CN102511847A

CN102511847A - 螺旋藻提取物的制备方法

Info

Publication number: CN102511847A
Application number: CN2012100017817A
Authority: CN
Inventors: 吴力克; 毛青; 王宇明
Original assignee: First Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; First Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2012-01-05
Filing date: 2012-01-05
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明公开了螺旋藻生物提取方法，包括三个步骤：发酵前处理步骤，即将螺旋藻细粉经超微粉化处理，再加入所述复合培养基进行发酵，制得发酵原液；发酵步骤，即将发酵原液接种嗜螺旋藻双歧杆菌进行发酵，制得发酵液；发酵后处理步骤，即将发酵液去除菌体并灭酶，浓缩，干燥，制得螺旋藻主要化学成分提取物；本发明采用超微粉化物理方法和双歧杆菌发酵生物方法相结合的工艺对螺旋藻细粉进行处理，可有效消除螺旋藻的难闻腥味，从而改善最终产品的口感；可有效破坏螺旋藻的细胞结构，游离出所含蛋白质，从而提高蛋白质提取率；可将高蛋白充分分解转化为寡肽，提高寡肽含量，从而使最终产品易于吸收利用；本发明方法操作简便，成本低廉，环境污染小。

Description

螺旋藻提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及植物中主要化学成分的提取方法，特别涉及螺旋藻主要化学成分的生物提取方法。

背景技术

螺旋藻（Spirulina）是一种多细胞丝状微藻，其营养成分极其丰富，蛋白质含量高达60-70%，且蛋白质组成合理，富含人体必需而又不能自行合成的八种氨基酸，是迄今为止所发现的最优秀的天然蛋白质食品源，此外，螺旋藻还含有丰富的维生素和矿物质等。大量研究表明，螺旋藻在降血脂、抗癌、抗衰老、抗辐射、护肝、提高机体免疫力与造血功能、调节代谢机能等方面均具有保健功效。目前，市售的螺旋藻产品主要是螺旋藻细粉或以螺旋藻细粉按常规制剂方法制成的片剂或胶囊剂，其存在如下问题：一，螺旋藻具有较重的腥味，现有的螺旋藻产品未能消除此腥味，造成嗅觉刺激和口感不适；二，螺旋藻所含蛋白质主要存在于螺旋藻细胞内，简单加工方法不能破坏螺旋藻的细胞壁，难以释放出其所含的蛋白质；三，螺旋藻所含蛋白质中大多数为分子量在5万以上的高蛋白，其只有被人体消化成小分子肽后才能被吸收利用，但人体有效的消化吸收率很低；此外，高蛋白摄取量过多时，还会产生较多的副作用。因此，螺旋藻虽然营养价值非常高，但其真正的应用价值目前并未充分体现出来。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供两类培养基，其可以用于螺旋藻的发酵，其成本低，收率高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

螺旋藻发酵培养基，按重量份计含有以下组分：质量分数为5%的肝浸液4-6份，质量分数为1%的水苏糖3-7份。

优选的，按重量份计含有以下组分：质量分数为5%的肝浸液4份，质量分数为1%的水苏糖5份。

含有所述的螺旋藻发酵培养基的复合培养基，每1000mL复合培养基中由15g蛋白胨, 6g酵母浸膏，0.5g可溶淀粉,5g氯化钠，5g葡萄糖，琼脂20g，70-130 mL螺旋藻发酵培养基，余量为体积百分比为20%的西红柿汁。

本发明的另一目的在于克服现有技术存在的不足，提供生物提取螺旋藻寡肽的制备方法，其操作简便、成本低廉，所得产品无腥味、提取率高、寡肽含量高、吸收性好。

基于所述的螺旋藻发酵培养基或所述的复合培养基的螺旋藻提取物制备方法，具体包括以下步骤：

a、发酵前处理

将螺旋藻细粉经超微粉化处理，再加入发酵辅助营养成分，制得发酵原液；

b、发酵

将步骤a所得发酵原液接种于双歧杆菌，用所述复合培养基进行发酵，制得发酵液；

c、发酵后处理

将步骤b所得发酵液去除菌体并灭酶，浓缩，干燥，即制得螺旋藻提取物。

优选的，步骤a中所述超微粉化处理是将螺旋藻细粉粉碎成平均粒径为60-80 μm的超微粉，所述发酵原液中螺旋藻细粉的质量百分浓度为10%。

优选的，步骤b中，所述双歧杆菌的种龄为复苏后培养34小时，接种量为体积百分浓度2％。

优选的，步骤b中，所述发酵条件为：温度35℃，初始pH值6.5，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，发酵周期72小时。

优选的，步骤c中所述去除菌体并灭酶是取步骤b所得发酵液，离心去除菌体，收集上清液，超声破碎其中残存菌体，再加热至温度100℃灭酶20分钟。

优选的，步骤c中，所述干燥为冷冻干燥，具体工艺为：冷冻温度为零下50至零下70摄氏度，升华温度为30摄氏度，冷冻干燥时间为72小时。

优选的，在步骤c后，还包括将所述螺旋藻提取物制粒，具体为：将所述螺旋藻提取物与β-环糊精按质量比为8:2的比例混合。

本发明的有益效果在于：采用超微粉化物理方法和双歧杆菌发酵生物方法相结合的工艺对螺旋藻细粉进行处理，可有效消除螺旋藻的难闻腥味，从而改善最终产品的口感；可有效破坏螺旋藻的细胞结构，游离出所含蛋白质，从而提高蛋白质提取率；可将高蛋白充分分解转化为寡肽，提高寡肽含量，从而使最终产品易于吸收利用；本发明提取方法操作简便，使用的原料、溶剂和微生物均无毒无害，不采用强酸、强碱和有机溶剂，成本低廉，杜绝强烈化学反应导致的产品质量问题以及化学溶剂残留所带来的潜在健康威胁，基本做到三废的零排放，可取得显著的经济效益、社会效益和生态效益，具有良好的应用前景和推广价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为双歧杆菌的生长曲线图；

图2为发酵辅助碳源优化试验结果；

图3为螺旋藻寡肽含量与双歧杆菌CGMCC No.2407生物量的关联度分析图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

为了考察本发明技术方案的有效性，发明人首先进行了以下工艺条件优化试验：

1、发酵菌种优化试验

方法：将螺旋藻超微粉用蒸馏水溶解，制成质量百分浓度为10％的浸液，作为发酵原液，于温度110℃、0.2MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却备用；将待选菌种（长双岐杆菌或青春双岐杆菌）接种于发酵原液中进行发酵，发酵条件为：温度35℃，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，厌氧培养48小时，制得发酵液；考察发酵液中的活菌生物量和螺旋藻寡肽含量；活菌生物量测定采用平板培养法；螺旋藻寡肽含量测定是以质量百分浓度为16％的单宁酸为蛋白质沉淀剂，使发酵液中2300Da以上的高分子蛋白沉淀后，离心，用考马斯亮兰微量法测定上清液中的寡肽含量。

结果：见表1；从表可知，长双岐杆菌（CGMCC No.1085，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点：中国.北京.中关村）。的发酵性能优于青春双岐杆菌。

2、发酵接种种龄优化试验

方法：将螺旋藻超微粉用蒸馏水溶解，制成质量百分浓度为10％的浸液，作为发酵原液，于温度110℃、0.2 MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却备用；将所述长双岐杆菌接种于发酵原液中进行发酵，发酵条件为：温度35℃，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，厌氧培养，制得发酵液；定时考察发酵液中的活菌生物量。

结果：见图1；适宜种龄应选择菌株对数生长后期，处于此期的菌株对新培养环境的适应期缩短，接种后能够迅速生长，有利于缩短发酵周期；从图可知，复苏后培养34小时，菌株繁殖已处于对数生长后期，因此，发酵适宜接种种龄为复苏后培养34小时。

3、发酵接种量优化试验

方法：将螺旋藻超微粉用蒸馏水溶解，制成质量百分浓度为10％的浸液，作为发酵原液，于温度110℃、0.2 MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却备用；将复苏后培养34小时的所述长双岐杆菌以不同接种量接种于发酵原液中进行发酵，发酵条件为：温度35℃，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，厌氧培养34小时，制得发酵液；考察发酵液中的活菌生物量和螺旋藻寡肽含量。

结果：见表2；从表可知，接种量对发酵性能有显著影响，所述长双岐杆菌发酵适宜接种量为体积百分浓度2％。

4、发酵辅助碳源优化试验

方法：将螺旋藻超微粉和待选碳源（葡萄糖、水苏糖、蔗糖、棉籽糖或麦芽糖）用蒸馏水溶解，制成发酵原液（含有质量百分浓度为10％的螺旋藻及质量百分浓度为5％的待选碳源），于温度110℃、0.2 MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却备用；将复苏后培养34小时的所述长双岐杆菌以体积百分浓度为2％的接种量接种于发酵原液中进行发酵，发酵条件为：温度35℃，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，厌氧培养48小时，制得发酵液；考察发酵液中的活菌生物量。

结果：见图2；从图可知，在待选碳源中，发酵适宜辅助碳源为水苏糖。

5、发酵原液各成分配比优化试验

方法：以螺旋藻超微粉、水苏糖、质量百分浓度为5％的猪肝浸液为三因素，各取三个质量百分浓度水平，采用L⁹（3⁴）正交表设计正交试验，如表3和表4所示，制备各发酵原液，于温度110℃、0.2 MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却备用；将复苏后培养34小时的所述长双岐杆菌以体积百分浓度为2％的接种量接种于各发酵原液中进行发酵，发酵条件为：温度35℃，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，厌氧培养48小时，制得发酵液；考察各发酵液中的活菌生物量。

结果：见表4和表5；由直观分析及方差分析可知，A、B和C三因素对所述长双岐杆菌的生长均具有显著性影响，且影响大小为A＞C＞B，以活菌生物量高为优化指标，三因素适宜组合为A2B2C1，即发酵原液适宜由下述按质量百分浓度配比的各成分组成：螺旋藻超微粉质量百分浓度为10％，水苏糖5％，质量百分浓度为5％的猪肝浸液的体积百分浓度为4％，余量为水。

6、发酵条件优化实验

方法：发酵原液由下述按质量百分浓度配比的各成分组成：质量百分浓度为10％的，质量百分数为5%的水苏糖，质量百分浓度为5％的猪肝浸液4％（即为0.02%），余量为水；于温度110℃、0.2 MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却备用；将复苏后培养34小时的所述长双歧杆菌以体积百分浓度为2％的接种量接种于发酵原液中进行发酵；以温度、初始pH值、发酵周期为三因素，各取三个水平，采用L₉（3⁴）正交表设计正交试验，如表6和表7所示，制备各发酵液；考察各发酵液中的活菌生物量。

结果：见表7和表8；由直观分析及方差分析可知，因素A、B和C对所述长双歧杆菌的生长均具有显著性影响，且影响大小为A＞C＞B，以活菌生物量高为优化指标，三因素适宜组合为A2B2C2，即适宜发酵条件为：温度35℃，初始pH值6.5，发酵周期72小时。

7、螺旋藻寡肽含量与所述长双歧杆菌生物量的关联度分析

方法：发酵原液由下述按质量百分浓度配比的各成分组成：螺旋藻超微粉10％，水苏糖5％，质量百分浓度为5％的猪肝浸液4％，余量为水；于温度110℃、0.2 MPa高压蒸汽灭菌20分钟，冷却备用；将复苏后培养34小时的所述长双歧杆菌以体积百分浓度为2％的接种量接种于发酵原液中进行发酵，发酵条件为：温度35℃，初始pH值6.5，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，厌氧培养72小时，制得发酵液；定时考察发酵液中的活菌生物量和螺旋藻寡肽含量。

结果：见图3；从图可知，随着发酵时间的延长，螺旋藻寡肽含量与活菌生物量均呈逐渐上升趋势，提示螺旋藻寡肽含量与所述长双歧杆菌生物量呈一定相关性；寡肽含量在发酵40小时下降至最低，此时所述长双歧杆菌处于对数生长期，可能与细菌繁殖消耗利用有关。

实施例一螺旋藻提取物的制备

本实施例螺旋藻提取物的制备方法，包括以下步骤：

a、发酵前处理

取平均粒径为150-250 μm的食品级螺旋藻细粉（山东无棣富斯特生物工程公司），称重，过60目筛，去除杂质和结块，所得细粉在液氮（温度-123℃）中浸没4-5次，每次2分钟，使粉体充分冻结至裂碎临界点（即玻璃点）；再将冻结粉体置圆盘式气流磨中，借助气流的高速撞击运动，将冻结粉体粉碎至平均粒径为60-80 μm的超微粉，烘干，备用；

取食品级水苏糖（西安大鹏生物科技股份有限公司），备用；

取猪肝浸粉（北京奥博星生物技术责任有限公司）25 g，加入温度为70-80℃的蒸馏水500 mL使溶解，制得质量百分浓度为5％的猪肝浸液，备用；

按下述配比取各成分制备发酵原液：螺旋藻超微粉1000 g、水苏糖500 g、质量百分浓度为5％的猪肝浸液400 g，蒸馏水补足体积至10 L，即得；

b、发酵

取所述长双歧杆菌，复苏后培养34小时，以体积百分浓度为2％的接种量接种于步骤a所得的发酵原液中进行厌氧液体深层发酵，制得发酵液；发酵条件为：温度35℃，初始pH值6.5，间歇式搅拌100 r/min、 5min/2h，发酵周期72小时；

c、发酵后处理

取步骤b所得的发酵液，4000 r/min离心10分钟，收集上清液，超声处理至菌体充分破碎，破碎上清液中残存菌体，再加热至温度100℃灭酶20分钟，喷雾干燥，即制得螺旋藻提取物。

实施例二螺旋藻提取物的制备

本实施例螺旋藻提取方法，包括以下步骤：

a、发酵前处理

取平均粒径为150-250 μm的食品级螺旋藻细粉（山东无棣富斯特生物工程公司），称重，过60目筛，去除杂质和结块，所得细粉置深低温冰箱（温度-85℃）中冷冻1小时，使粉体充分冻结至裂碎临界点（即玻璃点）；再将冻结粉体置循环管式气流磨中，借助气流的高速撞击运动，将冻结粉体粉碎至平均粒径为60-80 μm的超微粉，烘干，备用；

取含水量为50-60％的新鲜猪肝100 g，绞成碎末，加入蒸馏水500 mL，加热至温度100℃浸煮4小时，待降温至40℃时，分别用100目、200目、300目滤布分级过滤，压榨取滤液，备用；残余肝渣再次加入蒸馏水，浸煮2小时，待降温后重复分级过滤过程，压榨取滤液，合并二次滤液，3000 r/min离心5分钟，取上清，用蒸馏水定容至500 mL，即得质量百分浓度为5％的猪肝浸液，备用；

b、发酵

与实施例一所述方法相同；

c、发酵后处理

与实施例一所述方法相同。

实施例三螺旋藻提取物的制备

本实施例螺旋藻提取物的制备方法，包括以下步骤：

a、发酵前处理

取平均粒径为150-250 μm的食品级螺旋藻细粉（山东无棣富斯特生物工程公司），称重，过60目筛，去除杂质和结块，所得细粉置深低温冰箱（温度-50℃）中冷冻3小时，使粉体充分冻结至裂碎临界点（即玻璃点）；再将冻结粉体置对喷式气流磨中，借助气流的高速撞击运动，将冻结粉体粉碎至平均粒径为60-80 μm的超微粉，烘干，备用；

b、发酵

与实施例一所述方法相同；

c、发酵后处理

与实施例一所述方法相同。

螺旋藻发酵前后总氮、氨基酸态氮含量检测

取螺旋藻超微粉，加入蒸馏水使溶解，制成质量百分浓度为10％的浸液，作为发酵前样品液；取实施例步骤c中所述去除菌体并灭酶的上清液，作为发酵后样品液；

委托重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心检测发酵前后样品液中总氮、氨基酸态氮含量，结果见表9。

委托西南农业大学农产品质量与安全检测中心检测发酵前后样品液中水解氨基酸含量，结果见表10。

委托西南农业大学农产品质量与安全检测中心检测发酵前后样品液中游离氨基酸含量，结果见表11。

上述检测结果显示：螺旋藻发酵后样品液，与发酵前样品液比较，总氮含量明显增加，而代表游离氨基酸总量的氨基酸态氮含量增加不明显，与游离氨基酸含量检测结果相一致（发酵前后变化不大），表明所述长双歧杆菌的发酵主要导致螺旋藻寡肽含量增加。

本发明的螺旋藻提取物可作为饲料级、食品级或医药级中间体，进一步深加工或与其它物质配合使用；也可作为饲料级、食品级或医药级成品，单独使用；还可采用制剂学常规方法制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液或注射液等。

实施例四螺旋藻发酵物制粒

以实施例三所得的螺旋藻提取物为原料，辅料分别选择质量分数为10%、20%和30%的β-环糊精。制粒采用了的干法制粒（详见毕殿洲主表的“药剂学”）。堆密度、滑角和一般感官三个角度比较。比较详见表12。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

Claims

1.螺旋藻发酵培养基，其特征在于，按重量份计含有以下组分：质量分数为5%的肝浸液4-6份，质量分数为1%的水苏糖3-7份。

2.根据权利要求1所述的螺旋藻发酵培养基，其特征在于，按重量份计含有以下组分：质量分数为5%的肝浸液4份，质量分数为1%的水苏糖5份。

3.含有权利要求1所述的螺旋藻发酵培养基的复合培养基，其特征在于，每1000mL复合培养基中由15g蛋白胨, 6g酵母浸膏，0.5g可溶淀粉,5g氯化钠，5g葡萄糖，琼脂20g，70-130 mL海水螺旋藻发酵培养基，余量为体积百分比为20%的西红柿汁。

4.基于权利要求1所述的螺旋藻发酵培养基或权利要求2所述的复合培养基的螺旋藻提取物的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

a、发酵前处理

将螺旋藻细粉经超微粉化处理，再所述复合培养基进行发酵，制得发酵原液；

b、发酵

c、发酵后处理

将步骤b所得发酵液去除菌体并灭酶，浓缩，干燥，即制得螺旋藻主要化学成分提取物。

5. 根据权利要求4所述的螺旋藻提取物的制备方法，其特征在于，步骤a中所述超微粉化处理是将螺旋藻细粉粉碎成平均粒径为60-80μm的超微粉，所述发酵原液中螺旋藻细粉的质量百分浓度为10%。

6.根据权利要求4所述的螺旋藻提取物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述双歧杆菌的种龄为复苏后培养34小时，接种量为体积百分浓度2％。

7.根据权利要求4所述的螺旋藻提取物的制备方法，其特征在于，步骤b中，所述发酵条件为：温度35℃，初始pH值6.5，搅拌速度100 r/min，间歇搅拌5 min/2h，发酵周期72小时。

8.根据权利要求4所述的螺旋藻提取物的制备方法，其特征在于，步骤c中所述去除菌体并灭酶是取步骤b所得发酵液，离心去除菌体，收集上清液，超声破碎其中残存菌体，再加热至温度100℃灭酶20分钟。

9.根据权利要求4所述的螺旋藻提取物的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述干燥为冷冻干燥，具体工艺为：冷冻温度为零下50至零下70摄氏度，升华温度为30摄氏度，冷冻干燥时间为72小时。

10.根据权利要求4所述的螺旋藻提取物的制备方法，其特征在于，在步骤c后，还包括将所述螺旋藻主要化学成分提取物制粒，具体为：将所述螺旋藻提取物与β-环糊精按质量比为8:2的比例混合。