CN109439601B - 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法，一株产碱性蛋白酶的菌株M‑35分类命名为芽孢杆菌，该菌株M‑35制备碱性蛋白酶的方法是：1、将菌株M‑35置于斜面保藏培养基斜面上28‑32℃下培养22‑26h，菌丝长满后挑取菌株M‑35接种于种子培养基中；2.将菌株M‑35接种于种子培养基中，25‑30℃、180rpm摇床培养24～36h，得到种子液；3、配制发酵培养基；4、接种；5、后处理；本发明提供了新筛选的一株产蛋白酶菌株，可有效利用该菌株制备碱性蛋白酶，方法简单，周期短，营养需求低，易生产制备，产品质量好，蛋白含量高，有显著的经济和社会效益。

Description

一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法
技术领域
本发明涉及微生物，特别是一种一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法。
背景技术
蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂，占酶制剂市场的65％以上，其中微生物产蛋白酶占据世界工业酶总量的40％。蛋白酶能够催化水解蛋白质肽键，按其反应最适pH可以分为碱性、中性和酸性蛋白酶。
碱性蛋白酶，指在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶，可水解肽键、酯键、酰胺键，是一种无毒、无副作用的蛋白质，属于丝氨酸型内切蛋白酶，是一类最适pH值偏碱性的蛋白酶，最适反应pH为9.0–11.0，广泛存在于动、植物及微生物中，最早发现于猪的胰脏中，其主要生产方法有直接提取法和微生物发酵法两种：从动植物中提取碱性蛋白酶，然后进行分离纯化；微生物发酵法：培养产量高的碱性蛋白酶产生菌。直接提取法操作简单，但是对原料要求高，并且所得酶制品比活力很低，提取过程中极易降低酶活力，不适合工业化生产。目前主要利用微生物发酵法生产碱性蛋白酶，主要有固态发酵法和液态发酵法。液态发酵法产酶率较高，并且耗能少，且简便了下游工作的分离提纯；而固态发酵法产酶周期长，酶比活力较低，产酶量少，加大了下一步分离提纯的难度。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，与动、植物来源的碱性蛋白酶相比，具有成本低、容易制备、适合大规模生产等优势，因此，微生物是碱性蛋白酶生产的重要来源，备受研究者关注，微生物碱性蛋白酶是当前市场上应用最广、产量最大的酶制剂之一。除主要用于加酶洗涤剂外，还可以应用于食品、医疗、制革、丝绸等行业。由于碱性蛋白酶的广泛用途以及产酶效率不高等原因, 一直以来市场都处于供不应求的现状。
我国自20世纪50年代开始筛选产碱性蛋白酶菌种，经过不断努力，在研究蛋白酶的生产和提高酶活力水平上有较大的进步，但是还存在着品种单一、酶的活性不高、价格昂贵等问题，目前用于工业化生产的菌种主要为芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌等，酶产量和其酶学性质都还不能满足现代工业特别是食品工业和洗涤剂工业发展的需求。目前我国较多地采用进口的碱性蛋白酶制剂，在大规模工业生产中用的碱性蛋白酶也还是主要依赖国外进口。因此，需要选育不同性状的优良高产菌株，才能满足工业生产的要求。
当前国内碱性蛋白酶高产菌株的选育主要用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，有关这些高产基因工程菌株的研究大多停留在实验室水平。自然界中分离出的产碱性蛋白酶的菌株其产酶活性一般都较低，（李鹏，2014）从舟山海域海泥中筛选到产碱性蛋白酶的海洋放线菌A20，其酶活达104.7U/mL，（程仕伟，2012）烟台近海土壤中筛选到一株产碱性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，其酶活达155 U/mL，（陈雅茜，2018）从发酵食品中分离出产碱性蛋白酶的短小芽孢杆菌，其酶活为43.67U/mL。新型碱性蛋白酶如具有较高pH适应性的碱性蛋白酶，或者能够水解多种底物的碱性蛋白酶，对多种底物均有降解效果，是近阶段碱性蛋白酶的研究热点，但如何筛选一种新的纯蛋白酶的菌株并用于制备碱性蛋白酶至今未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的是提供一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法，可有效解决新的产蛋白酶的菌株及利用该菌株制备碱性蛋白酶的问题。
本发明解决的技术方案是，一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法，所述的一株产碱性蛋白酶的菌株M-35分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），筛选于云南昆阳磷矿尾矿土壤，于2017年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.14618，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
该菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法是：包括以下步骤：1、将菌株M-35置于斜面保藏培养基（LB培养基）斜面上28-32℃下培养22-26h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基（LB培养基）是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
2. 将菌株M-35 (Bacillussp.)接种于种子培养基中，25-30℃、180rpm摇床培养24～36h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl10.0 g和水1000 mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
3、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0 g，乙酸钠2.0～5.0 g，K2HPO4 5.0～15 .0g，KCl 0.2～0.5 g，MnSO4 0.2～0.5 g，Tween-80 0.2～0.5 g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
4、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，25-35℃，120rpm下摇床培养42-60h，得发酵碱性蛋白液；
5、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
本发明提供了新筛选的一株产蛋白酶菌株，可有效利用该菌株制备碱性蛋白酶，方法简单，周期短，营养需求低，易生产制备，产品质量好，蛋白含量高，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明温度对酶活力及稳定性的影响曲线图；
图2为本发明pH值对酶活力及稳定性的影响曲线图；
图3为本发明金属离子对酶活力影响图。
具体实施方式
以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式做详细说明。
由上述技术方案给出，本发明的目的之一是提供一株具有较高pH适应性的产生碱性蛋白酶的高产菌株；能够水解多种底物的碱性蛋白酶，对多种底物植物蛋白、羽毛粉等均有降解效果，具有创新颖，能在碱性条件下高效水解蛋白质；
本发明的目的之二是提供一种利用菌株M-35生产碱性蛋白酶的方法；所述的菌株M-35是采自于云南昆阳磷矿尾矿、土壤样品，用梯度稀释法分离、纯化菌株。灭菌牙签挑取单菌落点接于初筛平板，30℃培养48h，根据产生的水解圈半径与菌落半径比值的大小，选取比值较大的菌株。先接种于种子培养基，30℃、180rpm培养24h后，将种子液以5％接种量加入到基础发酵培养基，每250mL 摇瓶装发酵培养基100mL，发酵72h后离心，取上清，测定发酵液中蛋白酶活性，选取活性最高的菌株M-35为发酵菌株。
M-35在LB培养2天，菌落白色，中间有凸起，表面有褶皱。参照《常见细菌系统鉴定手册》，对M-35菌株进行生理生化鉴定：该菌革兰氏染色、V.P. 、七叶灵、葡萄糖检测阳性；氧化酶、MR、脲酶检测阴性；能水解酪蛋白、明胶、淀粉、使硝酸盐还原；不形成吲哚。
以M-35基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)、1492R (5’– GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增菌株的16S rDNA片段，获得长度约为1.5 kb的序列，测序结果基因序列见序列表，根据所得到序列在ezbiocloud网站上进行序列比对分析后，选择相关的参考菌株序列，进行聚类分析，构建系统发育树，分析显示M-35与Bacillus siamensis KCTC 13613(T)在同一分支，二者序列相似性为99.86%，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），于2017年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.14618，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
本发明所筛选的菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法由以下实施例给出：
实施例1：包括以下步骤：1、将菌株M-35置于斜面保藏培养基（LB培养基）斜面上28℃下培养22h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基（LB培养基）是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
2. 将菌株M-35 (Bacillussp.)接种于种子培养基中，25℃、180rpm摇床培养24h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0 g和水1000 mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
3、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0 g，乙酸钠2.0～5.0 g，K2HPO4 5.0～15 .0g，KCl 0.2～0.5 g，MnSO4 0.2～0.5 g，Tween-80 0.2～0.5 g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
4、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，25℃，120rpm下摇床培养60h，得发酵碱性蛋白液；
5、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
实施例2：包括以下步骤：1、将菌株M-35置于斜面保藏培养基（LB培养基）斜面上:30℃下培养24h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基（LB培养基）是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
2. 将菌株M-35 (Bacillussp.)接种于种子培养基中，27℃、180rpm摇床培养30h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0 g和水1000 mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
3、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0 g，乙酸钠2.0～5.0 g，K2HPO4 5.0～15 .0g，KCl 0.2～0.5 g，MnSO4 0.2～0.5 g，Tween-80 0.2～0.5 g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
4、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，30℃，120rpm下摇床培养54h，得发酵碱性蛋白液；
5、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
实施例3：包括以下步骤：1、将菌株M-35置于斜面保藏培养基（LB培养基）斜面上32℃下培养26h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基（LB培养基）是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
2. 将菌株M-35 (Bacillussp.)接种于种子培养基中，30℃、180rpm摇床培养36h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10 .0g和水1000 mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
3、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0 g，乙酸钠2.0～5.0 g，K2HPO4 5.0～15 .0g，KCl 0.2～0.5 g，MnSO4 0.2～0.5 g，Tween-80 0.2～0.5 g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
4、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，35℃，120rpm下摇床培养42h，得发酵碱性蛋白液；
5、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
本发明的菌株和生产的碱性蛋白酶经实地试验和应用，取得了非常好有益技术效果，有关资料如下：通过对此酶酶学性质的进一步分析研究，最适反应温度为60℃，在40-60℃内酶活稳定，70℃保温2h仍能保持20%酶活；该蛋白酶在pH5-12均有活性，且在pH7-11左右表现出较高活力， pH6-11条件下都能保持很好的pH稳定性，可为国内应用行业的科研人员提供一种新的蛋白酶品种，推动酶制剂应用技术的快速发展。
发酵液碱性蛋白酶达到2600U/mL，产品达到GB/T 23527-2009国家标准50000 U/g以上。本发明原料丰富，成本低，无环境污染，所用设备、培养基价格便宜，方法简单，易操作，便于生产，有很好的经济和社会效益。
本发明所用的酶测定方法：参照GB/T 23527-2009方法。
酶活力定义为：1mL酶液（或1g固体酶粉）在一定温度与pH 条件下1min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，即为1个酶活单位，以u/mL（u/g）表示。
试验1：高产碱性蛋白酶菌株的筛选、鉴定及优化：
采自于云南昆阳磷矿尾矿、土壤等样品，用梯度稀释法分离、纯化菌株。灭菌牙签挑取单菌落点接于初筛平板，30℃培养48h，根据产生的水解圈半径与菌落半径比值的大小，选取比值较大的菌株。先接种于种子培养基，30℃、180rpm培养24h后，将种子液以5％接种量加入到基础发酵培养基，每250mL 摇瓶装发酵培养基100mL，发酵72h后离心，取上清，测定发酵液中蛋白酶活性，选取活性最高的菌株M-35为发酵菌株。
M-35在LB培养2天，菌落白色，中间有凸起，表面有褶皱。参照《常见细菌系统鉴定手册》，对M-35菌株进行生理生化鉴定：该菌革兰氏染色、V.P. 、七叶灵、葡萄糖检测阳性；氧化酶、MR、脲酶检测阴性；能水解酪蛋白、明胶、淀粉、使硝酸盐还原；不形成吲哚。
以M-35基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’)、1492R (5’– GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增菌株的16S rDNA片段，获得长度约为1.5 kb的序列，测序结果基因序列见附图。根据所得到序列在ezbiocloud网站上进行序列比对分析后，选择相关的参考菌株序列，进行聚类分析，构建系统发育树，分析显示M-35与Bacillus siamensis KCTC 13613(T)在同一分支，二者序列相似性为99.86%。
综合菌株的形态特征、生理生化特性、16S rDNA 序列以及系统进化树的结果，可以将分离菌株归为Bacillus siamensis，命名为M-35 (Bacillussp.)。
所述初筛培养基：脱脂奶粉1.0％，蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，NaCl 1.0％，琼脂1.5％，pH自然。
所述复筛培养基：酪蛋白1.0％，葡萄糖1.0％，K2HPO4 0.1％，KCl0.05 %，MgSO40.05％，pH7.0。
所述种子培养基：蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，NaCl1.0 ％，pH7.0。
所述基础发酵培养基：豆粕1.0%，葡萄糖0.5%，K2HPO40.5％，KCl0.05 %，MgSO40.05％，pH7.0。
M-35菌株发酵培养基优化及性质研究
1.1不同培养基成分对菌株产酶的影响
分别选取葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖、麦芽糖、玉米粉、乙酸钠、柠檬酸钠作为基础发酵培养基的碳源，发酵3d，测试发酵液酶活，结果表明，用可溶性淀粉和乙酸钠作为碳源，发酵液酶活最高，因此，本发明优选发酵培养基中碳源为酪蛋白、乙酸钠。添加量优选为可溶性淀粉0.5-1.0％，乙酸钠0.2-0.5%。
分别以蛋白胨、干酪素、牛肉膏、酵母粉、脱脂奶粉、明胶、豆粕、黄豆粉、硝酸钠、硫酸铵、尿素作为氮源。结果表明豆粕、干酪素、豆粉对菌株产酶有明显的促进作用，特别是以黄豆粉作为氮源时产酶活性最高。本发明发酵培养基中的氮源优选为黄豆粉，添加量优选为1.0-1.5%。
分别加入K2HPO4加入0、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0g/100mL培养基，结果表明，磷对该菌株的产酶效果影响非常明显，K2HPO4加入量在0.5-1.5%时，产酶活性较高。
作为发酵培养基的产酶促进剂，可适量添加吐温系列的表面活性剂，添加量依据培养基的不同而定，只要适合促进培养过程产生本发明的蛋白酶即可。本发明发酵培养基中的产酶促进剂优选为Tween-80，用量优选为发酵培养基总量的0.02-0.05％。
将培养基的初始pH分别调节为3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，30℃条件下培养72h，确定发酵产酶培养基的最适初始pH值为7.0。
通过单因素分析和正交试验，优化本发明发酵培养基的成分及重量组成为：黄豆粉1.0-1.5%，可溶性淀粉0.5-1.0％，乙酸钠0.2-0.5%，K2HPO4 0.5-1.5%，KCl 0.02-0.05%，MnSO4 0.02-0.05％，Tween-80 0.02-0.05％，pH7.0。
1.2发酵条件对菌株产酶的影响
发酵温度优化：设置25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃4个温度梯度，对菌株进行发酵培养，确定发酵温度为30 ℃时，所产蛋白酶活性最高。
不同摇床转速对产酶的影响：设置摇床转速0r、40r、80r、120r、150r、180r、200r/min。随着摇床转速的增加，产酶量增多，120r/min时产酶量最大，再增大转速，产酶量有所下降。优选发酵条件为转速120r/min。
培养时间对产酶的影响：在优化的发酵条件下，用优化后的培养基100mL放入250mL三角瓶，120r/min、30 ℃培养，测定培养时间与产酶进程的关系，每隔6 h测定一次培养基中蛋白酶的活力。该菌株在24 h后大量产酶，至54-60 h时，酶产量达到高峰，最高时达到2600U/mL，继续培养至90 h，活性仍保持在2000 U/mL以上。优选42-60 h为最佳培养时间。
500mL三角瓶装入300mL优化后的培养基，以5%的接种量接种种子液，120r/min、30℃培养54h，4℃、8000r/min、20min离心去除菌体，用80％硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r、20min离心收集沉淀。用磷酸缓冲液溶解沉淀。透析、-70℃冷冻过夜。冷冻干燥机预冷20min，放入机器冷冻干燥得到蛋白酶原粉。样品经活性检测，比酶活可以达到150万U/g
1.3碱性蛋白酶酶学的性质研究
蛋白酶的最适反应温度及温度稳定性：将酶粉用磷酸缓冲液稀释至合适倍数，在不同温度下与底物进行反应10 min，温度梯度设置为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80℃，测定蛋白酶的活力。本发明制备的蛋白酶最适反应温度为60℃，在40-60℃内酶活稳定。70℃下保温2h仍能保持20%酶活（图1）。
蛋白酶的最适pH及pH稳定性：配制pH 5.0（磷酸氢二钠-柠檬酸）、pH 6.0（磷酸氢二钠–磷酸二氢钠）、pH 7.0、8.0（磷酸氢二钠–磷酸二氢钠）、pH 9.0（硼酸–硼砂缓冲液）、pH10.0、pH 11.0、pH12.0（甘氨酸-氢氧化钠），分别用缓冲液配不同pH的1％酪蛋白溶液作为底物，测定蛋白酶酶活。将稀释酶液分别加入到不同pH缓冲液中，4℃保存24h后，测定酶活力。
本发明制备的蛋白酶酶最适pH值如图2所示，本发明菌株分泌的蛋白酶在pH5-12均有活性，且在pH7-11左右表现出较高活力，属于碱性蛋白酶；pH6-11条件下存放都能保持90%以上的酶活。
各种抑制剂对酶活的影响：在酶的最佳反应温度和最佳反应pH 值条件下，于反应体系中分别加入2 μmol/mL的SDS、EDTA、PMSF、TWEEN-80、DDT、Ag+、Mg2+、Ca2+、Co2+、Fe2+、K+、Mn2+、Zn2+、Ba2+、Na+，测定酶活。并以未加抑制剂的酶活力为100％，计算加入化学成份后的残余活力。各种抑制剂对本发明制备的蛋白酶的酶活的影响结果见图3。从图中可以看出，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对酶的抑制作用最强；金属蛋白酶抑制剂EDTA对本发明制备的蛋白酶活性有抑制作用。能明显提高蛋白酶活性。各种金属离子对蛋白酶活性的影响也存在差异，其中以Ag+的抑制作用最强，其次为Fe2+、Ba2+ 、Mg2+，而Mn2+有较强的促进作用。还原剂如二硫苏糖醇DTT及表面活性剂Tween-80对本发明所述的碱性蛋白酶活性有明显的促进作用。
试验2：本发明所制备碱性蛋白酶水解植物蛋白效果评价：
采用M35所产碱性蛋白酶对豆粕进行水解：豆粕过40目筛，称取50g加入到500mL水配制成固液比1 : 10的豆粕蛋白悬液，调节溶液pH值为11，加入M-35碱性蛋白酶0.5g，在55°C条件下酶解4h，酶解过程维持其pH值不变。结果显示，豆粕蛋白经碱性蛋白酶水解后的三氯乙酸氮溶指数由原来的7.8%増加到30.8%，说明豆粕蛋白经M-35碱性蛋白酶酶解后，其短肽含量増加4倍左右。
采用M-35所产碱性蛋白酶对花生粕进行水解：称取50g花生粕加入到1000 mL水配制成固液比1: 20的花生粕蛋白悬液，调节溶液pH值为8，加入M-35碱性蛋白酶0.5g， 60°C条件下酶解3h。此条件下花生粕的水解度可达30.69%。
M35酶解制备小麦麸皮蛋白效果评价：称取小麦麸皮50g，配制固液比1 : 10的小麦麸皮蛋白悬液，pH值为10.0条件下，加入M-35碱性蛋白酶0.5g，50℃下酶解5 h。在此条件下，蛋白得率可以达到79.88%。
试验3：本发明所制备碱性蛋白酶酶解加工羽毛粉效果评价：
称取5g剪碎的羽毛粉放入锥形瓶，加入100 mL蒸馏水，摇匀，加入NaOH调节pH至13.0，放入高压锅112kPa高压蒸煮1h。加入M-35碱性蛋白酶0.5g，在调节pH后放人55℃水浴锅中反应4 h。取出20 mL溶液与20 mL三氯乙酸混合加入离心管中，4000r/min离心15min后取出上清液，测得上清液体积及反应后的总体积。将得到的上清液和离心后的沉淀放人烘箱内烘至恒重后测量上清液和沉淀的重量。将所得的上清液和沉淀烘干后的固体称取0.1000g．运用凯氏定氮法的方法测得其中所包含的蛋白含量。测得肽蛋白与羽毛粉中总的蛋白含量比为81.73％。说明角蛋白已经大部分转化成了肽蛋白。
试验4：本发明所制备碱性蛋白酶脱毛效果评价：对M-35在制革浸水、脱毛、软化应用等方面进行研究，并与传统酶制剂在脱毛效果和软化效果等方面进行了对比。结果表明：碱性蛋白酶M-35用于制革浸水，可使皮快速回软，同时抑制细菌繁殖，比中性酶更安全可靠；在pH10条件下，酶浓度90U／g，温度30-40℃用于脱毛，毛孔清晰，粒面完整，脱毛快，效果较好；在pH10条件下，酶浓度30-90U／g，软化皮毛3-4小时，作用温和，皮面洁白，柔软，丝绸感强。利用酶法脱毛比传统灰碱法脱毛的污染更小，且反应条件温和、水解效率高，可以有效提高制革工业的生产效率和经济效益。对减少环境的污染也做出了积极的贡献。
本发明所制备碱性蛋白酶发酵液碱性蛋白酶达到2500-2700U/mL，产品达到GB/T23527-2009国家标准50000 U/g以上。
序列表
<110> 河南省科学院生物研究所有限责任公司
<120> 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法
<130> 2016
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌属(Bacillus sp. )
<400> 1
ggctggctcc aaaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120
cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagaa cagatttgtg 180
ggattggctt aacctcgcgg tctcgctgcc ctttgttctg cccattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300
cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420
actctgcccc cgaaggggac gtcctatctc taggattgtc agaggatgtc aagacctggt 480
aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540
caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600
gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta acacttagca ctcatcgttt acggcgtgga 660
ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg tcagttacag 720
accagagagt cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca 780
cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc aagttcccca gtttccaatg accctccccg 840
gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc tgcgagccct ttacgcccaa 900
taattccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960
tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtgc cgccctattt gaacggcact tgttcttccc 1020
taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga 1080
ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct 1140
cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctacg catcgtcgcc ttggtgagcc 1200
gttacctcac caactagcta atgcgccgcg ggtccatctg taagtggtag ccgaagccac 1260
cttttatgtc tgaaccatgc ggttcaaaca agcatccggt attagccccg gtttcccgga 1320
gttatcccag tcttacaggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc cgctaacatc 1380
agggagcaag ctcccatctg tccgctcgac tgc 1413

Claims (5)

1.一株产蛋白酶的菌株M-35，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），筛选于云南昆阳磷矿尾矿土壤，于2017年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.14618，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的一株产蛋白酶的菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法：其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将菌株M-35置于斜面保藏培养基斜面上28-32℃下培养22-26h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基为LB培养基，是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（2）、将菌株M-35接种于种子培养基中，25-30℃、180rpm摇床培养24～36h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g和水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（3）、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0g，乙酸钠2.0～5.0g，K2HPO4 5.0～15.0g，KCl 0.2～0.5g，MnSO4 0.2～0.5g，Tween-800.2～0.5g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
（4）、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，25-35℃，120rpm下摇床培养42-60h，得发酵碱性蛋白液；
（5）、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
3.根据权利要求2所述的一株产蛋白酶的菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法：其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将菌株M-35置于斜面保藏培养基斜面上28℃下培养22h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基为LB培养基，是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（2）、将菌株M-35接种于种子培养基中，25℃、180rpm摇床培养24h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g和水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（3）、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0g，乙酸钠2.0～5.0g，K2HPO4 5.0～15.0g，KCl 0.2～0.5g，MnSO4 0.2～0.5g，Tween-800.2～0.5g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
（4）、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，25℃，120rpm下摇床培养60h，得发酵碱性蛋白液；
（5）、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的一株产蛋白酶的菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法：其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将菌株M-35置于斜面保藏培养基斜面上:30℃下培养24h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基为LB培养基，是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（2）、将菌株M-35接种于种子培养基中，27℃、180rpm摇床培养30h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10g和水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（3）、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0g，乙酸钠2.0～5.0g，K2HPO4 5.0～15.0g，KCl 0.2～0.5g，MnSO4 0.2～0.5g，Tween-800.2～0.5g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
（4）、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，30℃，120rpm下摇床培养54h，得发酵碱性蛋白液；
（5）、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
5.权利要求1所述的一株产蛋白酶的菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法：其特征在于，包括以下步骤：
（1）、将菌株M-35置于斜面保藏培养基斜面上32℃下培养26h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基为LB培养基，是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（2）、将菌株M-35接种于种子培养基中，30℃、180rpm摇床培养36h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10g和水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；
（3）、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0g，乙酸钠2.0～5.0g，K2HPO4 5.0～15.0g，KCl 0.2～0.5g，MnSO4 0.2～0.5g，Tween-800.2～0.5g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；
（4）、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，35℃，120rpm下摇床培养42h，得发酵碱性蛋白液；
（5）、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
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