CN103289925A

CN103289925A - 一株高产淀粉酶的乳酸菌及其应用

Info

Publication number: CN103289925A
Application number: CN2013102011415A
Authority: CN
Inventors: 张莉力; 许云贺; 于洋
Original assignee: LIAONING MEDICAL UNIVERSITY
Current assignee: LIAONING MEDICAL UNIVERSITY
Priority date: 2013-05-27
Filing date: 2013-05-27
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-05-27
Also published as: CN103289925B

Abstract

一株高产淀粉酶的乳酸菌及其应用，该乳酸菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillusparacasei）LHY006，已于2013年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7480。其应用在紫薯米浆发酵饮料中；主要原料的重量份数组成为：紫薯粉8份，大米粉7份，菊粉1.8份，脱脂乳粉2份，稳定剂0.2份，白砂糖8份，发酵剂3份，纯净水150份；紫薯米浆发酵饮料是一种具有优良营养保健作用的饮品。

Description

一株高产淀粉酶的乳酸菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株高产淀粉酶的乳酸菌及其应用在紫薯米浆发酵饮料中。

技术背景

乳酸菌能改善食品的风味、品质和营养、延长保质期，具有调节人体肠道菌群平衡、抑制病原菌的生长、降低胆固醇、提高免疫力、延缓衰老等重要的生理保健作用，被广泛应用于食品行业，乳酸菌发酵食品也被认为是功能性食品。目前市场上最常见的富含乳酸菌的食品是酸牛乳，这种以动物乳为基料的酸乳胆固醇含量较高，不适合中老年人长期饮用，而以植物原料为基料的乳酸菌发酵饮品却可以弥补这一缺陷。

紫薯是从日本引进我国的甘薯新品种，因其含有十分丰富的花青素、硒、多糖、植物蛋白、维生素和矿物质等多种营养成分，而成为当前食品加工人员的研究热点。大米中各种营养素也具有很高营养功效，是补充营养素的基础食物，具有补脾、和胃、清肺功效。如果能将紫薯、大米、益生性乳酸菌三者结合，集三者的保健功效于一体，开发出乳酸菌发酵植物饮品，对于提高机体免疫力、预防疾病具有重要的辅助作用。

但是，由于乳酸菌对营养要求严格、绝大多数不能直接利用淀粉，所以在紫薯米浆基质中生长缓慢、产酸不足，成为限制紫薯米浆乳酸菌发酵饮品开发的瓶颈。

发明内容：

本发明的目的就是针对乳酸菌在淀粉基质中生长缓慢、产酸能力弱，制约了以淀粉为主要基质的乳酸菌发酵饮品的开发这一问题，提供一株高产淀粉酶的乳酸菌，该乳酸菌能够在紫薯米浆等高淀粉含量的基质中快速生长、产酸。

本发明的另一目的在于，以筛选到的高产淀粉酶的乳酸菌和市售的双歧杆菌为发酵菌株，发酵生产紫薯米浆发酵饮料，提供“紫薯米浆发酵饮料”生产方法。该方法生产的紫薯米浆发酵饮料不仅含有紫薯和米浆中的花青素、维生素、硒、大米蛋白等多种活性物质，而且含有大量的人体重要的益生菌，对于提高机体免疫力、预防疾病具有重要的辅助作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一株高产淀粉酶的乳酸菌，该乳酸菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LHY006，已于2013年 4 月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7480。

所述的副干酪乳杆菌菌株的个体形态特征：大小为（0.5μm～0.7μm）×（1.0μm～1.2μm），杆状或长杆状，菌体分裂后呈链状排列，革兰氏阳性，无芽孢。菌落形态特征：菌落大小在2 mm～3mm，菱形，乳白色，不透明，菌落边缘整齐，表面光滑。生理生化特征为：兼性厌氧，过氧化氢酶阴性，不能运动，硫化氢、硝酸盐还原、明胶实验阴性，代谢葡萄糖产酸不产气，能代谢果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖、山梨醇、鼠李糖、松三糖、蜜二糖、纤维二糖产酸，不能利用棉籽糖、阿拉伯糖。

该菌株的16 S rDNA 序列全长共 1531 bp，经Genbank比对相似性达到99.8%；确定为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LHY006。

该菌株从辽宁省锦州市的淀粉生产厂的废水中分离获得，经测定其可以在高淀粉食品基质中快速生长且产酸能力强，能够在紫薯米浆发酵过程中快速生长并产酸。

本发明提供利用副干酪乳杆菌LHY006和双歧杆菌发酵生产紫薯米浆发酵饮料的方法，以下原料按重量份数取：

紫薯米浆发酵饮料的原料重量份数组成：紫薯粉8份、大米粉7份、菊粉1.8份、脱脂乳粉2份、稳定剂0.2份、白砂糖8份、发酵剂3份、纯净水150份。

具体为：用接种环挑取三环斜面保藏的副干酪乳杆菌LHY006于5mL种子培养基（种子培养基配方：脱脂乳粉20g、葡萄糖50g、紫薯粉50g、大米粉30g、纯净水1000mL）中，40℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中40℃下发酵12h，获得副干酪乳杆菌LHY006的种子培养液。

用接种环挑取三环双歧杆菌菌粉接入到5mL种子培养基中，40℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中40℃下发酵12h，获得双歧杆菌种子培养液。

将上述副干酪乳杆菌LHY006和双歧杆菌种子培养液按照1:1的比例混合后，以体积3%的接种量接入种子培养基中，40℃下发酵12h，得到混合菌液的发酵剂。

将紫薯粉8份、大米粉7份和纯净水150份放入搅拌机中，200-230r/min搅拌2min，90℃加热10min，然后冷却至60℃，加入菊粉1.8份、脱脂乳粉2份、白砂糖8份和稳定剂0.2份，200-230r/min搅拌2min，然后冷却至40℃，加入发酵剂，灌装后于40℃下发酵8h，发酵结束后，在2～5℃后熟12h，即得紫薯米浆发酵饮料。

上述所说的稳定剂为瓜尔豆胶、羧甲基纤维素、卡拉胶的混合物，三者的质量比为10：8：9。

本发明所用材料性能及使用后所产生的效果：

本发明提供的副干酪乳杆菌LHY006可以在高淀粉食品基质中快速生长且产酸能力强，能够在紫薯米浆发酵过程中快速生长并产酸。与市售的副干酪乳杆菌GM080发酵紫薯米浆相比具有的优点见表1。由表1可以看出以副干酪乳杆菌LHY006为发酵剂：

优点一：简化了发酵工艺。以副干酪乳杆菌GM080与双歧杆菌为发酵剂生产紫薯米浆饮料至少需要四步发酵工序，即首先要利用淀粉酶将紫薯米浆中的淀粉经液化和糖化水解为葡萄糖或麦芽糖，然后再经副干酪乳杆菌GM080发酵将葡萄糖或麦芽糖水解为乳酸；而本发明以副干酪乳杆菌LHY006与双歧杆菌为发酵剂发酵紫薯米浆饮料仅需两步工序，副干酪乳杆菌LHY006产淀粉酶活力高，直接就可利用淀粉生成葡萄糖或乳酸，省去了淀粉酶水解淀粉工序。这为实际生产节约了大量的人力和物力。

优点二：以副干酪乳杆菌LHY006和双歧杆菌为发酵剂，发酵时间明显缩短，以副干酪乳杆菌GM080和双歧杆菌为发酵剂，pH降到4.5所需的发酵时间为12h，而以副干酪乳杆菌LHY006和双歧杆菌为发酵剂，pH降到4.5所需的发酵时间为8h。

优点三：以副干酪乳杆菌LHY006为发酵剂，发酵结束后紫薯米浆发酵饮料中益生菌数量（副干酪乳杆菌和双歧杆菌之和）显著高于以副干酪乳杆菌GM080为发酵剂的紫薯米浆，前者为2.3×10⁸cfu/mL，后者为3.6×10⁷ cfu/mL, 以副干酪乳杆菌LHY006为发酵剂益生菌数量高，增强了其对人体的益生性能。

具体实施方式

实施例1

副干酪乳杆菌LHY006分离、筛选与鉴定

1 分离培养基：以可溶性淀粉替代MRS培养基中葡萄糖作为碳源，具体成分及其配比如下：蛋白胨10g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，可溶性淀粉20g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，碳酸钙5g，蒸馏水1000mL。调pH至6.2～6.4，115℃灭菌30min。

2 检测方法

2.1 淀粉酶活力检测方法

1％底物溶液：称取甘薯淀粉1.0g，在25mL 0.4mol/L的NaOH溶液溶解，在沸水浴中加热l0min，待其冷却后加入25mL 0.4mol/L的CH₃COOH溶液，调节pH至7.0，然后定容在100mL容量瓶中。

0.005％碘液：称取碘0.5g和KI5.0g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。

取10mL 1％底物溶液于试管中，40℃水浴预热10min后，取1ml发酵液加入其中，摇匀，然后40℃精确保温10min。吸取lmL于盛有10mL 0.1mol/L HCl的试管中，再取0.5mL混合液体于盛有10mL 0.005％碘液的试管中，摇匀，并立即用分光光度计测其在660nm处吸光度。用同样方法测定空白值D₀，用以1.0mL的不含菌的培养基代替发酵液，其余步骤同上。用蒸馏水作为参比。

酶活定义：将淀粉酶单位定义为在上述测定条件下，反应lmin使1％底物溶液的显蓝强度降低1％所需的酶量为1个单位。

酶活=(D₀—D)×100×发酵液稀释倍数／(D₀×10)

D₀为空白值吸光度，D为主值吸光度，100为系数(％)，10为反应时间(min)。

2.2 乳酸检测方法

高效液相色谱法检测发酵液中乳酸含量。色谱柱：C₁₈ RS柱（5μm,4.6×150mm）；流动相：甲醇:0.01mol/L磷酸（5:95），流速1mL/min，紫外检测器，检测波长210nm，柱温：室温。

3 分离方法（平板涂布法）

3.1 样品的稀释

用无菌吸管吸取淀粉废水5mL，移入盛有45mL无菌生理盐水带玻璃珠的三角瓶中，充分振摇均匀，即为10^-1的样品稀释液。用无菌生理盐水对10^-1的样品稀释液进行梯度稀释至10^-7。

3.2平板分离培养

取上述10^-6、10^-7稀释度的稀释液各1mL分别注入无菌培养皿中，每个稀释度做两个重复。以无菌操作按20-30g/L的量将灭菌的CaCO₃加入熔化了的分离培养基中，于自来水中迅速冷却至50℃左右，边冷却边摇晃将瓶内CaCO₃摇匀的同时，立刻倒入培养皿内摇匀，使样品稀释液和CaCO₃均匀分布于培养基中。待培养基凝固后，倒置于30℃温箱中培养24h～48h。

3.3 平板接种培养

用接种环挑取菌落周围产生CaCO₃溶解圈的菌落，划线接种于分离培养基平板中，30℃培养24h，反复纯化3代，得到单菌落接种于MRS斜面培养基上，30℃培养48h。

3.4 菌株筛选

3.4.1 初筛

取上述斜面培养物1环，进行涂片、革兰氏染色，油镜观察个体形态和纯度。同时挑取1环培养物与载玻片上的3%H₂O₂混匀，观察产气泡情况。筛选出革兰氏染色阳性过氧化氢酶阴性的菌株接种于MRS培养基斜面，此类菌株即为可以利用淀粉作为碳源的疑似乳酸菌菌株。

3.4.2 复筛

将初筛获得的疑似乳酸菌菌株活化后接入以可溶性淀粉替代葡萄糖的MRS培养液中，30℃培养24h后，以发酵液的淀粉酶活力和乳酸含量为指标，筛选出一株淀粉酶活力高、产酸速度快的乳酸菌菌株LHY006。

3.5 菌种鉴定

3.5.1 乳酸菌LHY006的形态特征观察

将乳酸菌菌株LHY006在MRS培养基中30℃下培养48h，然后进行革兰氏染色，其个体形态特征见表2-1。

表2-1 LHY006菌株的形态特征

菌株

菌体大小

细胞形态

细胞分裂后的排布方式

革兰氏染色

芽孢

运动性

LHY006

(0.5μm～0.7μm)×(1.0μm～1.2μm)

杆状或长杆状

链状

革兰氏阳性

无

不运动

菌株LHY006在MRS培养基，30℃下培养48h，观察菌落大小、形态和颜色，结果见表2-2。

表2-2 菌落形态特征

3.5.2 乳酸菌LHY006的生理生化特征

根据常规生理生化鉴定，结果见表2-3，参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步判断菌株LHY006为乳杆菌属。

表2-3菌株生理生化特性

测试项目	结果	测试项目	结果
				过氧化氢酶	-	乳糖	+
运动性试验	-	半乳糖	+
				H2S试验	-	麦芽糖	+
硝酸盐还原	-	甘露醇	+
				明胶液化	-	山梨醇	+
15℃生长	+	棉子糖	-
				45℃生长	-	甘露糖	+
葡萄糖酸盐	+	鼠李糖	+
				葡萄糖产气	-	松三糖	+
葡萄糖产酸	+	蜜二糖	+
				木糖	-	七叶糖	+
果糖	+	阿拉伯糖	-
				蔗糖	+	纤维二糖	+

3.5.3 乳酸菌LHY006的16S rDNA序列分析结果

该菌株的16 S rDNA 序列全长共 1531 bp，经Genbank比对相似性达到99.8%；

经产淀粉酶能力和乳酸产生速度的初筛、复筛最终得到1株能够快速代谢淀粉产生乳酸的菌株，通过菌体的群体形态观察、个体形态观察、生理生化试验结果及菌株的16 S rDNA 序列比对，确定该菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌LHY006（Lactobacillus paracasei LHY006），已于2013年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院，中科院微生物研究所，邮编100101），保藏编号为CGMCC No. 7480。

实施例2

副干酪乳杆菌LHY006在紫薯米浆发酵饮料中的应用

1、试验材料

试验用的菌株为本发明分离的副干酪乳杆菌LHY006和市售的双歧杆菌菌粉（购于北京川秀科技有限公司），食品原料选择紫薯粉、大米粉、菊粉、脱脂乳粉、白砂糖、纯净水、瓜尔豆胶、羧甲基纤维素、卡拉胶（三种稳定剂均购自青岛天新食品添加剂有限公司）。

2 、发酵剂的制备

⑴ 种子培养基配方：脱脂乳粉20g、葡萄糖50g、紫薯粉50g、大米粉30g、纯净水1000mL。

⑵ 副干酪乳杆菌LHY006种子培养液制备方法：用接种环挑取三环斜面保藏的副干酪乳杆菌LHY006于5mL种子培养基中，40℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中40℃下发酵12h，获得副干酪乳杆菌LHY006种子培养液。

⑶ 双歧杆菌种子培养液制备方法：用接种环挑取三环双歧杆菌菌粉接入到5mL种子培养基中，40℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中40℃下发酵12h，获得双歧杆菌种子培养液。

⑷ 混菌发酵剂制备方法：将上述副干酪乳杆菌LHY006种子培养液和双歧杆菌种子培养液按照体积比1:1的比例混合后，以体积3%的接种量接入种子培养基中，40℃下发酵12h，得到混合菌液的发酵剂。

3、发酵生产紫薯米浆发酵饮料的方法

本发明从淀粉生产厂的废水中筛选到一株高产淀粉酶的副干酪乳杆菌LHY006，利用该菌株高产淀粉酶的特性，与双歧杆菌共同发酵紫薯米浆饮料，不仅省去了糖化淀粉工序，而且利用紫薯中的多种氨基酸、维生素和加入的菊粉显著提高了紫薯米浆中副干酪乳杆菌和双歧杆菌的数量，解决了乳酸菌在高淀粉培养基中生长缓慢和产酸量不足的缺陷。

本发明提供的紫薯米浆发酵饮料是一种具有优良营养保健作用的饮品，将紫薯、大米和益生性乳酸菌的保健作用结合在一起，对于提高机体免疫力、预防疾病具有重要的辅助作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 辽宁医学院

<120> 一株高产淀粉酶的乳酸菌及其应用

<130> 001

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1531

<212> DNA

<213> 副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）

<400> 1

agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgaac 60

gagttctcgt tgatgatcgg tgcttgcatc gagattcaac atggaacgag tggcggacgg 120

gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcccttaa gtgggggata acatttggaa acagatgcta 180

ataccgcata gatccaagaa ccgcatggtt cttggctgaa agatggcgta agctatcgct 240

tttggatgga cccgcggcgt attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcgatga 300

tacgtagccg aactgagagg ttgatcggcc acattgggac tgagacacgg cccaaactcc 360

tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg 420

cgtgagtgaa gaaggctttc gggtcgtaaa actctgttgt tggagaagaa tggtcggcag 480

agtaactgtt gtcggcgtga cggtatccaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc 540

agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc 600

aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ctcggcttaa ccgaggaagc gcatcggaaa 660

ctgggaaact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta 720

gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgtaactg acgctgaggc 780

tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacggtga 840

atgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc agtgccgcag ctaacgcatt aagcattccg 900

cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 960

gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcttt 1020

tgatcacctg agagatcagg tttccccttc gggggcaaaa tgacaggtgg tgcatggttg 1080

tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatgac 1140

tagttgccag catttagttg ggcactctag taagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg 1200

tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg 1260

atggtacaac gagttgcgag accgcgaggt caagctaatc tcttaaagcc attctcagtt 1320

cggactgtag gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc 1380

acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt 1440

gtaacacccg aagccggtgg cgtaaccctt ttagggagcg agccgtctaa ggtgggacaa 1500

atgattaggg tgaagtcgta acaaggtaac c 1531

Claims

1.一株高产淀粉酶的乳酸菌，其特征在于该乳酸菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LHY006，已于2013年 4 月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7480。

2.根据权利要求1所述的一株高产淀粉酶的乳酸菌，其特征在于，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LHY006应用在紫薯米浆发酵饮料中。

3.根据权利要求2所述的紫薯米浆发酵饮料，其特征是其主要原料的重量份数组成为：

紫薯粉8份，大米粉7份，菊粉1.8份，脱脂乳粉2份，稳定剂0.2份，白砂糖8份，发酵剂3份，纯净水150份；上述所说的稳定剂为瓜尔豆胶、羧甲基纤维素、卡拉胶的混合物，三者的质量比为10：8：9。

4.根据权利要求3所述的紫薯米浆发酵饮料，其特征是，包括以下步骤：将紫薯粉8份、大米粉7份和纯净水150份放入搅拌机中，200-230r/min搅拌2min，90℃加热10min，然后冷却至60℃，加入菊粉1.8份、脱脂乳粉2份、白砂糖8份和稳定剂0.2份，200-230r/min搅拌2min，然后冷却至40℃，加入发酵剂，灌装后于40℃下发酵8h，发酵结束后，在2～5℃后熟12h，即得紫薯米浆发酵饮料。

5.根据权利要求3所述的紫薯米浆发酵饮料，其特征是，上述所用的发酵剂采用下列方法制备：

⑴ 种子培养基配方：脱脂乳粉20g、葡萄糖50g、紫薯粉50g、大米粉30g、纯净水1000mL；

⑵ 副干酪乳杆菌LHY006种子培养液制备方法：用接种环挑取三环斜面保藏的副干酪乳杆菌LHY006于5mL种子培养基中，40℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中40℃下发酵12h，获得副干酪乳杆菌LHY006的种子培养液；

⑶ 双歧杆菌种子培养液制备方法：用接种环挑取三环双歧杆菌菌粉接入到5mL种子培养基中，40℃下发酵12h后，将这5mL发酵液扩大培养，继续接入100mL种子培养基中40℃下发酵12h，获得双歧杆菌种子培养液；

⑷ 将上述副干酪乳杆菌LHY006种子培养液和双歧杆菌种子培养液按体积比1:1混合后，以体积3%的接种量接入种子培养基中，40℃下发酵12h，得到混合菌液的发酵剂。