CN112342171B - 藤黄微球菌mj及其在蚕丝脱胶中的应用 - Google Patents

藤黄微球菌mj及其在蚕丝脱胶中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112342171B
CN112342171B CN202011345034.6A CN202011345034A CN112342171B CN 112342171 B CN112342171 B CN 112342171B CN 202011345034 A CN202011345034 A CN 202011345034A CN 112342171 B CN112342171 B CN 112342171B
Authority
CN
China
Prior art keywords
silk
micrococcus luteus
strain
degumming
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011345034.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112342171A (zh
Inventor
陈虹
梅婕
张建芬
谢广发
陆胤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Shuren University
Original Assignee
Zhejiang Shuren University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Shuren University filed Critical Zhejiang Shuren University
Priority to CN202011345034.6A priority Critical patent/CN112342171B/zh
Publication of CN112342171A publication Critical patent/CN112342171A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112342171B publication Critical patent/CN112342171B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/265—Micrococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01C—CHEMICAL OR BIOLOGICAL TREATMENT OF NATURAL FILAMENTARY OR FIBROUS MATERIAL TO OBTAIN FILAMENTS OR FIBRES FOR SPINNING; CARBONISING RAGS TO RECOVER ANIMAL FIBRES
    • D01C3/00—Treatment of animal material, e.g. chemical scouring of wool
    • D01C3/02—De-gumming silk

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种藤黄微球菌MJ及其在蚕丝脱胶中的应用，所述的应用为蚕丝于60℃的自来水中浸泡4–6h，沥干后投入藤黄微球菌MJ发酵制备的粗酶液中，于37–40℃、100‑150r/min条件下脱胶3–4h，脱胶结束后，蚕丝经水洗和干燥，得脱胶后的蚕丝。本发明提供的产蛋白酶的藤黄微球菌MJ菌株，生长快、易培养，发酵周期短；藤黄微球菌MJ菌株产蛋白酶活性高、水解丝胶专一性好。在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达223U/mL；利用藤黄微球菌MJ菌株发酵制备的蛋白酶粗酶液对生丝脱胶，练减率可以达到23.6％，脱胶率达到97.1％。

Description

藤黄微球菌MJ及其在蚕丝脱胶中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株藤黄微球菌(Micrococcus luteus)及其在蚕丝脱胶中的应用。
(二)背景技术
蚕丝主要由丝素纤维(占蚕丝重量的70％–80％)和包覆于其外围的丝胶及少量油脂、蜡质(占蚕丝重量的20％–30％)等组成。丝胶对真丝织物的光泽、手感、染色均匀性、染色牢度等有明显的不利影响；如果将蚕丝用作生物医学材料，丝素外层的丝胶和蜡质等杂质具有免疫原性风险。因此，在蚕丝的利用和加工过程中，通常需要进行脱胶处理，由生丝精炼为熟丝，但是，如果脱胶过度或脱胶不均匀，则会导致蚕丝纤维强度损失、光泽度降低、手感粗糙。
传统的蚕丝脱胶方法有碱脱胶、皂碱脱胶、酸脱胶、高温高压脱胶等方法，这些脱胶方式虽然效率高、但如果工艺条件控制不当，会造成丝纤维损伤，导致蚕丝光泽度降低、手感粗糙；而且处理后的废水不利于环境保护。酶法脱胶是利用蛋白酶在适当的温度下水解去除丝胶蛋白。由于蛋白酶对丝素的水解活性弱，不会损伤丝素，脱胶后蚕丝纤维表面光洁、透明，而且有很强的丝鸣感。酶法脱胶生产的蚕丝质量优于其他脱胶方法。
目前，有较多关于蚕丝酶法脱胶工艺的研究，但使用的多是商品化的纯酶，如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，由于这些酶来源于动物或植物，成本较高，在蚕丝脱胶中未能得到工业化应用。自然界中有大量能分泌蛋白酶的微生物，微生物具有种类多、繁殖快、分泌的胞外酶易收集等特点，所以开发微生物来源的蛋白酶用于生丝脱胶具有更高的可行性和经济价值。
家蚕的蚕蛾出茧时，口腔吐出溶茧酶溶液，水解粘着茧丝的丝胶及部分丝素，使蚕茧结构变为疏松，然后用胸足拨开已松解的茧丝，形成一个孔，再从孔中钻出。溶茧酶成分来源于蚕蛾的下腭和中肠，不同来源的酶协同作用水解茧层。来自下腭的溶茧酶成分由蚕蛾自己分泌，而来自中肠的溶茧酶可能由肠道中的微生物产生。蚕蛹在羽化过程中，肠道微生物生长非常旺盛，产生的蛋白酶活性也很强，可能具有较高的丝胶水解活性。
为了获得活力高、生产成本低、水解丝胶专一性强的蛋白酶，本发明从羽化前的蚕蛹肠道中分离产蛋白酶的微生物，经过诱变和筛选，优化产酶发酵条件，发酵制备粗酶液中，不仅含有蛋白酶，还有脂肪酶、多糖水解酶，用于蚕丝脱胶，脱胶效率高、熟丝的品质优于传统化学方法脱胶，而且酶的成本显著低于商品化纯酶。
(三)发明内容
本发明提供一株新的蛋白酶产生菌—藤黄微球菌(Micrococcus luteus)MJ菌株，该菌株发酵制备的蛋白酶活性高、水解丝胶专一性好；利用该菌株发酵制备的粗酶液对蚕丝脱胶，可以获得较高的练减率。
本发明采用的技术方案为：
本发明提供一株新的蛋白酶产生菌—藤黄微球菌(Micrococcus luteus)MJ菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61176，保藏日期2020年 9月4日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
本发明所述藤黄微球菌MJ菌株是从羽化前的家蚕蚕蛹肠道中分离，并经过紫外线诱变，从突变株中筛选获得。所述的藤黄微球菌MJ菌株培养特征如下：该菌株接种于 LB平板培养基上，37℃下培养24h后，可见淡黄色菌落，菌落不透明，边缘整齐，表面光滑(菌落照片见附图1)。所述藤黄微球菌MJ菌株菌体特征如下：革兰氏阳性，球状，直径0.8–1.2μm。菌体常呈单个、成双、四联排列，容易不规则成团(革兰氏染色后的光学显微镜照片见附图2)。所述藤黄微球菌MJ菌株的16S rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还涉及所述的藤黄微球菌(Micrococcus luteus)MJ菌株在蚕丝脱胶中的应用，具体的应用为：蚕丝(即未脱胶的生丝)于60℃的自来水中浸泡4–6h，沥干后投入藤黄微球菌MJ发酵制备的粗酶液中，于37–40℃、100-150r/min条件下脱胶3–4h，脱胶结束后，蚕丝经水洗和干燥，得脱胶后的蚕丝(即熟丝)。
进一步，所述的蚕丝加入量按粗酶液体积计20–50g/L。
进一步，所述的水洗和干燥，是脱胶后蚕丝经60℃的自来水洗涤2–3次，再于105℃烘干，自来水的体积按蚕丝重量计50–100mL/g。
本发明还涉及所述藤黄微球菌MJ在发酵制备蛋白酶中的应用，所述的应用是将藤黄微球菌MJ菌株接种入产酶培养基，于35–37℃、200–250r/min发酵24–36h，得干菌体浓度为2.27–3.44g/L，蛋白酶活力为138–223U/mL的发酵液。所述产酶培养基终浓度组成为：蛋白胨15–20g/L，麦芽浸粉5–10g/L，酵母浸出粉5–10g/L，NaCl 5–10g/L， MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4。
进一步，所述藤黄微球菌MJ菌株在产酶培养前，通常需要先经活化培养，然后经种子培养、获得种子液再接入产酶培养基发酵，具体步骤如下：
(1)活化培养：将藤黄微球菌MJ菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养24–36 h，得到活化后的斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4；
(2)种子培养：接种环挑取步骤(1)活化后的斜面菌体2–3环，接种至LB液体培养基中，于35℃、200–250r/min振荡条件下培养12–16h，得到干菌体浓度为1.37–1.43 g/L种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4；
(3)产酶发酵：将步骤(2)种子液以体积浓度2％–3％的接种量，移种到产酶培养基中，于35–37℃、200–250r/min振荡条件下培养24–36h，得到含蛋白酶的发酵液。
进一步，优选所述的产酶培养基组成为：蛋白胨20g/L，麦芽浸粉10g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，溶剂为水，初始pH为7.4。
与现有技术相比，本发明从蚕蛹肠道中获得了一株产蛋白酶的微生物菌株，利用该菌株发酵制备的粗酶液用于生丝脱胶，有益效果主要体现在：(1)本发明提供的产蛋白酶的藤黄微球菌MJ菌株，生长快、易培养，发酵周期短；(2)藤黄微球菌MJ菌株产蛋白酶活性高、水解丝胶专一性好。在优选的条件下，摇瓶发酵的酶活可达223U/mL； (3)利用藤黄微球菌MJ菌株发酵制备的蛋白酶粗酶液对生丝脱胶，练减率可以达到 23.6％，脱胶率达到97.1％。
(四)附图说明
图1为LB平板培养基上MJ菌株的菌落形态照片。
图2为光学显微镜下MJ菌株的菌体形态照片。
图3为依据微球菌属16S rDNA序列同源性比较构建的系统发育树。
图4为测定蛋白酶活力的A660—酪氨酸浓度标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述的生丝是桑蚕茧缫丝后所得的产品(白厂丝)，本发明实验所用的生丝的含胶率为24.3％。生丝的含胶率按中华人民共和国国家标准GB/T32015-2015(丝绸练减率试验方法)测定。
所述的练减率计算公式为：
Figure BDA0002799588230000041
式中，m0为脱胶前的生丝干重；m1为脱胶后的熟丝干重。
所述的脱胶率计算公式为：
Figure BDA0002799588230000042
实施例1：产蛋白酶菌株的分离与筛选
所述的藤黄微球菌MJ菌株的野生菌株分离和筛选方法如下：
(1)平板分离：1只蚕茧剪破，取出蚕蛹，于体积浓度75％的乙醇水溶液中室温 (25℃左右)浸泡1min后取出，剪去头部，剖开腹腔取出中肠；将中肠于无菌研钵，加入1mL无菌生理盐水研磨至匀浆；将匀浆液用无菌生理水梯度稀释至1×105–1×107倍。吸取0.1mL的1×105、1×106、1×107倍的3个稀释度溶液，涂布到脱脂牛奶平板培养基上，37℃恒温箱培养至菌落数不再增加。挑取周围有透明圈的菌落，划线接种于新鲜的LB平板培养基上，37℃培养至长出单菌落，再挑取单菌落接种于LB斜面培养基。共获得6个菌落周围有透明圈的菌株，分别编号(见表1)；
(2)产酶发酵：分别挑取上述6个菌株的斜面培养的菌体2环，接入100mL的初始产酶培养基中，于35℃、200r/min摇床中发酵培养24h，将发酵液5000r/min离心 10min，上清液即为粗酶液；
(3)脱胶能力筛选：1g生丝于60℃自来水中浸泡4h后，沥干后投入一只三角瓶，加50mL上述各菌株的粗酶液(生丝加量20g/L)，于35℃、100r/min条件下脱胶3h。脱胶结束后，蚕丝用60℃、100mL自来水漂洗2次，105℃烘干后称重。
不同菌株粗酶液的蛋白酶活力和对生丝脱胶的练减率见表1，可见SJM2菌株发酵制备的粗酶液蛋白酶活力最高，用于生丝脱胶，练减率也最高，所以选择该菌株作为生丝脱胶应用的菌种。
表1不同菌株产蛋白酶活力和生丝练减率比较
Figure BDA0002799588230000043
所述的蚕茧为杭州地区饲养的春蚕结茧后14d的蚕茧(结茧时间2020年5月2日)。
所述脱脂牛奶平板培养基配制方法为：首先配制2倍浓度的LB培养基，即蛋白胨20g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 20g/L，琼脂粉40g/L，溶剂为水，pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌20min。灭菌结束后冷却至50℃，加入等体积的50℃保温的无菌脱脂牛奶，混合均匀倒入无菌培养皿，冷却后备用。
所述LB斜面培养基和LB平板培养基组成相同，终浓度组成及配制方法为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 7.2。培养基加热至琼脂溶化后分装试管或三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后搁置斜面或倒入无菌培养皿。
所述初始产酶培养基终浓度组成及配制方法为：蛋白胨15g/L，麦芽浸粉5g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。250-mL 三角瓶装100mL，8层纱布扎口，121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例2：产酶菌株的分类鉴定
SJM2菌株的培养特征如下：该菌株接种在LB平板上，37℃下培养24h后，可见乳白色菌落，菌落不透明，边缘整齐，表面光滑(菌落照片见图1)。所述SJM2菌株的菌体特征如下：革兰氏阳性，球状，直径0.8–1.2μm。菌体常呈单个、成双、四联排列，容易不规则成团，革兰氏染色后的光学显微镜照片见附图2。
提取SJM2菌株的总DNA，利用细菌通用16S rDNA引物进行PCR扩增，获得该菌株的16S rDNA片段，经测序，片段的序列大小为1452bp，具体序列见SEQ ID NO.1。
将SEQ ID NO.1序列在NCBI(National Center for Biotechnology InformationUSA， NCBI)上进行BLAST比对，与35株已分类到种的微球菌有99％以上的同源性，但没有同源性达到100％的菌株。依据16S rDNA序列，绘制的该菌株与微球菌属不同种的系统发育树(图4)显示，该菌株与藤黄微球菌亲缘关系较近。SJM2菌株的形态也符合藤黄微球菌特征，所以可以确定该菌株为一株藤黄微球菌(Micrococcus luteus)。
实施例3藤黄微球菌的诱变选育
以蛋白酶活力大小为指标，对藤黄微球菌SJM2菌株进行紫外诱变，筛选获得藤黄微球菌MJ菌株。
(1)菌体制备：20mL的LB液体培养基中，接入藤黄微球菌SJM2菌株斜面菌体，于37℃、200r/min振荡条件培养12h。取1mL菌液于离心管中，5000r/min离心5min，弃上清液，加入1mL无菌生理盐水重悬菌体，再次离心收集菌体，如此重复洗涤菌体 2次后，用20mL无菌生理盐水重悬菌体于100mL三角瓶备用。所述的LB液体培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)紫外诱变：取直径6cm无菌培养皿6副，分别加入上述菌悬液1mL。打开培养皿盖，在30W紫外灯下距离30cm处边搅拌边照射，分别照射0s、30s、60s、90s、 120s、150s。完毕后将各菌液用无菌生理盐水以10倍梯度稀释1×104–1×107倍，取0.1mL 稀释菌液涂布LB平板培养基，黑布包裹平板于37℃下培养24h。所述的LB平板培养基组成和制备方法同实施例1。
(3)摇瓶筛选：挑取致死率在90％以上LB平板上的单菌落，转接LB斜面培养基，37℃培养24h后，再挑取菌体接种初始产酶培养基，于37℃，200r/min的摇床中培养24h，测定蛋白酶活力，从中筛选蛋白酶活力较出发菌株显著提高的突变菌株。所述的LB斜面培养基、初始产酶培养基的组成和制备方法同实施例1。
经过2轮筛选，获得一株编号为SJM2-54的菌株，发酵粗酶液的蛋白酶活力为197U/mL，较出发菌株提高了42.8％。按实施例1方法，用该菌株发酵制备的粗酶液对生丝脱胶，练减率为20.1％，较出发菌株提高了36.7％。SJM2-54菌株经过转接传代5次，粗酶液的蛋白酶活力波动范围小于10％，说明该菌株遗传稳定性良好。
将SJM2-54菌株重新编号为MJ，即藤黄微球菌MJ(Micrococcus luteusMJ)菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61176，保藏日期2020年 9月4日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
所述蛋白酶活力测定的方法为：
取4支试管分别编号1、2、3、4；先在4支试管中分别加入用pH 8.0的Tris-HCl 缓冲液稀释20～50倍的酶液1mL；然后，1号试管中加入TCA终止液2mL，2、3、4 加入20mg/mL酪蛋白水溶液1mL；将4支试管一起放入37℃的恒温水浴中反应10min 后，1号试管加入1mL、20mg/mL酪蛋白水溶液，作为空白对照。2、3、4号试管立刻加入TCA终止液2mL终止反应。将4支试管中的反应液8000g离心5min，分别取出1mL上清液，加入5mL浓度为0.4mol/L的Na2CO3水溶液，再加入1mL福林酚试剂快速混匀；于37℃保温显色30min后，在660nm波长处测定吸光值A660。
测出的2、3、4号试管样品A660平均值代入以下公式计算被测蛋白酶的活力。
Figure BDA0002799588230000061
式中：A＝660nm处吸光度值；K＝吸光常数，由酪氨酸浓度-A660标准曲线算得；n＝酶液稀释倍数；10为反应时间10min；4为反应体系4mL。
所述的pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制方法为：500mL的0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与292mL的0.1mol/L盐酸(HCl)混合后，用蒸馏水定容至1L。所述的TCA终止液的配制方法为：三氯乙酸18g，无水乙酸钠30g，冰醋酸30mL，用蒸馏水定容至1L。
所述的酪氨酸浓度-A660标准曲线绘制方法为：取浓度为0、10、20、30、40、50μg/mL的酪氨酸水溶液各1mL于6支试管中，各加入0.4mol/L的Na2CO3水溶液5mL，福林酚试剂1mL，于漩涡振荡器上混匀30s后，静置于37℃的恒温水浴锅内显色30min。显色结束后，在660nm波长处测定吸光值A660。以测得的A660为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线见附图4，由线性拟合公式计算得K值为105.2。
实施例4：藤黄微球菌MJ应用于生丝脱胶工艺1
用藤黄微球菌MJ菌株发酵制备粗酶液，并应用于生丝脱胶方法可按以下步骤操作：
(1)将4℃冰箱保藏的藤黄微球菌MJ菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养 24h，得到藤黄微球菌MJ菌株的活化斜面。所述的LB斜面培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后的斜面菌体2环，接种至50mL的LB液体培养基中，于35℃、200r/min振荡条件下培养12h，得到干菌体浓度为1.37g/L的种子液。所述LB液体培养基组成和制备方法为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.2，溶剂为水，初始pH为7.2。250-mL三角瓶装50mL，8层纱布扎口， 121℃高压蒸汽灭菌20min。
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度2％的接种量，移种到初始产酶培养基中，于 35℃、200r/min振荡条件下培养24h，得干菌体浓度为2.27g/L的发酵液；所述初始产酶培养基组成为：蛋白胨15g/L，麦芽浸粉5g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L， MgSO4·7H2O 1.0g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。250-mL的三角瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；
(4)将步骤(3)制备的发酵液于4℃条件下5000r/min离心10min，分离除去菌体，得澄清的蛋白酶粗酶液，蛋白酶活力为202U/mL。
(5)5g生丝于60℃自来水中浸泡6h后，沥干后投入一只500-mL三角瓶中，加 250mL步骤(4)制备的粗酶液(生丝加量20g/L)，于37℃、100r/min条件下脱胶3h。脱胶结束后，蚕丝用60℃、250mL的自来水漂洗2次，105℃烘干后称重。
按上述方法，生丝的练减率为19.8％，脱胶率为81.5％。
实施例5：藤黄微球菌MJ应用于生丝脱胶工艺2
用藤黄微球菌MJ菌株发酵制备粗酶液，并应用于生丝脱胶方法可按以下步骤操作：
(1)将4℃冰箱保藏的藤黄微球菌MJ菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养 24h，得到藤黄微球菌MJ菌株的活化斜面。所述的LB斜面培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后的斜面菌体3环，接种至50mL的LB液体培养基中，于35℃、250r/min振荡条件下培养18h，得到干菌体浓度为1.43g/L的种子液。所述LB液体培养基组成和制备方法同实施例4。
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度3％的接种量，移种到产酶培养基中，于37℃、250r/min振荡条件下培养36h，得干菌体浓度为3.48g/L的发酵液；所述产酶培养基组成为：蛋白胨20g/L，麦芽浸粉10g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。250-mL三角瓶装100mL，8层纱布扎口，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(4)将步骤(3)制备的发酵液于4℃条件下5000r/min离心10min，分离除去菌体，得澄清的粗酶液，其蛋白酶活力为223U/mL。
(5)12.5g生丝于60℃自来水中浸泡6h后，沥干后投入一只500-mL的三角瓶，加250mL步骤(4)制备的粗酶液(生丝加量50g/L)，于37℃、150r/min条件下脱胶 4h。脱胶结束后，蚕丝用60℃、625mL的自来水漂洗3次，105℃烘干后称重。
按上述方法，生丝的练减率为23.8％，脱胶率为97.9％。
实施例6：藤黄微球菌MJ应用于生丝脱胶工艺3
用藤黄微球菌MJ菌株发酵制备粗酶液，并应用于生丝脱胶方法可按以下步骤操作：
(1)将4℃冰箱保藏的藤黄微球菌MJ菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养 24h，得到藤黄微球菌MJ菌株的活化斜面。所述的LB斜面培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后的斜面菌体3环，接种至50mL的LB液体培养基中，于35℃、250r/min振荡条件下培养18h，得到干菌体浓度为1.43g/L的种子液。所述LB液体培养基组成和制备方法同实施例4。
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度3％的接种量，移种到产酶培养基中，于37℃、250r/min振荡条件下培养36h，得干菌体浓度为3.44g/L的发酵液；所述产酶培养基组成为：蛋白胨20g/L，麦芽浸粉10g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，溶剂为水，初始pH为7.2。250-mL三角瓶装100mL，8层纱布扎口，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(4)将步骤(3)制备的发酵液于4℃条件下5000r/min离心10min，分离除去菌体，得澄清的粗酶液，其蛋白酶活力为218U/mL。
(5)50g生丝于60℃自来水中浸泡6h后，沥干后投入一只2-L的三角瓶，加1L 步骤(4)制备的粗酶液(生丝加量50g/L)，于37℃、150r/min条件下脱胶4h。脱胶结束后，蚕丝用60℃、2.5L的自来水漂洗3次，105℃烘干后称重。
按上述方法，生丝的练减率为23.6％，脱胶率为97.1％。
序列表
<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）
<120> 藤黄微球菌MJ及其在蚕丝脱胶中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1452
<212> DNA
<213> 藤黄微球菌(Microccocus luteus)
<400> 1
caggatgaac gctggcggcg tgcttaacac atgcaagtcg aacgatgaag cccagcttgc 60
tgggtggatt agtggcgaac gggtgagtaa cacgtgagta acctgccctt gactctggga 120
taagcctggg aaactgggtc taataccgga taggaacgtc caccgcatgg tggttgttgg 180
aaagatttat cggtcatgga tggactcgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct 240
caccaaggcg acgacgggta gccggcctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg 360
atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcagtaggga 420
agaagcgaaa gtgacggtac ctgcagaaga agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt agggtgcgag cgttatccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg 540
tttgtcgcgt ctgtcgtgaa agtccggggc ttaaccccgg atctgcggtg ggtacgggca 600
gactagagtg cagtagggga gactggaatt cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc 660
aggaggaaca ccgatggcga aggcaggtct ctgggctgta actgacgctg aggagcgaaa 720
gcatggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg ttgggcacta 780
ggtgtgggga ccattccacg gtttccgcgc cgcagctaac gcattaagtg ccccgcctgg 840
ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga 900
gcatgcggat taattcgatg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tgttctcgat 960
cgccgtagag atacggtttc ccctttgggg cgggatcaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020
agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gttccatgtt 1080
gccagcacgt aatggtgggg actcatggga gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg 1140
ggacgacgtc aaatcatcat gccccttatg tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg 1200
gtacaatggg ttgcgatact gtgaggtgga gctaatccca aaaagccggt ctcagttcgg 1260
attggggtct gcaactcgac cccatgaagt cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac 1320
gctgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcaagtcac gaaagtcggt 1380
aacacccgaa gccggtggcc taacccttgt ggggggagcc gtcgaaggtg ggaccagcga 1440
ttgggactaa gt 1452

Claims (8)

1.藤黄微球菌(Micrococcus luteus)MJ，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:61176，保藏日期2020年9月4日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510075。
2.一种权利要求1所述藤黄微球菌MJ在蚕丝脱胶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：将蚕丝于60℃的自来水中浸泡4–6h，沥干后投入藤黄微球菌MJ经发酵制备的粗酶液中，于37～40℃、100-150r/min条件下脱胶3–4h，脱胶结束后，蚕丝经水洗和干燥，得脱胶后的蚕丝。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述蚕丝加入量按粗酶液体积计20–50g/L。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的水洗和干燥，是脱胶后蚕丝经60℃的自来水洗涤2–3次，再于105℃烘干，自来水的体积按蚕丝重量计50–100mL/g。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述粗酶液按如下方法制备：将藤黄微球菌MJ菌株接种入产酶培养基，于35–37℃、200–250r/min发酵24–36h，得到所述的发酵液；所述产酶培养基终浓度组成为：蛋白胨15–20g/L，麦芽浸粉5–10g/L，酵母浸出粉5–10g/L，NaCl 5–10g/L，MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述藤黄微球菌MJ菌株在产酶培养前，先经活化培养，然后经种子培养，获得种子液再以体积浓度2％–3％接入产酶培养基发酵，具体步骤如下：
(1)活化培养：将藤黄微球菌MJ菌株接种于LB斜面培养基，于37℃培养24–36h，得到活化后的斜面菌体；所述的LB斜面培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4；
(2)种子培养：接种环挑取步骤(1)活化后的斜面菌体2–3环，接种至LB液体培养基中，于35℃、200–250r/min振荡条件下培养12–16h，得到种子液；所述LB液体培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为水，初始pH为7.2–7.4。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的产酶培养基组成为：蛋白胨20g/L，麦芽浸粉10g/L，酵母浸出粉10g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O0.5 g/L，溶剂为水，初始pH为7.4。
CN202011345034.6A 2020-11-26 2020-11-26 藤黄微球菌mj及其在蚕丝脱胶中的应用 Active CN112342171B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011345034.6A CN112342171B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 藤黄微球菌mj及其在蚕丝脱胶中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011345034.6A CN112342171B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 藤黄微球菌mj及其在蚕丝脱胶中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112342171A CN112342171A (zh) 2021-02-09
CN112342171B true CN112342171B (zh) 2022-07-15

Family

ID=74365829

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011345034.6A Active CN112342171B (zh) 2020-11-26 2020-11-26 藤黄微球菌mj及其在蚕丝脱胶中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112342171B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115948435B (zh) * 2022-07-27 2024-03-22 西南大学 转胰蛋白酶原基因在家蚕丝胶层表达制备自脱胶蚕丝中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894020A (zh) * 2015-05-30 2015-09-09 中国海洋大学 一种蛋白酶及其生产菌株
CN109439601A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104894020A (zh) * 2015-05-30 2015-09-09 中国海洋大学 一种蛋白酶及其生产菌株
CN109439601A (zh) * 2018-12-25 2019-03-08 河南省科学院生物研究所有限责任公司 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
4株家蚕丝胶蛋白降解细菌的分类鉴定与培养温度研究;张莎莎等;《蚕业科学》;20100815;第36卷(第04期);第0713-0717页 *
麻类作物的微生物脱胶(综述);孙庆祥;《中国麻业》;19811231(第01期);第38-42页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112342171A (zh) 2021-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102002468B (zh) 一种荧光假单胞菌da4菌株及其获得方法和应用
CN102002467B (zh) 一种蜡状芽孢杆菌da3菌株及其获得方法和应用
CN102037856B (zh) 一种简易蛹虫草菌种复壮的方法
CN101880637A (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在剑麻脱胶中的应用
CN1323157C (zh) 冬虫夏草菌的一种仿生学培养方法
CN112342171B (zh) 藤黄微球菌mj及其在蚕丝脱胶中的应用
KR101186905B1 (ko) 바실러스 코아굴란스 에이치피-10 균주를 이용한 인피섬유의 정련방법
CN107365713A (zh) 一种用于高产乳糖酶的米曲霉原生质体的制备与再生方法
CN110438015A (zh) 产橙皮苷酶的枳实内生真菌及其发酵产橙皮苷酶的方法
CN111334454B (zh) 一株具有蛋白降解功能的微小杆菌pt3及其应用
CN1766098A (zh) 一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用
CN114606137B (zh) 日本曲霉hy-8-25及其在迷迭香精油提取中的应用
CN108239616B (zh) 一株屎肠球菌菌株及其在酸浆豆腐加工中的应用
CN113151055B (zh) 产果胶酶芽孢杆菌及其发酵方法、以及胡椒脱皮的方法
CN102337220B (zh) 一种产紫青霉菌db1菌株及其制备和应用
CN105420167B (zh) 一种蜡状芽孢杆菌及其应用
CN109136100A (zh) 一株塔宾曲霉菌株及在发酵青砖茶上的应用
CN105385634B (zh) 一株橡胶树根际促生菌株hbrm-86及其应用
CN108424863A (zh) 纳豆菌及其在发酵扇贝裙边制备ace抑制肽中的应用
CN104988080B (zh) 一种转几丁质酶基因的粉红螺旋聚孢霉工程菌株及其应用
CN101993846A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及用该菌株发酵生产凝乳酶的方法
TW593837B (en) Biopulping method for plant fiber
CN113717876B (zh) 一株具有木质纤维素降解功能的构树叶内生细菌
CN106399121A (zh) 一种紫色红曲菌菌株
CN104762295A (zh) 一种耐酸耐盐兼性厌氧芽孢杆菌的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 2016 Jiangxia Road, Yangxunqiao Town, Keqiao District, Shaoxing City, Zhejiang Province

Applicant after: ZHEJIANG SHUREN College (ZHEJIANG SHUREN University)

Address before: No.8 Shuren street, Gongshu District, Hangzhou City, Zhejiang Province 310015

Applicant before: ZHEJIANG SHUREN College (ZHEJIANG SHUREN University)

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant