mg/ml；碳酸钙3mg/ml；消前pH＝6.8；发酵温度为25℃；10L发酵罐装量为4.5L；接种量：4％；罐压：0.07Mpa；搅拌：500rpm；通气速率：400L/hr。

对比实施例3

(3)发酵罐培养，48小时后每隔6小时取样检测葡萄糖、麦芽糖和氨基氮含量，根据测定结果流加葡萄糖、麦芽糖和谷氨酸钠，使其含量控制在葡萄糖9g/L、麦芽糖24g/L和氨基氮0.18mg/ml，同时用高压液相检测阿卡波糖的产量和纯度；发酵培养基：淀粉水解液60mg/ml；葡萄糖30mg/ml；黄豆饼粉10mg/ml；谷氨酸钠5mg/ml；三氯化铁0.1mg/ml；磷酸氢二钾1mg/ml；氯化铵1mg/ml；碳酸钙3mg/ml；消前pH＝6.8；发酵温度为25℃；10L发酵罐装量为4.5L；接种量：4％；罐压：0.07Mpa；搅拌：500rpm；通气速率：400L/hr。

效果实施例1流加不同氮源对阿卡波糖产量的影响

测定了对比实施例1和实施例6-12中阿卡波糖的产量(表2和图1)。

图1中的对照是用对比实施例1的方法测得的产量。

表2流加不同氮源对阿卡波糖产量的影响

氮源	对照	谷氨酸钠	天门冬氨酸	氯化铵	酸水解酪蛋白	酵母粉	黄豆饼粉	玉米浆
									阿卡波糖相对百分比	100	156	128	110	105	102	96	88

由表2和图1可见，流加氮源后阿卡波糖的产量有一定的提高，其中谷氨酸钠、天门冬氨酸和氯化铵对提高阿卡波糖产量有很显著的效果。

效果实施例2氨基氮含量对阿卡波糖产量和纯度的影响

该效果实施例中测定了实施例4、对比实施例2和3中阿卡波糖的产量

以及杂质C的含量，见表3和图2。

对比实施例2中未流加氮源(记为对照)，实施例4(记为A)控制氨基氮含量在0.145mg/ml，对比实施例3(记为B)中控制氨基氮含量在0.18mg/ml。

表3控制发酵液中氨基氮含量对阿卡波糖产量和纯度的影响

由表3和图2可见，A和B的阿卡波糖产量很接近，但是A中杂质C的含量比B低很多。所以将氨基氮含量控制在本发明所述范围内不但能使阿卡波糖产量大幅提高，还能有效控制杂质C的产生。

Claims

1.一种阿卡波糖的制备方法，其包含下述步骤：

（1）将游动放线菌斜面接种于斜面培养基进行斜面培养；

（2）挑选生长丰满的斜面接种于种子培养基进行种子培养；

（3）发酵罐培养，在培养过程中向发酵培养基中流加葡萄糖和麦芽糖；其特征在于：步骤（3）中还流加氮源，控制培养基中氨基氮的含量为0.145mg/ml；在步骤（3）中，流加葡萄糖和麦芽糖后，控制培养基中葡萄糖的含量为5-10mg/ml；麦芽糖的含量为20-25mg/ml；所述的氮源为谷氨酸钠、天门冬氨酸和氯化铵中的一种或多种；

步骤（1）中所述的斜面培养为在25-28℃培养6-7天；斜面培养基含有下述物质：淀粉水解液30-50mg/ml、蛋白胨4-6mg/ml、磷酸氢二钾0.4-0.6mg/ml、硫酸镁0.4-0.6mg/ml和琼脂15-20mg/ml；斜面培养基的消前pH为7.0；斜面培养基装量为12-20%；

步骤（2）中的种子培养为在25-28℃、200-240rpm培养44-48小时；种子培养基含有下述物质：淀粉8-12mg/ml、甘油15-25mg/ml、热炸黄豆饼粉15-25mg/ml和碳酸钙2-3mg/ml；种子培养基的消前pH为6.8；种子培养基装量为12-20%；

步骤（3）中的发酵罐培养为在25-28℃培养；接种量4-5%；发酵罐装量40-50%；罐压0.07-0.13Mpa；搅拌速度300-600rpm；通气速率400L/hr；发酵培养基含有下述物质：淀粉水解液40-80mg/ml；葡萄糖30mg/ml；有机氮源10-20mg/ml；无机氮源0.8-1.2mg/ml；谷氨酸钠4-6mg/ml；三价铁盐0.05-0.15mg/ml；磷酸盐0.5-1.5mg/ml；碳酸钙2-4mg/ml；发酵培养基的消前pH为6.8；

上述接种量和装量的百分比均为体积百分比。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，流加葡萄糖和麦芽糖后，控制培养基中葡萄糖的含量为8-9mg/ml；麦芽糖的含量为23-24mg/ml。