CN112300954B - 解淀粉芽孢杆菌及其在发酵生产谷氨酰胺酶中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物筛选及发酵领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在发酵生产谷氨酰胺酶中的应用。本发明提供了一种产谷氨酰胺酶的菌株，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ESP827)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2018828。并提供了利用上述菌株进行液态发酵生产谷氨酰胺酶。所述方法得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活远远高于目前已报道的发酵酶活，发酵酶活为120‑158U/mL，液态发酵的方式更易于产品工业化生产，发酵酶活纯度较高，易于下游提取。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其在发酵生产谷氨酰胺酶中的应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选及发酵领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在发酵生产谷氨酰胺酶中的应用。
背景技术
谷氨酰胺酶(Glutaminase)是酰胺酶的一种，能专一的催化L-β-谷氨酰胺水解生成L-谷氨酸和氨。谷氨酸是一种呈鲜味的氨基酸，谷氨酸钠是公认的安全的健康的调味料。在酵母抽提物、酱油、植物蛋白水解物、肉鱼类蛋白水解物、酱汤、果蔬水解物等多样产品中加入谷氨酰胺酶，能提高谷氨酸的含量，改善和提高氨基酸的组分，增加和加强产品的呈味性能。此外，谷氨酰胺酶还能抑制蛋白原料中的谷氨酰胺向无味的焦谷氨酸转化，提高原料的利用率；蛋白原料的脱酰胺作用也会改善蛋白原料的物理性能，提供更多应用领域的可能。同时研究表明谷氨酰胺酶是一种安全的食品添加剂，医学上谷氨酰胺酶是癌细胞利用谷氨酰胺进行酵解的关键酶和限速酶，与肿瘤生长及肿瘤免疫有重要关系；谷氨酰胺酶可作为癌症治疗中的一个目标或者工具。谷氨酰胺酶是一个越来越值得被重视的酶制剂。
谷氨酰胺酶的主要由微生物发酵制得。产谷氨酰胺酶的微生物种类很多，包括细菌、真菌、酵母等。目前主要的方式利用曲霉进行固态发酵制备，该种方式发酵制备的谷氨酰胺酶一般酶活偏低，混菌发酵的形式也导致了制得的谷氨酰胺酶纯度不够，专一性较差，发酵产量受到限制。有资料显示为了提高酱油等领域中谷氨酸的含量，使用安全的乳酸菌作为发酵菌株进行液态发酵生产谷氨酰胺酶，由于发酵酶活太低，只能将菌体搜集后破碎不做提取处理直接加入到酱油曲中反应，结果检测谷氨酸含量确实有所提高，但是直接引入菌体的方式也会带来不可预知的风险，不适合做大规模的产品生产。利用解淀粉芽孢杆菌深层液态发酵是生产谷氨酰胺酶一种较好的方式，但是目前遇到的问题是菌株发酵酶活太低，不适合进行大规模生产。
目前，国内对谷氨酰胺酶液态发酵的研究报道不多，主要还是集中在菌种选育、改善和发酵优化方面，技术方面还处于实验室阶段。盖作启等人从温泉中沉积物中筛选到一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌，通过优化液态发酵工艺方式验证谷氨酰胺酶的产量在12U/mL左右；日本学者利用枯草芽孢杆菌液态发酵制得谷氨酰胺酶酶制剂，并应用的酱油领域，取得了一定的效果。崔春等人在深海中海泥中筛选到一株产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌，通过对碳源的优化验证菌株的发酵性能，最终选择最佳碳源发酵产谷氨酰胺酶活力在0.3U/g左右。谷氨酰胺酶酶活一般在胞内和胞外都会存在，提取困难，实验室一般采用超滤、盐沉、层析和液相等方式来分离纯化，并对酶学性质进行研究。
中国专利申请号CN201610176616.3公开了一种产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌及其应用，所述解淀粉芽孢杆菌于2015年11月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：GCGMCC No.11760。使用上述所述的菌株发酵生产谷氨酰胺酶，所得到的谷氨酰胺酶的活性为12U/mL。
谷氨酰胺酶是一种能专一的催化谷氨酰胺生成谷氨酸和氨的酶；谷氨酸是食品行业中重要的鲜味增强氨基酸，应用范围十分广泛，对食品风味有着十分重要的作用。谷氨酰胺酶酶法生产谷氨酸在低盐条件下即可完成，对日益强化的低盐健康饮食意义重大。产谷氨酰胺酶的微生物种类很多，但绝大多数酶活力很低。通过曲霉固态发酵是目前生产谷氨酰胺酶的主要途径，由于菌种产酶活力低，混菌发酵提取困难，固态发酵产能限制，造成市场上谷氨酰胺酶供应紧缺。提高谷氨酰胺酶产酶活力和实现液态深层发酵技术是解决谷氨酰胺酶生产的关键技术之一，具有重要的研究意义和市场价值。目前市场上的谷氨酰胺酶是以日本田野酶制剂公司为主，国内基本没有生产谷氨酰胺酶的厂家，该产品的市场开发潜力大。
谷氨酰胺酶已被验证在酱油等调味品、蛋白深加工和医药中有较好的使用效果。由于菌种和发酵技术的限制，目前实验室研究阶段较多，且更多的是集中在医药和理论方面的研究，对发酵技术研究相对的较少，国内基本没有实现产业化。国内的谷氨酰胺酶产品还处于空缺阶段，使用几乎都是从日本进口，对行业的发展有一定的限制。
发明内容
为此，本发明所解决的技术的问题是：谷氨酰胺酶生产主要采用固态发酵生产，发酵酶活低，提取相对困难，受发酵方式限制，产量不高。
本发明提供了一种从土壤中筛选出产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens ESP827)菌株，并通过紫外、ARTP等诱变技术对菌株进行诱变和驯化，获得高产酶活菌株，该菌株已送于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CCTCC No：M 2018828。
本发明提供一种高效液体深层发酵技术发酵生产谷氨酰胺酶方法，其使用上述所述的菌株，发酵酶活为120-158U/mL；发酵产品易于提取，产品性能较好，可以广泛应用在调味品、蛋白深加工领域。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种产谷氨酰胺酶的菌株，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens ESP827)，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2018828。
本发明提供了上述所述的菌株在发酵领域中的应用，优选在发酵生产谷氨酰胺酶中的应用。
本发明提供了一种生产谷氨酰胺酶的方法，其中，使用上述所述的菌株进行液态发酵生产得到谷氨酰胺酶。
优选的，对于上述所述的方法，其中，所述方法包括下述步骤：
(1)菌种活化：将本发明所述的菌株接种在培养基中，得到活化的菌株；
(2)种子制备：将步骤(1)所得到的菌株接种到种子摇瓶培养基中进行培养，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子菌液接入到装有种子培养基中的种子罐中进行培养，得到种子培养液；
(4)发酵罐培养：将种子培养液接种到发酵罐中进行培养，发酵结束后得到发酵液。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(1)中，培养温度为30-40℃，优选的，所述培养时间为18-24小时。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(2)中，培养温度为30-40℃；优选的，培养时间为5-15小时，优选为10-12小时。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(3)中，转速为80-200rpm，优选的，通风比为1:0.5-1:1，优选为1:0.8-1:1；进一步优选的，培养温度为30-40℃，优选为35-37℃；进一步优选的，培养时间为5-10小时，优选为8-10小时；进一步优选的，接种量为0.2％-0.6％体积比。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(4)中，转速为80-160rpm，优选的，通风比为1:0.5-1:1.1，优选为1:0.8-1:1；进一步优选的，培养温度为20-30℃，优选为25-30℃；进一步优选的，培养时间为30-40小时，优选为30-36小时；进一步优选的，接种量为5％-8％体积比。
优选的，对于上述所述的方法，其中，在步骤(4)中，在培养5-9小时后流加含有碳源和氮源的培养基；优选的，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为酵母粉，进一步优选的，以质量体积比计，所述培养基含有30-60％葡萄糖和30-50％的酵母粉，余量为水；进一步优选的，流加的速率为1:0.8-1:1.1。
优选的，对于上述所述的方法，其中，以质量体积比计，所述的种子培养基包括酵母粉0.5-4％，蛋白胨1-4％和氯化钠0.8-2％，余量为水。
优选的，对于上述所述的方法，其中，以质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1-4％，酵母粉2-6％，谷氨酰胺0.05-0.4％，磷酸氢二钾0.05-0.08％，磷酸二氢钾0.1-0.3％和氯化镁0.05-0.2％，余量为水。
本发明提供了上述所述的方法发酵得到的谷氨酸酰胺酶，其中酶活为120-158U/mL。
本发明所取得的有益效果是：
本发明提供了一种高产谷氨酰胺酶的解淀粉芽孢杆菌，并提供了采用所述的菌株进行液态深层发酵方式发酵生产谷氨酰胺酶的方法，该方法中发酵酶活远远高于目前已报道的发酵酶活，发酵酶活为120-158U/mL，液态发酵的方式更易于产品工业化生产，发酵酶活纯度较高，易于下游提取。
菌株保藏信息
本发明所用的菌种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ESP827)，于2018年11月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2018828，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：(027)-68754052。
附图说明
图1-1是实施例1所得到菌株的平板划线实体图；
图1-2是实施例1所得到的菌株在显微镜下的示意图。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，所述菌株是从生产腐乳或酱油的工厂周边的土壤中分离，并经紫外、ARTP等诱变技术对分离得到的菌株进行诱变和驯化得到，所得到的菌株发酵生产的谷氨酸酰胺酶的活性较高，为120-158U/mL，该菌株已送于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号是CCTCC No：M 2018828。
本发明提供了一种使用上述所述的菌株生产谷氨酰胺酶的液态发酵方法，其中，所述方法包括下述步骤：
(1)菌种活化：将上述所述的菌株接种在培养基中，得到活化的菌株；
(2)种子制备：将步骤(1)所得到的菌株接种到种子摇瓶培养基中进行培养，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：将步骤(2)所得到的种子菌液接入到装有种子培养基中的种子罐中进行培养，得到种子培养液；
(4)发酵罐培养：将种子培养液接种到发酵罐中进行培养，发酵结束后得到发酵液。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在步骤(4)中，转速为80-160rpm，优选的，通风比为1:0.5-1:1.1，优选为1:0.8-1:1；进一步优选的，培养温度为20-30℃，优选为25-30℃；进一步优选的，培养时间为30-40小时，优选为30-36小时；进一步优选的，接种量为5％-8％体积比。
优选的，培养时间为流加含有碳源和氮源的培养基之前的时间以及流加之后的时间之和。
在本发明优选的一种具体实施方式中，所述液态发酵方法包括下述步骤：
(1)菌种活化：取孢子悬液甘油管一支，用接种环在无菌环境中接入培养基中，至于37℃环境中培养18-24h。
(2)种子制备：将培养好的平板中单菌落接种是种子摇瓶培养基中，37℃培养10-12h，优选在转速为200-220rpm进行培养。
(3)种子罐培养：将种子培养基通过卡氏罐接入种子罐中，接种量为0.2％～0.6％，培养温度37℃，转速80～200rpm，通风比1：0.8～1：1，培养周期约6-8小时。
(4)发酵罐培养：将种子培养液按照5～8％接种接入发酵罐中进行培养，培养温度27±1℃，转速80～160rpm，培养周期约30小时，通风比1：0.8～1：1.1，发酵8小时后开始流加氮源和碳源，发酵结束时放罐酶活水平在120u/ml～150u/ml。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，按质量体积比计，所述种子培养基的配方为：酵母粉0.5-4％，蛋白胨1-4％，氯化钠0.8-2％，余量为水；
所述发酵的培养基配方为：葡萄糖1-4％，酵母粉2-6％，谷氨酰胺0.05-0.4％，磷酸氢二钾0.05-0.08％，磷酸二氢钾0.1-0.3％，氯化镁0.05-0.2％，余量为水；
含有氮源和碳源的培养基的配方为：葡萄糖20-50％，酵母粉30-50％，余量为水。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，按照1：0.8-1.1的比例流加速率流加碳氮源，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，所述比例为碳源和氮源流加速度的体积比例。
在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，在发酵结束后，高速离心搜集菌体，并用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液根据估计酶活稀释至合适水平后检测酶活。
下面对本实施例所用的原料及设备的生产厂家，以及产品分析使用的设备和分析方法进行说明如下，其中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别。实施例所用到的原料的信息及实验设备如表1所示。
表1实施例中所用到的原料的信息
原料信息 纯度 生产厂家
酵母粉 食品级别 安琪酵母股份有限公司
蛋白胨 食品级别 安琪酵母股份有限公司
谷氨酰胺 食品级别 新疆埠丰生物科技有限公司
高氯酸 72％ 天津鑫源化工有限公司
实施例1菌株的获得
(1)分离菌株：该菌株是从生产腐乳或酱油的工厂周边的土壤中分离得到，具体操作步骤为：
样品采集：从腐乳或酱油厂区周边的土壤中或者从腐乳半成品或酱油发酵半成品中采集样品；
微生物富集：将搜集到的样品在37℃的恒温环境中放置48h以上至干燥；取适量干燥的样品接种至新鲜的培养基中，富集培养；培养基配方为葡萄糖1％，酵母粉2％，谷氨酰胺0.06％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾0.2％和氯化镁0.1％，余量为水。
富集后的样品通过梯度稀释后平板培养，获得单菌落；
(2)诱变菌株
采用ARTP诱变方式对步骤(1)所得到的菌株进行诱变
设备准备：按照设备使用说明书正常操作；(ARTP-ⅡS，无锡源清天木生物科技有限公司)
菌悬液制备：将培养至对数期的菌液离心收集，生理盐水洗涤2次后，用生理盐复溶至OD在0.5左右，此时菌量在106～108左右；
于超净台将金属载片置于酒精灯外焰灼烧20s左右，冷却后方式无菌平板上，取10μL菌液均匀涂布在栽片上
将装有样品载片的平板移至ARTP诱变系统操作仓,用无菌镊子将载片放对应孔位，调节载台下方旋钮，使载片处于气流端口2mm处,并关闭仓门；
功率设置100W，流量在10SLM，时间在35s；
样品处理完毕，用无菌镊子将载片放至装有1mL无菌水的离心管中；充分震荡均匀；形成新的菌悬液；
对新的菌悬液进行梯度稀释涂布获得单菌落；检测致死率在98.36％；
(3)菌落鉴定和16S rDNA鉴定
1)生理生化实验：液化明胶，水解淀粉，V.P试验阳性，还原硝酸盐，卵磷脂酶试验阴性，革兰氏阳性。
2)形态学特征：颜色呈乳白色，水色，边缘较规则，带有特有的气味，革兰氏染色呈阳性，其形态图如图1-1至1-2所示。
3)16S rDNA鉴定
引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其中，SEQ ID NO.2所示的序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，SEQ ID NO.3所示的序列为5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由奥科鼎盛生物科技(武汉)有限公司提供。
PCR反应体系如下：
Figure GDA0003850659420000081
PCR扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，扩增30个循环；72℃10min。
将扩增得到的序列送至奥科鼎盛生物科技(武汉)有限公司测序，得到的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列使用NCBI网站进行BLAST核苷酸比对分析，与解淀粉芽孢杆菌16S rDNA序列的同源性为100％(Gene Bank:AB735995.1和FJ685773.1)。
实施例2-1发酵生产谷氨酰胺酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化18h得到单菌落，所述平板培养基的组分为：按100L水计，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基的三角瓶中，(其组分和含量与步骤(1)的培养基相同)中(500mL的三角瓶中装液100mL料液)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养10h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.3％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种到5L含有种子培养基的种子罐中进行培养，培养温度为37℃，转速100rpm，通风比为1:0.8，培养8小时，其中，所述种子培养基包含酵母粉0.5％，蛋白胨4％，氯化钠0.8％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以6％体积比的接种量接种步骤(3)所得到的种子至5L的发酵罐中，发酵温度27℃，转速为80rpm，通风比为1:0.8，发酵8小时后按照1:0.8的比例开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，再发酵22h，发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活，其中，发酵培养基包含葡萄糖4％，酵母粉2％，谷氨酰胺0.05％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾0.3％，氯化镁0.2％，余量为水；
含有氮源和碳源的培养基包含葡萄糖30％，酵母粉为50％，余量为水。
谷氨酰胺酶酶活测定的原理：
谷氨酰胺酶在pH6.0，37℃条件下,催化谷氨酰胺转化成谷氨酸
定义该酶酶活力：在既定条件下，1min内催化生成1μmol的谷氨酸所需要的酶量定义为一个酶活单位。
测试试剂包括：
1)0.75mol/L高氯酸溶液：溶解83mL60％的高氯酸于900mL蒸馏水中，定容至1000mL，棕色试剂瓶4℃保存
2)0.75mol/L氢氧化钠溶液：溶解30g氢氧化钠固体于800mL蒸馏水中，定容至1000mL
3)1.0mol/L醋酸溶液：溶解60.05g醋酸于900mL蒸馏水中，定容至1000mL
4)1.0mol/L醋酸钠溶液：溶解136.08g三水乙酸钠于900mL蒸馏水中，定容至1000mL
5)1.0mol/LpH6.0醋酸缓冲液：用1.0mol/L醋酸溶液调1.0mol/L醋酸钠溶液至pH6.0
6)10％TritonX-100溶液：溶解10g TritonX-100于70mL蒸馏水中，定容至100mL
7)酶稀释液：10mL 1.0mol/L pH6.0醋酸缓冲液与0.5mL10％TritonX-100溶液混合，蒸馏水定容至1000mL
8)2.0％pH6.0 L-谷氨酰胺底物溶液：溶解2.00g L-谷氨酰胺于70mL蒸馏水中，再加10mL 1.0mol/L醋酸缓冲液，蒸馏水定容至100mL
反应体系
A.酶促反应
1)吸取1.0mL酶液于试管，在37℃水浴中保温5min；
2)再加1.0mL底物溶液，立即计时在37℃水浴中反应；
3)准确反应10min后，加1.0mL0.75mol/L高氯酸溶液，混匀，冰浴1min；
4)再加1.0mL0.75mol/L氢氧化钠溶液，混匀，得混合液；
B.空白对照
1)吸取1.0mL酶液于试管，加入1.0mL0.75mol/L高氯酸溶液，混匀；
2)于37℃水浴中保温5min；
3)加1.0mL底物溶液后，冰浴1min；
4)再加1.0mL0.75mol/L氢氧化钠溶液，混匀，得混合液；
采用SBA生物传感分析仪(SBA-40C型生物传感分析仪，购自山东省科学院生物研究所)直接测定酶产物中的谷氨酸含量：
在该检测条件下，每分钟转化谷氨酰胺生成1μmol的谷氨酸所需酶的量定义为一个酶活单位。
酶活力E(u/g)＝X×10-5/147×106×4/10×1/W
X:生物传感器显示值
X×10-5：混合液中检测出谷氨酸的含量，g/mL
147：谷氨酸分子质量
106:单位换算，mol换算成μmol
4:酶促反应总体积，mL
10:酶促反应时间，min
W：酶液浓度，g/mL
按照上述的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活123U/mL。
实施例2-2发酵生产谷氨酰胺酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化18h得到单菌落，所述平板培养基的组分与实施例2-1的(1)的组分和含量相同；
(2)种子制备：挑选步骤(1)中活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其与实施例2-1步骤(2)的组分和含量相同)的三角瓶中(250mL三角瓶中装有50mL料液)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养12h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.2％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种到5L含有种子培养基的种子罐中进行培养，培养温度为37℃，转速200rpm，通风比为1:1.1，培养10小时，其中，所述种子培养基包含酵母粉4％，蛋白胨1％，氯化钠2％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以6.67％体积比的接种量接种步骤(3)所得到的种子至50L的发酵罐中，发酵温度27℃，转速为100rpm，通风比为1:1.1，发酵8小时后按照1：1.1的比例流加速率开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，再发酵32h，发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活，其中，发酵培养基包含葡萄糖1％，酵母粉6％，谷氨酰胺0.4％，磷酸氢二钾0.08％，磷酸二氢钾0.1％，氯化镁0.05％，余量为水；
含有氮源和碳源的培养基包含葡萄糖60％，酵母粉为30％，余量为水；
按照与实施例2-1相同的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活150U/mL。
实施例2-3发酵生产谷氨酰胺酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化18h得到单菌落，所述平板培养基的组分与实施例2-1的(1)的组分和含量相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其与实施例2-1步骤(2)的组分和含量相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶装有400mL料液)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养11h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.4％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种至500L含有种子培养基的种子罐(500L的种子罐初始装液300L)中进行培养，培养温度为37℃，转速为200rpm，通风比：1：1，培养9小时，其中，所述种子培养基包含酵母粉2％，蛋白胨2％，氯化钠1％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以5％体积比的接种量接种步骤(3)所得到的种子至6m3/10m3的发酵罐中(10m3的发酵罐初始装液6m3)，发酵温度27℃，转速为160rpm，通风比为1:0.9，发酵9小时后按照1：0.9的比例流加速率开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右；再发酵32h；发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活，其中，发酵培养基包含葡萄糖2％，酵母粉4％，谷氨酰胺0.2％，磷酸氢二钾0.06％，磷酸二氢钾0.2％，氯化镁0.1％，余量为水；
含氮源和碳源的培养基包含葡萄糖50％，酵母粉为40％，余量为水；
按照与实施例2-1相同的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活133U/mL。
实施例2-4发酵生产谷氨酰胺酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中37℃活化18h得到单菌落，所述平板培养基的组分与实施例2-1的(1)的组分和含量相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其与实施例2-1步骤(2)的组分和含量相同)的三角瓶中(400mL/2000mL三角瓶装有400mL料液)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养10h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.4％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种至5m3种子罐(5m3的种子罐初始装液1.5m3料液)中，发酵温度：37℃，转速为200rpm，通风比：1：1，培养8h，其中，所述种子培养基包含酵母粉3％，蛋白胨3％，氯化钠1.5％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以5％体积比的接种量步骤(3)所得到的种子接种至25m3的发酵罐(25m3发酵罐初始装液18m3)中，发酵温度27℃，转速为160rpm，通风比为1:1.1，发酵8小时后按照1：0.8的比例流加速率开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，再发酵30h，发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活。其中，发酵培养基包含葡萄糖3％，酵母粉5％，谷氨酰胺0.3％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾0.15％，氯化镁0.15％，余量为水；
含有氮源和碳源的培养基包含葡萄糖55％，酵母粉为35％，余量为水；
按照与实施例2-1相同的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活158U/mL。
实施例2-5发酵生产谷氨酰胺酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中30℃活化20h得到单菌落，所述平板培养基的组分与实施例2-1的(1)的组分和含量相同；
(2)种子制备：挑选步骤(1)中活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其与实施例2-1步骤(2)的组分和含量相同)的三角瓶中(250mL三角瓶装有50mL料液)，制备种子液，培养条件：30℃，200rpm培养15h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.6％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种到5L含有种子培养基的种子罐中进行培养，培养温度为30℃，转速80rpm，通风比为1:1，培养5小时，其中，所述种子培养基包含酵母粉2％，蛋白胨4％，氯化钠1％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以8％体积比的接种量接种步骤(3)所得到的种子至50L的发酵罐中，发酵温度25℃，转速为120rpm，通风比为1:0.5，发酵5小时后按照1：0.9的比例流加速率开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，再发酵31h，发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活，其中，发酵培养基包含葡萄糖1％，酵母粉4％，谷氨酰胺0.1％，磷酸氢二钾0.05％，磷酸二氢钾0.2％，氯化镁0.1％，余量为水；
含有氮源和碳源的培养基包含葡萄糖30％，酵母粉为40％，余量为水；
按照与实施例2-1相同的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活121U/mL。
实施例2-6发酵生产谷氨酰胺酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中40℃活化22h得到单菌落，所述平板培养基的组分与实施例2-1的(1)的组分和含量相同；
(2)种子制备：挑选步骤(1)中活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其与实施例2-1步骤(2)的组分和含量相同)的三角瓶中(250mL三角瓶装有50mL料液)，制备种子液，培养条件：40℃，200rpm培养5h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.5％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种到5L含有种子培养基的种子罐中进行培养，培养温度为40℃，转速150rpm，通风比为1:0.5，培养6小时，其中，所述种子培养基包含酵母粉0.5％，蛋白胨2％，氯化钠0.8％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以7％体积比的接种量接种步骤(3)所得到的种子至50L的发酵罐中，发酵温度30℃，转速为80rpm，通风比为1:0.5，发酵9小时后按照1：1.1的比例流加速率开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，再发酵31h，发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活，其中，发酵培养基包含葡萄糖4％，酵母粉3％，谷氨酰胺0.4％，磷酸氢二钾0.06％，磷酸二氢钾0.2％，氯化镁0.2％，余量为水；
含有氮源和碳源的培养基包含葡萄糖55％，酵母粉为30％，余量为水；
按照与实施例2-1相同的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活133U/mL。
实施例2-7发酵生产谷氨酰胺酶
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种在新鲜的平板培养基中33℃活化24h得到单菌落，所述平板培养基的组分与实施例2-1的(1)的组分和含量相同；
(2)种子制备：挑选步骤(1)中活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其与实施例2-1步骤(2)的组分和含量相同)的三角瓶中(250mL三角瓶中装有50mL料液)，制备种子液，培养条件：35℃，200rpm培养10h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.3％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种到5L含有种子培养基的种子罐中进行培养，培养温度为35℃，转速180rpm，通风比为1:0.8，培养10小时，其中，所述种子培养基包含酵母粉3％，蛋白胨2％，氯化钠2％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以8％体积比的接种量接种步骤(3)所得到的种子至50L的发酵罐中，发酵温度20℃，转速为100rpm，通风比为1:1.1，发酵7小时后按照1：0.8的比例流加速率开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右，再发酵28h，发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活，其中，发酵培养基包含葡萄糖2％，酵母粉3％，谷氨酰胺0.2％，磷酸氢二钾0.06％，磷酸二氢钾0.2％，氯化镁0.1％，余量为水；
含有氮源和碳源的培养基包含葡萄糖40％，酵母粉为40％，余量为水；
按照与实施例2-1相同的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活131U/mL。
对比例1
将本发明所述的菌株进行发酵，具体发酵方法为：选择本发明所述的菌株甘油管，接种至新鲜的种子摇瓶培养基中37℃培养12h；种子成熟后以2％的接种量接种至发酵培养基中，37℃培养48h，其中，发酵培养基：糖蜜2％，酵母粉1％，氯化钙0.28％，硫酸镁0.05％，硫酸锰0.001％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.1％，磷酸二氢钾0.1％，其他为水，发酵结束后按照实施例2-1所述的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活在63U/mL。
对比例2
(1)菌种活化：挑选甘油管菌种(采用实施例1诱变之前的菌株)在新鲜的平板培养基中37℃活化18h得到单菌落，所述平板培养基的组分与实施例2-1的(1)的组分和含量相同；
(2)种子制备：挑选活化后的单菌落1-2个转接到装有新鲜的种子培养基(其与实施例2-1步骤(2)的组分和含量相同)的三角瓶中(2000mL三角瓶中装有400mL料液)，制备种子液，培养条件：37℃，200rpm培养11h；
(3)种子罐培养：按接种量为0.4％体积比将步骤(2)所得到的种子液接种至500L含有种子培养基的种子罐(500L的种子罐初始装液300L)中进行培养，培养温度为37℃，转速为200rpm，通风比：1：1，培养9小时，其中，所述种子培养基包含酵母粉2％，蛋白胨2％，氯化钠1％，余量为水；
(4)发酵罐培养：以5％体积比的接种量接种步骤(3)所得到的种子至10m3的发酵罐中(10m3的发酵罐初始装液6m3)，发酵温度27℃，转速为160rpm，通风比为1:0.9，发酵9小时后按照1：0.9的比例流加速率开始流加含氮源和碳源的培养基，控制发酵液中葡萄糖的含量在5g/L左右；再发酵32h；发酵结束后高速离心搜集菌体，用0.05M的pH7.4的磷酸盐-Tris缓冲溶液进行洗涤菌体并均质破碎，破碎后的发酵液稀释后检测酶活，其中，发酵培养基包含葡萄糖2％，酵母粉4％，谷氨酰胺0.2％，磷酸氢二钾0.06％，磷酸二氢钾0.2％，氯化镁0.1％，余量为水；
含氮源和碳源的培养基包含葡萄糖50％，酵母粉为40％，余量为水；
按照与实施例2-1相同的方法进行测定，所得到的谷氨酰胺酶的发酵酶活1.8U/mL。
将对比例1和实施例2-3进行对比，区别在于使用的发酵方法不同，对比例1所得到的酶活为63UmL，而实施例2-3所得到的酶活为133U/mL,说明将本发明所述的菌株经过菌种活化、种子制备、种子罐培养以及发酵罐培养之后所得到的酶活较高。
将对比例2和实施例2-3进行对比，其区别在于，对比例2使用的是野生型菌株(突变之前的菌株)，实施例2-3使用的本发明所述的菌株(即突变之后的菌株)，所得到的酶活不同，对比例2所得到的酶活为1.8U/mL，实施例2-3所得到的酶活为133U/mL，说明采用本发明所述的菌株所得到的酶活较高。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0002146474670000011
Figure IDA0002146474670000021

Claims (47)

1.一种产谷氨酰胺酶的菌株，其特征在于，所述菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens ESP827），其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018828。
2.权利要求1所述的菌株在发酵生产谷氨酰胺酶中的应用。
3.一种生产谷氨酰胺酶的方法，其中，使用权利要求1所述的菌株进行液态发酵生产得到谷氨酰胺酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述方法包括下述步骤：
（1）菌种活化：将权利要求1所述的菌株接种在培养基中，得到活化的菌株；
（2）种子制备：将步骤（1）所得到的菌株接种到种子摇瓶培养基中进行培养，得到种子菌液；
（3）种子罐培养：将步骤（2）所得到的种子菌液接入到装有种子培养基中的种子罐中进行培养，得到种子培养液；
（4）发酵罐培养：将种子培养液接种到发酵罐中进行培养，发酵结束后得到发酵液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（1）中，培养温度为30-40℃。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（1）中，培养时间为18-24小时。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养温度为30-40℃。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养温度为30-40℃。
9.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为5-15小时。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为5-15小时。
11.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为5-15小时。
12.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为10-12小时。
13.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤（2）中，培养时间为10-12小时。
14.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，转速为80-200rpm。
15.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.5-1:1。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（3）中，通风比为1:0.5-1:1。
17.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养温度为30-40℃。
18.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养温度为30-40℃。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养温度为30-40℃。
20.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养温度为35-37℃。
21.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养时间为5-10小时。
22.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，培养时间为8-10小时。
23.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，接种量为0.2%-0.6%体积比。
24.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（3）中，接种量为0.2%-0.6%体积比。
25.根据权利要求15所述的方法，其中，在步骤（3）中，接种量为0.2%-0.6%体积比。
26.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，转速为80-160rpm。
27.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（4）中，转速为80-160rpm。
28.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，通风比为1:0.5-1:1.1。
29.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（4）中，通风比为1:0.5-1:1.1。
30.根据权利要求15所述的方法，其中，在步骤（4）中，通风比为1:0.5-1:1.1。
31.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养温度为20-30℃。
32.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养温度为25-30℃。
33.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养温度为20-30℃。
34.根据权利要求15所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养温度为20-30℃。
35.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养时间为30-40小时。
36.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，培养时间为30-36小时。
37.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，接种量为5%-8%体积比。
38.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤（4）中，接种量为5%-8%体积比。
39.根据权利要求26所述的方法，其中，在步骤（4）中，接种量为5%-8%体积比。
40.根据权利要求31所述的方法，其中，在步骤（4）中，接种量为5%-8%体积比。
41.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，在培养5-9小时后流加含有碳源和氮源的培养基。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，在步骤（4）中，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为酵母粉。
43.根据权利要求41所述的方法，其中，在步骤（4）中，以质量体积比计，培养基含有30-60%葡萄糖和30-50%的酵母粉，余量为水。
44.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，所述含有碳源和氮源的培养基流加的速率为1:0.8-1:1.1。
45.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（3）中，以质量体积比计，所述的种子培养基包括酵母粉0.5-4%，蛋白胨1-4%和氯化钠0.8-2%，余量为水。
46.根据权利要求4-13任一项所述的方法，其中，在步骤（4）中，以质量体积比计，所述发酵的培养基包括葡萄糖1-4%，酵母粉 2-6%，谷氨酰胺 0.05-0.4%，磷酸氢二钾 0.05-0.08%，磷酸二氢钾 0.1-0.3%和氯化镁 0.05-0.2%，余量为水。
47.权利要求3-46任一项所述的方法发酵得到的谷氨酰胺酶，其中酶活为120-158U/mL。
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