CN108102983B

CN108102983B - 一种高产淀粉酶的植物乳杆菌及其应用

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Publication number: CN108102983B
Application number: CN201810135911.3A
Authority: CN
Inventors: 张建华; 姚晓敏; 徐一涵; 周涛; 陈玉婧; 张立敏
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN108102983A

Abstract

本发明公开了一种高产淀粉酶的植物乳杆菌，该菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14177，保藏日期为2017年5月19日。该菌株分离自发酵老面团，经平板涂布、初筛、复筛而得，并经形态学、生理生化及分子生物学对菌株进行了鉴定。在以0.5％淀粉替代0.5％葡萄糖的MRS培养基(pH 6)中31℃培养21h，发酵液淀粉酶活性为15.89±0.51U/mL。本发明还公开了该菌在马铃薯粉固态发酵方面的应用，以及在分解淀粉方面的应用。该菌可用于马铃薯全粉等淀粉质原料的发酵，且对淀粉降解作用明显。

Description

一种高产淀粉酶的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种高产淀粉酶的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

淀粉酶作为一种生物催化剂具有高度的专一性，作用于淀粉而发生一定的水解反应，因此被广泛应用于淀粉粮食加工、饮料生产、制药和纺织等行业。研究表明，α-淀粉酶可降低淀粉粘度，使面包变得柔软并增强其延展性，β-淀粉酶可水解淀粉生成麦芽糖从而延缓由于淀粉和面筋之间的相互作用而导致的老化，延长面包货架期。异性淀粉酶能使支链淀粉分解为直链淀粉。在工业生产中，由于酶反应温和，专一性强，催化效率高，被广泛应用，同时多种淀粉酶的协同作用也引起人们的重视。

乳酸菌能改善食品的风味、营养，可延长食品保质期，并具有调节人体肠道菌群平衡、抑制病原菌生长、降低胆固醇、提高免疫力和延缓衰老等重要的生理保健作用，被广泛应用于食品行业。乳酸菌发酵过程中，其代谢产物酸、酶和胞外多糖等共同作用对改善米粉和无麸质面包等产品品质作用明显。但是，绝大多数乳酸菌不能直接利用淀粉，且发现的产淀粉酶的乳酸菌大多酶活较低(Biotechnology Advances 26：22–34，2008)，因此，乳酸菌发酵效率低成为限制淀粉类基质发酵产品开发的瓶颈，而筛选高产淀粉酶的乳酸菌，正是突破瓶颈的有效措施之一。

乳酸菌发酵对淀粉的影响主要是产酸、产酶、产胞外多糖和蛋白分解等。酸水解可以在不影响淀粉形态的情况下，显著改变淀粉的结构和功能。马铃薯淀粉的晶体为B型结构，B型结构较为松散，其分支点大多分布在无定形区，因此更容易被酸水解。对于酶水解而言，B型淀粉比A型更能抵抗酶的消化，且马铃薯淀粉表面光滑，没有微孔和通道，故其酶水解模式是“由外向内”，效率较低。因此在乳酸菌发酵淀粉的过程中，酸水解能提高淀粉对酶水解的敏感性。发酵是提高淀粉类产品质构和感官品质的诸多方法(如添加多聚物、谷朊粉和酶制剂、物理退火等)中最有效的方法之一，且利用乳酸菌发酵还具有成本低、能满足消费者对天然产品的要求等优点。

发明内容

针对现有乳酸菌产淀粉酶的不足问题，本发明提供一种高产淀粉酶的植物乳杆菌，其特征在于，高产淀粉酶的植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.14177，保藏日期为2017年5月19日。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明还公开了上述高产淀粉酶的植物乳杆菌在马铃薯粉固态发酵方面的应用。

进一步地，该应用包括以下步骤：

(1)种子培养液制备：将高产淀粉酶的植物乳杆菌接种至MRS液体培养基，室温，厌氧条件下培养；取菌液，离心，倒掉上清液后再用无菌水洗菌体，离心，如此重复多次，加适量无菌水震荡均匀，制成菌落浓度>10⁸cfu/mL的植物乳杆菌发酵液备用；

(2)马铃薯发酵方法：称取马铃薯，去皮后切成小块，加入少量水，用打浆机打碎，接入步骤(1)得到的植物乳杆菌发酵液，搅匀后，密封，放入培养箱中进行发酵，得到马铃薯发酵浆液；

(3)马铃薯淀粉的提取：称取步骤(2)得到的马铃薯发酵浆液用80目筛进行过滤，蒸馏水重复冲洗多次使浆液中的保留在筛面的物质被过滤除去；用NaOH溶液将滤液pH值调整至10.4，混匀，离心，弃上清液；用蒸馏水将沉淀物洗涤、离心，重复多次至淀粉浆呈白色；离心，将沉淀上层黄色物质小心刮去，取下层乳白色物质，铺平，干燥，粉碎过80目筛，得到经过高产淀粉酶的植物乳杆菌发酵处理的马铃薯淀粉。其中，保留在筛面的物质为纤维素等物质。

进一步地，步骤(1)种子培养液制备具体为：将高产淀粉酶的植物乳杆菌以3％的接种量接种至MRS液体培养基，在31℃，厌氧条件下培养18h，取菌液4000r/min，离心15min，倒掉上清液后再用无菌水洗菌体，离心，如此重复2-3次，加适量无菌水震荡均匀，制成菌落浓度>10⁸cfu/mL的植物乳杆菌发酵液备用。

进一步地，步骤(2)马铃薯发酵方法具体为：称取新鲜洗净马铃薯，去皮后切成小块，加入少量水，用打浆机打碎，接入步骤(1)得到的植物乳杆菌发酵液，接种量为8％；在和面机中搅匀后，密封，放入恒温恒湿培养箱中，在31℃，湿度80％的条件下进行发酵，得到马铃薯发酵浆液。

在一个具体实施方式中，步骤(3)马铃薯淀粉的提取具体为：称取步骤(2)得到的马铃薯发酵浆液用80目筛进行过滤，蒸馏水重复冲洗多次使浆液中的纤维素等物质被过滤除去。用0.1mol/L NaOH溶液将滤液pH值调整至10.4，磁力搅拌器搅拌1h，4000r/min离心15min，弃上清液；用蒸馏水将沉淀物洗涤、离心，重复多次至淀粉浆呈白色，pH为7±0.5；离心后将沉淀上层黄色物质小心刮去，取下层乳白色物质，在平皿上铺平，电热鼓风干燥箱40℃干燥过夜，粉碎过80目筛，得到经过高产淀粉酶的植物乳杆菌发酵处理的马铃薯淀粉。

在另一个具体实施方式中，步骤(3)中的干燥温度是40℃，时间是12h。

本发明还公开了上述的高产淀粉酶的植物乳杆菌在分解淀粉方面的应用。

进一步地，该应用的特征在于，在高产淀粉酶的植物乳杆菌的最适反应温度和最适pH条件下进行分解淀粉；最适反应温度和最适pH分别为40℃和7。

本发明还公开了上述的高产淀粉酶的植物乳杆菌在淀粉质原料的发酵方面的应用。比如前述的马铃薯粉即为一种淀粉质原料。除马铃薯粉外，淀粉质原料还包括木薯、甘薯、玉米、大米、小麦等。

本发明还公开了上述的高产淀粉酶的植物乳杆菌用作益生菌或用于益生菌产品。用作益生菌指植物乳杆菌(CGMCC No.14177)被作为一种益生菌，或者益生菌中的一种。用于益生菌产品指该益生菌产品中包含有植物乳杆菌(CGMCC No.14177)。

本发明涉及的高产淀粉酶的植物乳杆菌(CGMCC No.14177)为自主分离自发酵老面团，该菌株的16S rDNA碱基序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供了该菌株(CGMCC No.14177)产淀粉酶培养条件：30-37℃、以0.5％淀粉替代0.5％葡萄糖的MRS培养基(pH 6)中培养12-24小时。在以0.5％淀粉替代0.5％葡萄糖的MRS培养基(pH 6)中31℃培养21h，发酵液淀粉酶活性为15.89±0.51U/mL，淀粉酶活性高。

本发明提供了该菌株(CGMCC No.14177)所产的淀粉酶的最适反应条件：最适反应温度和pH分别为40℃和7。

本发明提供了该菌株(CGMCC No.14177)的体外益生特性：

耐酸耐胆盐：在pH 3或含0.3％胆盐的MRS培养基中生长。

抑菌效果：可使肠炎沙门氏菌数量下降4log(CFU/ml)；可使大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌数量下降3log(CFU/ml)；可使单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌数量下降2log(CFU/ml)。

耐药性：对氯霉素、舒巴坦钠、头孢曲松、氨苄青霉素、四环素敏感；对磺胺异恶唑敏感性中介；对氨曲南、庆大霉素、环丙沙星、丁胺卡那霉素、头孢西丁耐药。

这些体外益生特性是当该菌作益生菌使用时要求具备的性能。其中，耐酸耐胆盐可让该菌可以在胃肠道中存活，抑菌效果则是在体内可抑制肠道致病菌的生长，耐药性主要是检测是否有可转移的耐药基因，以防转移给肠道致病菌。

本发明将高产淀粉酶的植物乳杆菌(CGMCC No.14177)应用于马铃薯固态发酵，提取发酵后的淀粉进行测定，在发酵12h后，直链淀粉含量从23.75％上升到31.91％，随后下降，发酵24h时其直链淀粉含量为28.79％。

附图说明

图1为不同比例的淀粉对植物乳杆菌(CGMCC No.14177)产酶的影响。

图2为不同培养温度对植物乳杆菌(CGMCC No.14177)产酶的影响。

图3为不同培养pH对植物乳杆菌(CGMCC No.14177)产酶的影响。

图4为温度对植物乳杆菌(CGMCC No.14177)淀粉酶反应的影响。

图5为pH对植物乳杆菌(CGMCC No.14177)淀粉酶反应的影响。

图6为植物乳杆菌(CGMCC No.14177)在不同pH条件下的生长曲线。

图7为植物乳杆菌(CGMCC No.14177)在不同胆盐浓度下的生长曲线。

图8为固体发酵马铃薯全粉中总淀粉含量的变化曲线。

图9为固态发酵马铃薯淀粉中直链淀粉含量的变化曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：高产淀粉酶的植物乳杆菌的分离、筛选与鉴定

1、配制培养基：

(1)MRS液体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉提取物8.0g/L，酵母提取物4.0g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1.0ml/L，无水磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠(3结晶水)5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁(7结晶水)0.2g/L，硫酸锰(4结晶水)0.05g/L。调节pH为6.0-6.4之间，121℃灭菌20min。

(2)MRS固体培养基：在MRS液体培养基的成份基础上加入琼脂粉18.0g/L。

(3)MRS-1％淀粉液体培养基：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物4.0g/L，吐温80 1.0ml/L，无水磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠(3结晶水)5.0g/L，柠檬酸二铵2.0g/L，硫酸镁(7结晶水)0.58g/L，硫酸锰(4结晶水)0.25g/L，可溶性淀粉10.0g/L。调节pH为6.0-6.4之间，121℃灭菌20min。(即以可溶性淀粉代替MRS培养基(乳酸细菌培养基)中的葡萄糖与牛肉膏作为碳源)。

(4)MRS-1％淀粉固体培养基：在MRS-1％淀粉液体培养基的成份基础上加入琼脂粉18.0g/L。

分离培养基(MRS-1％淀粉固体培养基)，以可溶性淀粉代替MRS培养基(乳酸细菌培养基)中的葡萄糖与牛肉膏作为碳源，具体成分及其配比如下：蛋白胨10.0g/L，酵母提取物4.0g/L，吐温80 1.0mL/L，无水磷酸氢二钾2.0g/L，CH₃COONa·3H₂O 5.0g/L，柠檬酸二铵2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.58g/L，MnSO₄·4H₂O 0.25g/L，可溶性淀粉10.0g/L，琼脂18.0g/L。调节pH为6.0-6.4之间，121℃灭菌20min，倒平板。

2、菌株分离：

在无菌条件下取1g老面团样品，加入50mL的无菌生理盐水中均质10min。取1mL均质液用无菌生理盐水进行梯度稀释(10^-1～10^-7)，震荡均匀。分别取100μL提取液涂布于分离培养基中，37℃厌氧培养48h。观察不同平板上形成的菌落，挑取单菌落在MRS固体培养基平板上划线，37℃厌氧培养48h。

3、产淀粉酶乳酸菌初筛：淀粉圈显色法

在上述平板上挑取合适的单菌落于MRS液体培养基，37℃厌氧培养24h。吸取5μL菌液于MRS-1％淀粉固体培养基，37℃厌氧培养2-3天，滴加鲁哥氏碘液，观察在菌落周围的透明圈显色情况，选取透明圈较大的菌株。

4、高淀粉分解能力乳酸菌复筛：碘量法

将淀粉圈显色实验所筛得的菌株液体培养后，按2％接种量接种至MRS-1％淀粉液体培养基，37℃厌氧培养24h。吸取菌液300μL，4500r/min离心15分钟，吸取上清液40μL，加入40μL的磷酸盐缓冲液，混匀后加入100μL的碘液震荡，显色后取150μL样品转入透明的平底96微孔板，读取580nm(A580)的吸收值，并计算淀粉降解率(％)。

5、形态学鉴定

(1)菌落形态观察

将菌株接种于MRS液体培养基培养18h，然后于MRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养48h，观察菌落生长特点，包括：菌落大小、形态、颜色、表面是否光滑、边缘是否粗糙、是否隆起等。

(2)革兰氏染色

将培养好的菌株，进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体形态并拍摄菌体照片。红色为革兰氏阴性菌，紫色为革兰氏阳性菌。

6、菌株生理生化鉴定

采用API 50CH试剂条对乳酸菌进行生理生化鉴定，实验步骤按试剂条说明书进行。加入菌液后将试剂条置于37℃，厌氧培养48h，颜色发生变化记为阳性反应，颜色无变化记为阴性反应，使用细菌鉴定系统apiweb进行结果分析，给出鉴定结论为植物乳杆菌。

7、菌株16S rDNA鉴定

将经筛选得到的降解淀粉的优良菌株(编号：SJYU-LP1)划线纯化后接种至MRS液体培养基扩大培养24h，离心收集菌体，采用试剂盒提取基因组DNA作为16S rDNA扩增模板，实验步骤按所用试剂盒的说明书进行。利用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，如SEQ ID NO:2所示)和1492R(5’-GGTTACCTTACG ACTT-3’，如SEQID NO:3所示)扩增16S rDNA基因，PCR反应后进行测序，与blast数据库对比为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。将该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.14177，保藏日期为2017年5月19日。

实施例2：植物乳杆菌(CGMCC No.14177)的酶学特性

1、酶活力测定：DNS法(二硝基水杨酸法)

标准曲线的制作：配置0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/mL的麦芽糖标准溶液，在540nm波长处测定吸光度。以麦芽糖浓度作为横坐标，吸光值作为纵坐标，绘制麦芽糖标准曲线。

酶活力曲线的测定：

1％淀粉PBS缓冲溶液：分别配制0.05mol/L磷酸氢二钠和0.05mol/L磷酸二氢钠，在25℃下混合调节至pH为7为的PBS缓冲溶液。取1g淀粉，加入少量PBS缓冲溶液在水浴锅中加热搅拌，使其充分溶解后，移入100mL容量瓶中，用PBS缓冲溶液定容至100mL，备用。

取液体培养好的菌液，离心(4℃4500r/m 15min)，倾出上清液于另一无菌EP管中，上下翻转10次混匀，作为淀粉酶粗提取液。取100μL淀粉酶粗提取液和400μL 1％的淀粉PBS缓冲溶液震荡混匀，40℃水浴40min，加入1.5mL DNS试剂终止反应，沸水浴5min，流水冷却，加入去离子水定容至25mL，测定540nm下的吸光度。3次平行。计算还原性糖生成量，换算出酶活力大小。

酶活力单位：40℃条件下，每小时能水解淀粉生成1mg麦芽糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，表示1U/mL。

2、培养条件对酶活的影响

(1)淀粉含量对于菌株产酶的影响

调整MRS-1％淀粉液体培养基中的葡萄糖与淀粉的比例，保持总碳源为2％不变，分别配制含葡萄糖/淀粉为2％/0％、1.75％/0.25％、1.50％/0.50％、1.25％/0.75％和1％/1％的MRS培养基，测定18、21、24、27和30h的淀粉酶活力曲线，详见图1。结果表明合适的淀粉添加量为0.50％，且在该添加比例下，菌株的酶活力有显著提高，酶活力的峰值时间由24h缩短到21h。

(2)培养温度对产酶的影响

培养温度分别为25、28、31、34、37和40℃，测定上述温下度培养21h的酶活力曲线，详见图2。发现最适合菌株产酶的培养温度为31℃，此时酶活力大小为15.89±0.51U/mL。

(3)培养pH对产酶的影响

选择的培养pH为4、5、6和7，测定上述pH下培养15、18、21、24和27h的淀粉酶活力曲线，详见图3。发现适合该菌株的培养pH为6，在该培养条件培养21h，酶活力达到最大值14.91±0.57U/mL。

3、温度和pH对淀粉酶酶活的影响

本次实验选择反应的温度为30、40、50、60和70℃，测定上述温度下淀粉酶活力大小，详见图4，结果表明最适温度为40℃。选择反应的pH为3、4、5、6、7和8，测定上述pH下淀粉酶活力大小，详见图5，最适pH为7。

实施例3：植物乳杆菌(CGMCC No.14177)的益生效果

1、菌株耐酸性研究

用盐酸调节，分别配制pH为2、3和7的MRS液体培养基，分别取上述培养基150μL加入96微孔板，同时加入培养18h的菌液2μL，37℃厌氧培养48h，每小时取样测定培养液的OD₆₀₀值，详见图6。结果表明在pH 3的条件下菌株可以缓慢生长；但在pH 2的条件下，菌株不能生长。

2、菌株耐胆盐性研究

配制pH为7、胆盐浓度(w/v)分别为0％、0.3％和0.6％的MRS液态培养基。分别取上述培养基150μL加入96微孔板，同时加入培养18h的菌液2μL，37℃厌氧培养48h，每小时取样测定培养液的OD₆₀₀值，详见图7，结果说明该菌株可以在含浓度0.3％胆盐的培养基中生长。

3、菌株抑菌性研究

本实验选取大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis ATCC13076)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella TyphimuriumATCC14028)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC29213)、单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes EGD-e，ATCCBAA-679)五种致病菌研究菌株的抑菌能力。

将培养18h的植物乳杆菌(CGMCC No.14177)菌液按2％的接种量接种至MRS液体培养基，37℃厌氧条件培养18h，离心(12000×g 5min)，使用0.22μm滤膜过滤收集上清液，得到植物乳杆菌(CGMCC No.14177)上清液。肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌自甘油管中取出，按照2％的接种量接种至LB液体培养基，金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌按照2％的接种量接种至TSB液体培养基，37℃厌氧摇床培养18h，离心收集菌体并用无菌PBS(pH 7.4)洗涤2次，重悬于LB或TSB培养基中，调整其OD₆₀₀＝0.2-0.3。取250μL植物乳杆菌(CGMCC No.14177)上清液和250μL的致病菌菌悬液混匀，置于37℃厌氧摇床培养48h，采用平板计数法测定各致病菌的菌落数量。结果表明植物乳杆菌(CGMCC No.14177)可使肠炎沙门氏菌、单核增生李斯特菌的数量下降4log(CFU/ml)、使大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌下降3log(CFU/ml)、使金黄色葡萄球菌和单核增生李斯特菌下降2log(CFU/ml)，说明该菌株对上述五种致病菌均有良好的抑制效果。

4、菌株耐药性研究

采用药敏纸片方法。选择氨苄青霉素(Ampicillin)(10μg)、氨苄青霉素-舒巴坦(Ampicillin-Sulbactam)(10μg/10μg)、头孢曲松(Ceftriaxone)(30μg)、头孢西丁(Cefoxitin)(30μg)、氨曲南(Aztreonam)(30μg)、庆大霉素(Gentamicin)(10μg)、阿米卡星(Amikacin)(30μg)、四环素(Tetracycline)(30μg)、环丙沙星(Ciprofloxacin)(5μg)、复方新诺明(Trimethoprim-Sulfamethoxazole)(1.25μg/23.75μg)和氯霉素(Chloramphenicol)(30μg)共计11种抗生素。将植物乳杆菌(CGMCC No.14177)菌株用0.85％生理盐水调节麦氏浊度0.5，涂布于MRS固体培养基平板中，放置抗生素药敏片，置于37℃厌氧培养24小时，记录表透明圈大小。以E.coli ATCC25922作为质控菌株。发现该菌对氯霉素、舒巴坦钠、头孢曲松、氨苄青霉素和四环素敏感，对磺胺异恶唑敏感性中介，对氨曲南、庆大霉素、环丙沙星、丁胺卡那霉素和头孢西丁耐药。

实施例4：植物乳杆菌(CGMCC No.14177)应用于马铃薯固态发酵

1、种子培养液制备方法

将该菌株接种至MRS液体培养基(接种量3％)，在37℃、厌氧条件下培养21h，获得植物乳杆菌(CGMCC No.14177)的种子培养液备用。取菌液4000r/min，离心15min，菌体用无菌水洗涤、离心，重复2-3次，加适量无菌水震荡均匀制成>10⁸cfu/mL的植物乳杆菌发酵液，备用。

2、马铃薯发酵方法

称取一定质量的洗净新鲜马铃薯，去皮后切成小块，加入少量水，用打浆机打碎，接入上述植物乳杆菌发酵液(接种量为8％)。搅拌机中搅匀后，密封。放入恒温恒湿(31℃，80％)培养箱中进行发酵，得到马铃薯发酵浆液。

3、马铃薯淀粉的提取

称取一定量的上述马铃薯发酵浆液用80目筛进行过滤，使浆液中的纤维素等物质被过滤除去，且用蒸馏水反复多次处理。用0.1mol/NaOH溶液将滤液pH值调整至10.4，搅拌1h，4000r/min离心15min，弃上清液。用蒸馏水将沉淀物洗涤、离心，重复多次至淀粉浆呈白色(pH约为7)。离心后将沉淀上层黄色物质小心刮去，取下层乳白色物质，在平皿上铺平，电热鼓风干燥箱40℃干燥过夜，粉碎过80目筛，得到经过植物乳杆菌(CGMCC No.14177)发酵处理的马铃薯淀粉。

4、总淀粉含量的测定

试剂配制：

1mg/mL葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL。

3,5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g 3,5-二硝基水杨酸和262mL 2mol/L的NaOH溶液加到酒石酸钾纳的热溶液中(185g酒石酸钾钠C₄H₄O₆KNa·4H₂O溶于500mL水中)，再加5g苯酚和5g亚硫酸钠(Na₂SO₃)溶于其中，搅拌溶解，冷却后定容到1000mL贮于棕色瓶中。

碘试剂：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。

标准曲线制作

按照表1将各管溶液均匀混合，在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25mL，摇匀。在540nm处测定吸光度，以葡萄糖含量(mg)为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

表1葡萄糖标准溶液的配制

样品中还原糖的提取

准确称取0.5g全粉，放在100mL烧杯中，先以少量蒸馏水(约2mL)调成糊状，然后加入40mL蒸馏水，混匀，于50℃恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出。过滤，将滤液全部收集在50mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，即为还原糖提取液。

样品总糖的水解及提取

准确称取0.5g全粉，放在锥形瓶中，加入6mol/L HCl 10mL，蒸馏水15mL，在沸水浴中回流1h，取出1～2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入1滴酚酞指示剂，以6N NaOH溶液中和至溶液呈微红色，并定容到100mL，过滤取滤液10mL定容至100mL，混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。

样品中含糖量的测定

表2样品中含糖量的测定的配制

按照表2将各管溶液均匀混合，在沸水中加热5min，取出后立即用冷水冷却至室温，再用蒸馏水定容至25mL，摇匀。在540nm处测定吸光度，根据标准曲线计算葡萄糖含量。

按下式计算出样品中总淀粉含量：

式中：C──还原糖或总糖提取液的浓度，mg/mL；V──还原糖或总糖提取液的总体积，mL；m──样品重量，g；1000──mg换算成g的系数。

淀粉＝(总糖-还原糖)×0.9

详见图8，结果表明该菌发酵24小时可使马铃薯全粉中总淀粉含量从75.98％下降到52.77％。

5、直链淀粉含量测定：

试剂配制：

碘试剂：用柱塞盖称量瓶准确称取2.0g碘化钾，加适量水以形成饱和溶液。加入0.2g碘，碘全部溶解后将溶液定量移至100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，现用现配，避光保存。

马铃薯直链淀粉标准溶液(1mg/mL)：准确称取100mg直链淀粉于100mL锥形瓶，小心加入1.0mL乙醇，将黏在瓶壁上的直链淀粉冲下，加入9.0mL1mol/L的氢氧化钠溶液，轻摇使直链淀粉完全分散开，随后将混合物置于沸水浴中10min，以分散马铃薯直链淀粉，分散后取出冷却至室温，转移至100mL容量瓶中加水至刻度，摇匀。

马铃薯支链淀粉标准液(1mg/mL)：用支链淀粉代替直链淀粉，按照上述操作制备支链淀粉标准溶液。

标准直链淀粉曲线制备：

准确移取5.0mL系列淀粉标准溶液(见表3)到预先加入大约50mL去离子水的100mL容量瓶中，加入1.0mL乙酸溶液，摇匀，再加入2.0mL碘试剂，加水至刻度，摇匀，静置10min。对照液使用5.0mL 0.09mol/L氢氧化钠溶液代替样品制备。以对照液调零，在720nm处测定系列标准溶液的吸光度。每管做三组平行实验，绘制直链淀粉标准曲线。

表3淀粉系列标准溶液的配置

样品中直链淀粉的测定：

称取样品2g，烘箱中烘干以去除水分。称取100mg烘干样品于100mL锥形瓶，然后按淀粉标准溶液的方法制备淀粉溶液。这里的样品指上述实验操作得到的植物乳杆菌(CGMCCNo.14177)发酵处理的马铃薯淀粉。

移取5.0mL样品溶液加入到预先加入大约50mL水的100mL容量瓶中，加入1.0mL乙酸溶液，摇匀，再加入2.0mL碘试剂，加水至刻度，摇匀，静置10min。空白溶液使用5.0mL0.09mol/L氢氧化钠溶液代替样品制备空白溶液。采用分光光度计，以空白溶液调零，在720nm处测定系列标准溶液的吸光度。利用标准曲线计算样品中直链淀粉含量，详见图9，结果表明该菌发酵12小时可使马铃薯淀粉中直链淀粉含量从23.75％上升到31.91％，随后下降，发酵24h时其直链淀粉含量为28.79％。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种高产淀粉酶的植物乳杆菌及其应用

<130> 01335-17251PIX

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1440

<212> DNA

<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)

<400> 1

aagcggctgg ttctaaaggt taccccaccg actttgggtg ttacaaactc tcatggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120

tagcgattcc gacttcatgt aggcgagttg cagcctacaa tccgaactga gaatggcttt 180

aagagattag cttactctcg cgagttcgca actcgttgta ccatccattg tagcacgtgt 240

gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt 300

caccggcagt ctcaccagag tgcccaactt aatgctggca actgataata agggttgcgc 360

tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccacct 420

gtatccatgt ccccgaaggg aacgtctaat ctcttagatt tgcatagtat gtcaagacct 480

ggtaaggttc ttcgcgtagc ttcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgggcccc 540

cgtcaattcc tttgagtttc agccttgcgg ccgtactccc caggcggaat gcttaatgcg 600

ttagctgcag cactgaaggg cggaaaccct ccaacactta gcattcatcg tttacggtat 660

ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct acccatactt tcgagcctca gcgtcagtta 720

cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata tatctacgca tttcaccgct 780

acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc ccagtttccg atgcacttct 840

tcggttgagc cgaaggcttt cacatcagac ttaaaaaacc gcctgcgctc gctttacgcc 900

caataaatcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag 960

ccgtggcttt ctggttaaat accgtcaata cctgaacagt tactctcaga tatgttcttc 1020

tttaacaaca gagttttacg agccgaaacc cttcttcact cacgcggcgt tgctccatca 1080

gactttcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc cgtaggagtt tgggccgtgt 1140

ctcagtccca atgtggccga ttaccctctc aggtcggcta cgtatcattg ccatggtgag 1200

ccgttacccc accatctagc taatacgccg cgggaccatc caaaagtgat agccgaagcc 1260

atctttcaag ctcggaccat gcggtccaag ttgttatgcg gtattagcat ctgtttccag 1320

gtgttatccc ccgcttctgg gcaggtttcc cacgtgttac tcaccagttc gccactcact 1380

caaatgtaaa tcatgatgca agcaccaatc aataccagag ttcgttcgac tgcagtatag 1440

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggttacctta cgactt 16

Claims

1.一种高产淀粉酶的植物乳杆菌，其特征在于，所述高产淀粉酶的植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14177，保藏日期为2017年5月19日。

2.如权利要求1所述的高产淀粉酶的植物乳杆菌在马铃薯粉固态发酵方面的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)种子培养液制备：将所述高产淀粉酶的植物乳杆菌接种至MRS液体培养基，室温，厌氧条件下培养；取菌液，离心，倒掉上清液后再用无菌水洗菌体，离心，如此重复多次，加适量无菌水震荡均匀，制成菌落浓度>10⁸cfu/mL的植物乳杆菌发酵液备用；

(2)马铃薯发酵方法：称取马铃薯，去皮后切成小块，加入少量水，用打浆机打碎，接入所述步骤(1)得到的植物乳杆菌发酵液，搅匀后，密封，放入培养箱中进行发酵，得到马铃薯发酵浆液；

(3)马铃薯淀粉的提取：称取所述步骤(2)得到的马铃薯发酵浆液用80目筛进行过滤，蒸馏水重复冲洗多次使浆液中的保留在筛面的物质被过滤除去；用NaOH溶液将滤液pH值调整至10.4，混匀，离心，弃上清液；用蒸馏水将沉淀物洗涤、离心，重复多次至淀粉浆呈白色；离心，将沉淀上层黄色物质小心刮去，取下层乳白色物质，铺平，干燥，粉碎过80目筛，得到经过所述高产淀粉酶的植物乳杆菌发酵处理的马铃薯淀粉。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)种子培养液制备具体为：将所述高产淀粉酶的植物乳杆菌以3％的接种量接种至MRS液体培养基，在31℃，厌氧条件下培养18h，取菌液4000r/min，离心15min，倒掉上清液后再用无菌水洗菌体，离心，如此重复2-3次，加适量无菌水震荡均匀，制成菌落浓度>10⁸cfu/mL的植物乳杆菌发酵液备用。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)马铃薯发酵方法具体为：称取新鲜洗净马铃薯，去皮后切成小块，加入少量水，用打浆机打碎，接入所述步骤(1)得到的植物乳杆菌发酵液，接种量为8％；在和面机中搅匀后，密封，放入恒温恒湿培养箱中，在31℃，湿度80％的条件下进行发酵，得到马铃薯发酵浆液。

6.如权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)马铃薯淀粉的提取具体为：称取所述步骤(2)得到的马铃薯发酵浆液用80目筛进行过滤，蒸馏水重复冲洗多次使浆液中的纤维素被过滤除去；用0.1mol/L NaOH溶液将滤液pH值调整至10.4，磁力搅拌器搅拌1h，4000r/min离心15min，弃上清液；用蒸馏水将沉淀物洗涤、离心，重复多次至淀粉浆呈白色，pH为7±0.5；离心后将沉淀上层黄色物质小心刮去，取下层乳白色物质，在平皿上铺平，电热鼓风干燥箱40℃干燥过夜，粉碎过80目筛，得到经过所述高产淀粉酶的植物乳杆菌发酵处理的马铃薯淀粉。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的干燥温度是40℃，时间是12h。

8.如权利要求1所述的高产淀粉酶的植物乳杆菌在分解淀粉方面的应用。

9.如权利要求1所述的高产淀粉酶的植物乳杆菌在淀粉质原料的发酵方面的应用。

10.如权利要求1所述的高产淀粉酶的植物乳杆菌用作益生菌或用于益生菌产品。