CN113151055B - 产果胶酶芽孢杆菌及其发酵方法、以及胡椒脱皮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种产果胶酶芽孢杆菌及其发酵方法、以及胡椒脱皮的方法，涉及食品加工技术领域。所述产果胶酶芽孢杆菌的分类命名为农研所芽孢杆菌(Bacillus niabensis)YY01，保藏编号为CCTCC M2021224，保藏时间为2021年3月12日。本发明旨在提供一种农研所芽孢杆菌YY01，所述农研所芽孢杆菌YY01可以发酵产生耐热性好的果胶酶，且该果胶酶对胡椒的脱皮效果较好，采用农研所芽孢杆菌YY01发酵产生的果胶酶用于胡椒脱皮与传统的胡椒酶法脱皮(将现有的果胶酶和纤维素酶联用)相比，成本更低，降低了胡椒生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，特别涉及一种产果胶酶芽孢杆菌及其发酵方法、以及胡椒脱皮的方法。
背景技术
果胶主要是由D-吡喃半乳糖醛酸通过α-1,4糖苷键连接组成的长链状多糖聚合物，通常以部分以甲酯化状态存在，其分子量为一到四十万不等。天然果胶类物质以原果胶、果胶、果胶酸的形态广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中，是细胞壁中形成初级细胞壁和胞间层的一种结构性多糖，它们通常伴随纤维素而存在，构成相邻细胞中间层粘结物，有助于增强细胞壁的机械强度和改善物理性能，使植物的细胞能够紧紧的粘连在一起。
果胶酶是指所有能催化果胶分解的复合酶。果胶酶能分解聚半乳糖醛酸的α-1,4糖苷键，将其降解为不饱和低聚半乳糖醛酸。基于此，果胶酶被广泛应用于食品加工、饮料加工、纺织工业、畜牧业以及造纸行业等领域。
我国直到上个世纪八十年代的早期，才逐渐有学者开始研究果胶酶。目前使用最广泛，成功商业化的是黑曲霉所产生的果胶酶，现在，大多数商业化酶制剂都是由黑曲霉生产的。但黑曲霉生产的果胶酶的耐热性较差，从而限制了果胶酶的应用范围，虽然将黑曲霉的基因修饰后再导入毕赤酵母中表达，可以获得热稳定性高的果胶酶，但这无疑增加了果胶酶的生产成本。
因此，为了提高果胶酶产品的品种、产量和稳定性，必须找到并筛选出新的性能优良的菌株。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种产果胶酶芽孢杆菌及其发酵方法、以及胡椒脱皮的方法，旨在提供一种农研所芽孢杆菌YY01，该农研所芽孢杆菌YY01 可以产生耐热的果胶酶。
为实现上述目的，本发明提出一种产果胶酶芽孢杆菌，所述产果胶酶芽孢杆菌已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为农研所芽孢杆菌(Bacillus niabensis)YY01，其保藏编号为CCTCC NO: M2021224，保藏时间为2021年3月12日。
可选地，所述农研所芽孢杆菌YY01的16S RNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
此外，本发明还提出一种产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法，所述产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法包括如下步骤：
采用如上所述的农研所芽孢杆菌YY01为出发菌株，依次经种子培养、摇瓶发酵，得果胶酶粗酶液。
可选地，所述种子培养时，采用的液体培养基为无机盐果胶培养基。
可选地，所述摇瓶发酵时，采用的发酵培养基包括以下组分：K2HPO4 2.0 g/L、果胶2.0-4.0g/L、(NH3)2SO4 1.5g/L、MgSO4 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L， pH7.2～7.4。
可选地，采用如上所述的农研所芽孢杆菌YY01为出发菌株，依次经种子培养、摇瓶发酵，得果胶酶粗酶液的步骤之前还包括以下步骤：
取土壤样品加无菌水，于28～30℃、180～240r/min摇床孵育24h，制成质量浓度为10～12％的土壤悬液，备用；
取所述土壤悬液的上清液梯度稀释成不同浓度的多个稀释液；
将所述多个稀释液分别涂布在初筛培养基上，培养至长出菌落；
选取大且独立的菌落接种至另一所述初筛培养基上培养至长出菌落；
采用刚果红染色法筛选出水解圈明显且大的菌株以备进行种子培养；
其中，所述初筛培养基包括以下组分：K2HPO4 2.0g/L、果胶2.0g/L、琼脂18.0g/L、(NH3)2SO4 1.5g/L、MgSO4 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L，pH7.2～7.4。
此外，本发明还提出一种胡椒脱皮的方法，所述胡椒脱皮的方法包括以下步骤：
将如上所述的农研所芽孢杆菌YY01发酵，获得果胶酶；
将所述果胶酶与胡椒混合后进行发酵后，清洗除杂得脱皮的胡椒。
可选地，将所述果胶酶与胡椒混合后进行发酵后，清洗除杂得脱皮的胡椒的步骤中，所述发酵时，温度为30～55℃，pH 6～9。
可选地，所述发酵时，温度为36℃，pH 6.5。
本发明技术方案中，通过在海南胡椒种植园采集的土壤中分离出农研所芽孢杆菌YY01，农研所芽孢杆菌YY01可以发酵产生耐热性好的果胶酶，且该果胶酶对胡椒的脱皮效果较好，采用农研所芽孢杆菌YY01发酵产生的果胶酶用于胡椒脱皮与传统的胡椒酶法脱皮(将现有的果胶酶和纤维素酶联用) 相比，成本更低，降低了胡椒生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例3中果胶酶的温度-酶活曲线图；
图2为实施例3中果胶酶的温度稳定性变化图；
图3为实施例4中果胶酶的pH-酶活曲线图；
图4为实施例4中果胶酶的pH稳定性变化图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
现在，大多数商业化酶制剂都是由黑曲霉生产的。但黑曲霉生产的果胶酶的耐热性较差，从而限制了果胶酶的应用范围，虽然将黑曲霉的基因修饰后再导入毕赤酵母中表达，可以获得热稳定性高的果胶酶，但这无疑增加了果胶酶的生产成本。
因此，为了提高果胶酶产品的品种、产量和稳定性，必须找到并筛选出新的性能优良的菌株。
鉴于此，本发明提出了一种产果胶酶芽孢杆菌，所述产果胶酶芽孢杆菌由发明人从在海南胡椒种植园采集到的土壤中分离得到，目前已被送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名为农研所芽孢杆菌(Bacillus niabensis)YY01，其保藏编号为CCTCC NO: M2021224，保藏时间为2021年3月12日。
所述农研所芽孢杆菌YY01的菌学特性如下所述：
所述农研所芽孢杆菌YY01为革兰氏阳性菌，其显微镜观察结果显示：该农研所芽孢杆菌YY01呈长杆状。经耐热性、pH耐受性测试，该菌株能耐受50℃温度环境以及pH 6.0～10.0酸碱环境。此外，该菌株发酵后可以产生果胶酶，且经实验获知，该果胶酶在pH 10.0时孵育12h，仍有52.5％剩余酶活力，在50℃时孵育6h，有64％剩余酶活力，表现出了较好的碱耐受性和热稳定性。
所述农研所芽孢杆菌YY01的生理生化特征如下表1所示：
表1生理生化特征
| 鉴定项目 | 鉴定结果 | 鉴定项目 | 鉴定结果 |
| 运动性 | - | 明胶液化 | - |
| 2％NaCl溶液中生长 | + | 葡萄糖 | + |
| 7％NaCl溶液中生长 | + | 蔗糖 | + |
| 淀粉水解 | - | 木糖 | + |
| 纤维素分解 | - | 阿拉伯糖 | + |
| 甘露醇 | + |
表中：“+”代表能够生长；“-”代表不能生长。
将其16S rRNA基因进行PCR扩增，PCR产物送交生工生物工程(上海) 股份有限公司测序，农研所芽孢杆菌YY01的16S RNA的基因序列如SEQ ID NO：1所示。利用NCBI的GenBank数据库的Blast程序进行序列同源性比对，结果显示菌株的16S rRNA序列与Bacillus niabensis的16S rRNA一致性达到了99.96％以上。
本发明还提出一种产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法，利用该发酵方法可以获得果胶酶。所述产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法包括以下步骤：步骤S10、采用如上所述的农研所芽孢杆菌YY01为出发菌株，依次经种子培养、摇瓶发酵，得果胶酶粗酶液。
本实施例发酵方法将上述保藏编号为CCTCC M2021224的农研所芽孢杆菌YY01的菌株进行菌种培养，依次经过菌种活化、菌种纯化后，挑选纯化菌株的单一菌落接种至液体培养基，于200r/min，28℃下进行摇床培养，获得种子液；待菌浓度达到OD 0.4～0.6后，再将种子液按照1％(w/w)接种至发酵培养基进行发酵培养，待菌浓度达到OD600 0.6后，取发酵液，12000r/min 离心15min，上清液即为果胶酶粗酶液。
其中，在进行种子培养的摇床培养步骤时，采用的液体培养基可以为无机盐果胶培养基；在进行摇瓶发酵时，采用的发酵培养基包括以下组分： K2HPO4 2.0g/L、果胶2.0-4.0g/L、(NH3)2SO4 1.5g/L、MgSO4 0.5g/L、FeSO4 0.01 g/L，pH7.2～7.4。具体地，在配制上述发酵培养基时，可以按照如下方法进行配制：先将2.0g K2HPO4、2.0-4.0g果胶加无菌水溶解并定容至1L，调整pH 为7.2～7.4，然后向其中加入预先配置好的且已过滤除菌的(NH3)2SO4母液(1.5 g/20mL)、MgSO4母液(0.5g/20mL)、FeSO4母液(0.01g/20mL)各20 mL。
采用本发明实施例提供的产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法，对农研所芽孢杆菌YY01进行发酵培养从而获得果胶酶，在发酵过程中，选择合适的液体培养基和发酵培养基，可以有效提高发酵得到的果胶酶的产量以及酶活力，进而降低了生产果胶酶的成本。
进一步地，在进行上述步骤S10之前还可以包括如下所示的分离、筛选优质菌株的步骤：
步骤S100、取土壤样品加无菌水，于28～30℃、180～240r/min摇床培养 24h，制成质量浓度为10～12％的土壤悬液，备用。
步骤S200、取所述土壤悬液的上清液梯度稀释成不同浓度的多个稀释液。
本实施例中，稀释液浓度优选稀释倍数分别为10-4、10-5、10-6。
步骤S300、将所述多个稀释液分别涂布在初筛培养基上，培养至长出菌落。
其中，初筛培养基包括以下组分：K2HPO4 2.0g/L、果胶2.0g/L、琼脂18.0 g/L、(NH3)2SO4 1.5g/L、MgSO4 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L，pH7.2～7.4。具体地，在配制上述初筛培养基时，可以按照如下方法进行配制：先将2.0g K2HPO4、 2.0g果胶以及琼脂18.0g加无菌水溶解并定容至1L，调整pH为7.2～7.4，然后向其中加入预先配置好的且已过滤除菌的(NH3)2SO4母液(1.5g/20mL)、 MgSO4母液(0.5g/20mL)、FeSO4母液(0.01g/20mL)各20mL。
本实施例中，培养期间的温度优选为28℃，培养时间优选2～3天，且以长出明显菌落为宜。
步骤S400、选取单菌落接种至另一所述初筛培养基上培养至长出菌落。
待长出明显菌落后，选取长势较好的菌落将其接种至另一所述初筛培养基上培养至长出菌落，培养温度同样以28℃为宜。其中长势较好的标准为菌落大且独立。
步骤S500、采用刚果红染色法筛选出水解圈明显且大的菌株以备进行种子培养。
为了获得更加高产的菌株，本实施例采用刚果红溶液进行二级筛选，水解圈明显且大的菌株即为优质的农研所芽孢杆菌YY01。
除此之外，本实施例发酵方法还包括对筛选出农研所芽孢杆菌YY01的菌株的保藏步骤：采用刚果红染色法筛选出水解圈明显且大的菌株培养成菌液后，离心并弃去上清液，用20％甘油的发酵培养基悬浮，-20℃保藏，备用。
本实施例中，采用刚果红染色法筛选出水解圈明显且大的菌株用上述初筛培养基培养至OD＝0.8后，8000r/min离心5min弃去上清液，重新用含20％ (w/w)甘油的发酵培养基悬浮，-20℃保藏，备用。
除此之外，本发明提出的农研所芽孢杆菌YY01经发酵培养可以制得一种耐热性好的果胶酶，且该果胶酶在催化果胶分解上表现出优选的酶活性。向果胶中加入pH 6.5的K2HPO4-KH2PO4缓冲液使溶解后，然后加入该果胶酶，混匀后，46℃水浴中反应1h后，果胶顺利降解成半乳糖醛酸。
基于此，本发明还提出一种胡椒脱皮的方法。本实施例胡椒脱皮的方法包括以下步骤：
步骤S101、将如上所述的农研所芽孢杆菌YY01发酵，获得果胶酶。
其中，将如上所述的农研所芽孢杆菌YY01发酵的方法可以采用常规的发酵方法，也可以采用本发明提出的产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法，在此不做赘述。
步骤S102、将所述果胶酶与胡椒混合后进行发酵后，清洗除杂得脱皮的胡椒。
其中，所述发酵时，温度可以为28～55℃，优选为36℃；pH可以为6～9，优选为pH6.5。
可以理解的是，同样也可以将农研所芽孢杆菌YY01产出的果胶酶与纤维素酶组合形成复合酶，再与胡椒混合后进行发酵，利用两种酶的协同作用以提高脱皮效果和效率。
本发明技术方案中，通过在海南胡椒种植园采集的土壤中分离出农研所芽孢杆菌YY01，农研所芽孢杆菌YY01可以发酵产生耐热性好的果胶酶，且该果胶酶对胡椒的脱皮效果较好，采用农研所芽孢杆菌YY01发酵产生的果胶酶用于胡椒脱皮与传统的胡椒酶法脱皮(将现有的果胶酶和纤维素酶联用) 相比，脱皮效果相近但成本更低，从而降低了胡椒生产成本。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1农研所芽孢杆菌YY01的筛选及保藏
(1)筛选
在海南胡椒种植园采集土壤样品。取10g土壤样品于灭菌后的锥形瓶中加无菌水定容至100mL，然后放入28℃、200r/min摇床培养24h以释放土壤中的微生物，制成10％的土壤悬液备用。
将土壤悬液的上清液梯度稀释为10-4、10-5、10-6后，各取100μL稀释液分别涂布在初筛培养基平板上，放入28℃培养箱中培养约2～3天，以长出菌落明显为宜。其中，初筛培养基包括以下组分：K2HPO4 2.0g/L、果胶2.0g/L、琼脂18.0g/L、(NH3)2SO4 1.5g/L、MgSO40.5g/L、FeSO4 0.01g/L，pH 7.2～7.4。
选取大且独立的菌落接种至另一所述初筛培养基平板上，放入28℃培养箱中培养至长出菌落明显后，向平板中倒入刚果红溶液，使其完全覆盖整个平板，静置15分钟。再倒去刚果红溶液，用氯化钠溶液重新覆盖平板表面，静置15分钟。筛选出水解圈明显且较大的菌株，即为农研所芽孢杆菌YY01。
(2)保藏
将平板中水解圈明显且较大的菌株用初筛培养基培养至OD为0.8后，取 1mL于无菌EP管中，8000r/min离心5min弃去上清液，重新用20％甘油的发酵培养基悬浮，放入-20℃冰箱保藏，备用。
实施例2农研所芽孢杆菌YY01的发酵培养
从实施例1中经刚果红染色的平板中挑选单菌落接种至5ml无机盐果胶培养基，于200r/min，28℃下进行摇床培养，获得种子液(摇瓶发酵时，采用的发酵培养基包括以下组分：K2HPO4 2.0g/L、果胶2.0-4.0g/L、(NH3)2SO4 1.5g/L、MgSO4 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L，pH7.2～7.4)；待菌浓度达到OD600 0.4～0.6 后，再将种子液按照1％(w/w)接种至发酵培养基进行发酵培养，待菌浓度达到OD600 0.6后，取发酵液，12000r/min离心15min，上清液即为果胶酶粗酶液。
效价测定：将0.05g果胶溶于10mL pH为6.5的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中。取1mL果胶溶液加入EP管中，加入果胶酶粗酶液0.5mL，搅拌混匀后放入45℃水浴锅中反应1h。取0.13mL反应后的混合液，加入另一EP管中，与0.47mL的DNS试剂混合均匀，于100℃加热10min，作为样品溶液。使用果胶酶标准品按照上法制备标准溶液。
以灭活的酶液作为空白对照，用分光光度计测定540nm吸光值，每个样品平行测定3次，结果取平均值。在45℃、pH 6.5的条件下，1.0mL果胶酶粗酶液每min催化果胶生成1μmol半乳糖醛酸的酶量定义为1个酶活力单位， U/mL。
公式：酶活力(FPU/mL)＝A540样品×5.55/(A540标准品×60×V)；
其中，V为果胶酶粗酶液的体积(mL)。
实施例3农研所芽孢杆菌YY01的热稳定性的测定
将实施例2制得的粗酶液稀释104倍形成稀释液。
(1)取1mL果胶溶液和0.5mL稀释液加入EP管中，搅拌混匀后放入 30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的水浴锅中加热1h。按照实施例2所述的效价测定方法测定酶活力。
从图1可以看出，本发明提出的农研所芽孢杆菌YY01经发酵培养获得的果胶酶的最适反应温度为45℃。
(2)将稀释液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下处理6h后，取出1mL，于45℃下按照上述效价测定方法测定酶活力。同时，以不同温度下未保温测定的果胶酶活力记为100％，分别计算出不同温度条件下的相对酶活。
从图2可以看出，本发明提出的农研所芽孢杆菌YY01经发酵培养获得的果胶酶在50℃以下时效价稳定。
实施例4农研所芽孢杆菌YY01的pH稳定性的测定
将实施例2制得的粗酶液稀释104倍形成稀释液。
配置不同pH的buffer(pH 3.0-5.0、0.1M KH2PO4 buffer；pH 6.0-9.0、0.1MK2HPO4-KH2PO4 buffer；pH 9.0-10.0、0.1M K2HPO4 buffer)。
(1)采用上述buffer配制果胶溶液并与稀释液混合形成pH分别为3.0、 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的反应体系，于最适反应温度45℃下酶解反应。按照实施例2所述的效价测定方法测定不同pH值酶解环境下的酶活力。从图3可知，本发明提出的农研所芽孢杆菌YY01经发酵培养获得的果胶酶的最适反应pH在6到7之间达到最高，约为6.5左右。
(2)将稀释液置于pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的缓冲液中于水浴锅中保温12h，重新使用缓冲液将pH调为最适反应pH下测定果胶酶的活力。以最适pH条件下未保温测定的果胶酶活力记为100％，分别计算出不同pH条件下的相对酶活，具体结果如下图4所示。从图4可以看出，果胶酶在pH 7.0-10.0范围内稳定。
实施例5脱皮效果测定
对比例1：市售的果胶酶(黑曲霉发酵获得果胶酶产品)；
对比例2：将对比例1与纤维素酶按1:1混合制成复合酶。
将实施例2制得的粗酶液用0.22μm膜过滤后，与1Kg胡椒混合，于36℃， pH 6.5下发酵，至胡椒脱皮。同时，分别采用对比例1、对比例2的酶同法脱皮。
经试验，实施例2和对比例2的脱皮时间均为48h，而对比例1的脱皮时间为54h。显然，本发明农研所芽孢杆菌YY01发酵产生的果胶酶的胡椒脱皮效果显著高于市售的果胶酶脱皮效果，但与市售的果胶酶与纤维素酶复合使用的脱皮效果相近。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (7)
1.一种产果胶酶芽孢杆菌，其特征在于，所述产果胶酶芽孢杆菌的分类命名为农研所芽孢杆菌(Bacillus niabensis)YY01，保藏编号为CCTCC NO：M2021224，保藏时间为2021年3月12日。
2.一种如权利要求1所述的产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
采用如权利要求1所述的农研所芽孢杆菌YY01为出发菌株，依次经种子培养、摇瓶发酵，得果胶酶粗酶液。
3.如权利要求2所述的产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述种子培养时，采用的液体培养基为无机盐果胶培养基。
4.如权利要求2所述的产果胶酶芽孢杆菌的发酵方法，其特征在于，所述摇瓶发酵时，采用的发酵培养基包括以下组分：K2HPO4 2.0g/L、果胶2.0-4.0g/L、(NH3)2SO4 1.5g/L、MgSO4 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L，pH7.2～7.4。
5.一种胡椒脱皮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将如权利要求1所述的农研所芽孢杆菌YY01发酵，获得果胶酶；
将所述果胶酶与胡椒混合后进行发酵后，清洗除杂得脱皮的胡椒。
6.如权利要求5所述的胡椒脱皮的方法，其特征在于，将所述果胶酶与胡椒混合后进行发酵后，清洗除杂得脱皮的胡椒的步骤中，所述发酵时，温度为28～55℃，pH 6～9。
7.如权利要求5所述的胡椒脱皮的方法，其特征在于，所述发酵时，温度为36℃，pH6.5。
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| CN (1) | CN113151055B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114317364B (zh) * | 2021-12-30 | 2023-06-13 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一株高地芽孢杆菌及其在产高稳定性碱性果胶酶中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101892184A (zh) * | 2010-08-02 | 2010-11-24 | 海南省农业科学院农产品加工设计研究所 | 一种胡椒果皮脱胶菌及其应用 |
| CN102342567A (zh) * | 2011-06-20 | 2012-02-08 | 海南大学 | 一种使胡椒脱皮的方法 |
-
2021
- 2021-03-17 CN CN202110288142.2A patent/CN113151055B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN102342567A (zh) * | 2011-06-20 | 2012-02-08 | 海南大学 | 一种使胡椒脱皮的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 《Characterization, Kinetic, and Thermodynamic Studies of Marine Pectinase From Bacillus subtilis》;Joshi Manasi等;《PREPARATIVE BIOCHEMISTRY & BIOTECHNOLOGY》;20151231;第45卷(第3期);第205-220页 * |
| 《果胶酶产生菌的筛选鉴定和酶学性质研究》;杨逸飞等;《中国酿造》;20210930;第40卷(第9期);第47-51页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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