CN102018751A - 抗肝炎天然药物复方制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗肝炎天然药物复方制剂及其制备方法和应用,该复方制剂由甘草和螺旋藻按质量比为1~6∶1~6制成;其制备方法包括以下步骤:将甘草经粉碎、高压蒸气爆碎、酶解、超微粉碎、水提、发酵处理制得甘草发酵液;将螺旋藻经粉碎、超微粉碎、发酵处理制得螺旋藻发酵液;再将甘草发酵液和螺旋藻发酵液混合,离心去除菌体,超声去除上清液残留菌体,合并上清液和药泥,高温灭酶,干燥,即得;本发明复方制剂配方新颖,制备工艺独特,抗肝炎有效成分含量高,口服生物利用度好,在抑制病毒性肝炎的复发、促进炎症恢复和稳定肝功能方面有显著功效,可作为中间体用于制备抗肝炎药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种复方制剂,特别涉及一种抗肝炎天然药物复方制剂,还涉及该复方制剂的制备方法和应用。
背景技术
我国是肝炎大国,约有1.3亿乙肝病毒携带者、近3000万慢性乙型肝炎患者以及相近数量的其他各类肝炎患者。为这些患者提供更好的治疗药物和方法,对保护人民健康、维护社会稳定意义重大。目前,慢性病毒性肝炎的主流治疗方案包括病因治疗和护肝治疗,其中护肝药物占我国肝病药物消费的1/3以上,但被公认效果显著和稳定的一线药物极少,市场上对效果突出的抗病毒性肝炎新药有着迫切需求。
甘草在中国、印度和希腊的古代医药典籍中多有记载,至今已有几千年的使用历史,临床用于治疗呼吸系统、消化系统、免疫系统等多种疾病。由于甘草对多种疾病表现了良好的预防和治疗作用且毒副作用较小,近年来,对甘草潜在的多种药理活性的研究和挖掘一直是国内外药理界的研究热点。目前,多个试验结果表明甘草及其提取物具有抗炎、抗病毒、抗菌、保肝、抗癌、抗氧化、镇咳、免疫调解、降糖和抗血小板凝集等多种活性,证实甘草在肝病治疗、糖尿病治疗、缺血再灌注损伤、阿尔茨海默症、帕金森氏症、癫痫、抑郁、癌症治疗方面有更好的开发和应用前景。但现有甘草药学活性物质的提取方法多涉及强酸、强碱和各种有机溶剂的应用,存在以下诸多弊端:①不能有效解除甘草中富含的木质素和纤维素对活性物质溶出的结构阻隔作用,致使活性物质得率偏低,原料用量增大,废弃药渣增多,严重浪费资源和污染环境;②强酸、强碱或其它有机溶剂的剧烈化学反应,易造成活性物质的消旋化、异构化和结构重排等问题,影响活性物质的稳定性、纯度和药效;③部分有机溶剂具有毒性和腐蚀性,易燃易爆,对工作环境和人体健康存在安全威胁。
螺旋藻为天然药物,蛋白质含量高达60-70%且组成合理,富含人体必需而又不能自行合成的八种氨基酸,在降血脂、抗癌、抗衰老、抗辐射、护肝、提高机体免疫力与造血功能、调节代谢机能等方面均具有功效。大量研究表明,螺旋藻能够显著提高免疫功能,促进肝细胞再生,抗自由基损伤,阻止肝细胞坏死,并对肠道双歧杆菌有明显促增殖作用。近期报道螺旋藻具有明确的抗病毒作用,其抗人免疫缺陷病毒(HIV)和人乳头状瘤病毒(HPV)的效果令人关注。目前,市售的螺旋藻制剂主要是螺旋藻粉或将螺旋藻粉按常规制剂方法制成的片剂或胶囊剂,其制备方法存在以下问题:①螺旋藻所含蛋白质主要存在于螺旋藻细胞内,而螺旋藻细胞壁较厚,内壁含有肽聚糖、外壁含有脂蛋白和脂多糖以及胶质鞘,简单粉碎方法不能破坏螺旋藻的细胞壁,难以释放出胞内蛋白质;②螺旋藻所含蛋白质大多数为分子量在5万以上的高蛋白,其只有被消化成寡肽后才能被人体吸收利用,而人体自身的消化率很低;③某些生物活性肽是以非活性状态存在于蛋白质的多肽链中,只有当其通过蛋白酶的作用被释放出来,才可能发挥生物活性。
迄今为止,国内外尚未见甘草和螺旋藻复方制剂的相关研究报道。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供一种抗肝炎天然药物复方制剂;目的之二在于提供一种所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法;目的之三在于提供所述抗肝炎天然药物复方制剂的应用。
为达到上述目的,本发明采用如下技术方案:
1、抗肝炎天然药物复方制剂,由甘草和螺旋藻按质量比为1~6∶1~6制成。
进一步,所述抗肝炎天然药物复方制剂优选由甘草和螺旋藻按质量比为4∶1制成。
【方解】甘草味甘,性平;能解百毒、补脏腑、泻诸火,兼补脾益气,缓急止痛;现代药学研究表明,甘草中的甘草酸(glycyrrhizin,GL)及其次生代谢物单葡萄糖醛酸基甘草酸(mono-β-glucuronide-glycyrrhizin,GAMG)和甘草次酸(glycyrrhetic acid,GA)能有效保护肝细胞膜,抑制炎症,并有一定的抗乙肝病毒效应。螺旋藻能够促进肝细胞再生,抗自由基损伤,阻止肝细胞坏死,并对肠道双歧杆菌有明显促增殖作用。二者组方,除综合两药的上述功能外,还可降低内毒素、纠正免疫调节异常,从而共奏疏肝理脾、解毒护肝、阻止肝细胞损害、改善肝功能之功效。
【处方配比依据】本发明研究了甘草∶螺旋藻=6∶1、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6(w/w)共11组处方,结果发现这11组处方的复方制剂均具有抗肝炎作用。但由于甘草为富含木质素-纤维素的植物药,有效成分释出的结构阻隔作用明显,有效部位占全重的比例不超过30%;而螺旋藻为单细胞生物,多层细胞膜均由肽聚糖构成,没有纤维素和木质素构成的细胞壁,对胞内生理活性物质的释放几乎没有结构阻隔作用,且全株均可作为营养成分和活性成分的来源,故本发明处方中以甘草用量大于螺旋藻用量为宜,特别优选处方为甘草∶螺旋藻=4∶1(w/w)。
2、所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法,包括以下步骤:
A、甘草发酵液的制备
A1、将甘草进行细粉化处理,制得甘草细粉体;
A2、将步骤A1所得的甘草细粉体进行高压蒸气爆碎处理,制得甘草气爆细粉体;
A3、将步骤A2所得的甘草气爆细粉体与来自微生物的木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应,制得甘草酶解细粉体;
A4、将步骤A3所得的甘草酶解细粉体进行超微粉化处理,制得甘草超微粉体;
A5、将步骤A4所得的甘草超微粉体加水提取,提取液滤过,滤液浓缩,加入发酵辅助营养成分和水,制得甘草发酵原液;
A6、将步骤A5所得的甘草发酵原液接种嗜甘草乳杆菌进行厌氧液体深层发酵,制得甘草发酵液;
B、螺旋藻发酵液的制备
B1、将螺旋藻进行细粉化处理,制得螺旋藻细粉体;
B2、将步骤B1所得的螺旋藻细粉体进行超微粉化处理,制得螺旋藻超微粉体;
B3、在步骤B2所得的螺旋藻超微粉体中加入发酵辅助营养成分和水,制得螺旋藻发酵原液;
B4、将步骤B3所得的螺旋藻发酵原液接种嗜螺旋藻双歧杆菌进行厌氧液体深层发酵,制得螺旋藻发酵液;
C、抗肝炎天然药物复方制剂的制备
将步骤A所得的甘草发酵液和步骤B所得的螺旋藻发酵液混合,离心去除菌体,超声去除上清液残留菌体,合并上清液和药泥,高温灭酶,干燥,即得抗肝炎天然药物复方制剂。
进一步,所述木质素降解酶系粗酶液来自保藏号为CCTCC No.M207024的云芝(Polystictus versicolor)ODK-CY1,所述纤维素降解酶系粗酶液来自保藏号为CCTCC No.M207025的绿色木霉(Trichoderma viride)ODK-TL1;所述嗜甘草乳杆菌为保藏号为CCTCC No.M207026的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ODK-LR1;所述嗜螺旋藻双歧杆菌为保藏号为CCTCC No.M207027的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ODK-BS1;
进一步,所述步骤A甘草发酵液的制备方法为:
A1、将甘草机械粉碎过100目筛,制得平均粒径为100~150μm的甘草细粉体;
A2、将步骤A1所得的甘草细粉体进行高压蒸气爆碎处理:气爆温度为115~131℃,气爆时间为5~15分钟,制得甘草气爆细粉体;
A3、将步骤A2所得的甘草气爆细粉体与来自微生物的木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应:木质素降解酶系粗酶液与纤维素降解酶系粗酶液的体积比为1~2∶1~2,酶解温度为25~31℃,酶解时间为24~72小时,制得甘草酶解细粉体;
A4、将步骤A3所得的甘草酶解细粉体深低温冷冻至玻璃点后进行气流粉碎,制得平均粒径为5~25μm的甘草超微粉体;
A5、将步骤A4所得的甘草超微粉体加水煎煮1~3次,每次加6~10倍量水煎煮20~60分钟,首次煎煮前加水浸泡20~40分钟,合并提取液,分级过滤至300目,滤液浓缩至原体积的1/2,再加入发酵辅助营养成分多价蛋白胨和水,调节甘草煎滤液浓度为100~300mL/L、多价蛋白胨浓度为5~20g/L,制得甘草发酵原液;
A6、将步骤A5所得的甘草发酵原液接种嗜甘草乳杆菌进行厌氧液体深层发酵:发酵菌种种龄为24~48小时,接种量为5~15mL/L,发酵温度为28~40℃,初始pH值为5.0~7.0,发酵时间为48~96小时,制得甘草发酵液。
进一步,所述步骤A2中气爆温度为131℃,气爆时间为10分钟;所述步骤A3中木质素降解酶系粗酶液与纤维素降解酶系粗酶液的体积比为1∶1,酶解温度为31℃,酶解时间为48小时;所述步骤A5中加水煎煮3次,每次加10倍量水煎煮20分钟,首次煎煮前加水浸泡40分钟,最后调节甘草煎滤液浓度为200mL/L、多价蛋白胨浓度为10g/L;所述步骤A6中发酵菌种种龄为24小时,接种量为10mL/L,发酵温度为35℃,初始pH值为6.0,发酵时间为72小时;
进一步,所述步骤B螺旋藻发酵液的制备方法为:
B1、将螺旋藻粉碎过60目筛,制得平均粒径为150~250μm的螺旋藻细粉体;
B2、将步骤B1所得的螺旋藻细粉体深低温冷冻至玻璃点后进行气流粉碎,制得平均粒径为60~80μm的螺旋藻超微粉体;
B3、在步骤B2所得的螺旋藻超微粉体中加入发酵辅助营养成分水苏糖和质量百分浓度为5%的猪肝浸液以及水,制得螺旋藻发酵原液;其中各组分按质量百分浓度计的配比为:螺旋藻超微粉体5~15%、水苏糖3~7%、质量百分浓度为5%的猪肝浸液4~8%,余量为水;
B4、将步骤B3所得的螺旋藻发酵原液接种嗜螺旋藻双歧杆菌进行厌氧液体深层发酵:发酵菌种种龄为34~48小时,接种量为5~30mL/L,发酵温度为28~40℃,初始pH值为6.0~7.0,发酵时间为48~96小时,制得螺旋藻发酵液。
进一步,所述步骤B3中各组分按质量百分浓度计的配比为:螺旋藻超微粉体10%、水苏糖5%、质量百分浓度为5%的猪肝浸液4%,余量为水;所述步骤B4中发酵菌种种龄为34小时,接种量为20mL/L,发酵温度为35℃,初始pH值为6.5,发酵时间为72小时。
【工艺路线确立依据】甘草抗肝炎作用的主要药学成分为甘草酸,其水溶性和热稳定性较好,但口服时生物利用率极低,必需经肠道正常菌群生物转化为其次生代谢产物单葡萄糖醛酸基甘草酸和甘草次酸后,再由肠内吸收至肝脏发挥作用,故甘草酸的浓度及单葡萄糖醛酸基甘草酸和甘草次酸的转化量,是甘草抗肝炎疗效的决定因素。螺旋藻为单细胞藻类,蛋白质含量高,但其细胞壁较厚,难以释放出胞内蛋白质,且所含蛋白质大多数为高蛋白,只有被分解转化成有生理功能的寡肽后,才能被人体顺利吸收并发挥作用,故寡肽含量是考察螺旋藻抗肝炎疗效的决定因素。本工艺路线的核心价值是对甘草和螺旋藻这两种原料进行以益生菌为媒介的体外生物转化,以提高产品中抗肝炎有效成分的含量和口服生物利用度。
3、所述抗肝炎天然药物复方制剂在制备抗肝炎药物中的应用。
本发明的有益效果在于:本发明以临床经验、中医和现代医学理论、药学研究和文献资料为依据,将天然药物甘草和螺旋藻合理组方,得到一种新的抗肝炎天然药物复方制剂。其制备技术路线以高压蒸气爆碎、微生物酶酶解、超微粉碎、发酵为核心工艺,大幅提高了产品中抗肝炎有效成分的含量和口服生物利用度。药效学研究结果显示,本发明复方制剂对重度和急、慢性肝损伤均有显著护肝效果,且疗效优于目前的一线护肝药甘立欣。因此,本发明复方制剂有望开发成为高效、无毒的抗肝炎新药,具有良好的应用前景。
生物材料样品保藏
云芝(Polystictus versicolor)ODK-CY1:保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC),地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2007年3月23日,保藏编号为CCTCC No.M207024;
绿色木霉(Trichoderma viride)ODK-TL1:保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2007年3月23日,保藏编号为CCTCC No.M207025;
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ODK-LR1:保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2007年3月23日,保藏编号为CCTCC No.M207026;
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ODK-BS1:保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址为武汉市武汉大学,保藏日期为2007年3月23日,保藏编号为CCTCC No.M207027。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述,其中:
图1为抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法流程图;
图2为植物乳杆菌ODK-LR1的生长曲线图;
图3为甘草酸含量与活菌生物量的关联度分析图;
图4为长双歧杆菌ODK-BS1的生长曲线图;
图5为螺旋藻寡肽含量与活菌生物量的关联度分析图。
具体实施方式
以下将参照附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。
优选实施例所用甘草为内蒙古杭锦旗野生梁外甘草,所用螺旋藻为山东无棣富斯特生物工程公司生产的食品级螺旋藻粉(平均粒径150-250μm)。
一、本发明复方制剂的制备工艺研究及工艺条件优化
1、物理粉碎处理对甘草酸得率的影响
考虑到现有提取方法中甘草酸得率不佳的主要原因是甘草中富含的木质素和纤维素对甘草酸溶出的结构阻隔作用,本发明先后采用机械粉碎、高压蒸气爆碎、气流粉碎方法对甘草进行处理。
取甘草饮片、甘草细粉体、甘草气爆细粉体和甘草超微粉体(此处的甘草超微粉体是将甘草气爆细粉体直接进行气流粉碎而得到),分别加水煎煮3次,每次45分钟,合并提取液,滤过,用高效液相色谱法测定甘草酸含量。结果见表1,甘草细粉体、甘草气爆细粉体和甘草超微粉体中甘草酸的溶出量较甘草饮片有较大幅度的渐次增加,表明物理粉碎处理有助于解除甘草组织结构对甘草酸溶出的阻隔作用,可提高甘草酸得率。
表1、物理粉碎处理对甘草酸得率的影响
2、酶解处理对甘草酸得率的影响
在物理破碎处理的基础上,本发明采用木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液对甘草气爆细粉体进行酶解处理,以进一步解除甘草组织结构对甘草酸溶出的阻隔作用。
取甘草气爆细粉体和甘草酶解细粉体,分别加水煎煮3次,每次45分钟,合并提取液,滤过,用高效液相色谱法测定甘草酸溶出量。结果见表2,甘草酶解细粉体中甘草酸的溶出量较甘草气爆细粉体有明显提高,表明酶解处理可通过水解作用深入破坏木质素和纤维素网络结构,增加甘草酸溶出量。
表2、酶解处理对甘草酸得率的影响
3、发酵处理对甘草酸得率的影响
在物理破碎处理和酶解处理的基础上,本发明采用嗜甘草乳杆菌对甘草发酵原液进行发酵处理,以进一步解离与甘草酸化学结合的其它成分。
取甘草发酵原液和甘草发酵液,测定甘草酸溶出量。结果见表3,甘草发酵液中甘草酸的溶出量较甘草发酵原液明显增加,表明发酵处理可通过微生物酶的生物化学活动进一步解离与甘草酸化学结合的其它成分,增加甘草酸溶出量。
表3、发酵处理对甘草酸得率的影响
4、甘草高压蒸气爆碎处理条件优化实验
将甘草细粉体进行高压蒸气爆碎处理,以气爆时间(A)和气爆温度(B)为二因素,各取三个水平,以甘草酸溶出量为优化指标,采用L9(34)正交表设计正交试验。试验方案及结果如表4-1、4-2和4-3所示,因素A和B对高压蒸气爆碎效果均具有显著性影响(p<0.05),影响大小为A>B;最佳高压蒸气爆碎条件为A2B3,即气爆时间为10分钟,气爆温度为131℃。
表4-1、试验因素和水平
表4-2、试验方案及结果
表4-3、方差分析
5、甘草酶解处理条件优化实验
将甘草气爆细粉体与木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应,以木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液的体积比(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)为三因素,各取三个水平,以甘草酸溶出量为优化指标,采用L9(34)正交表设计正交试验。试验方案及结果如表5-1、5-2和5-3所示,因素A和B对酶解效果均具有显著性影响(p<0.05),影响大小为A>B>C;最佳酶解条件为A2B2C3,即木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液的体积比为1∶1,酶解时间为48小时,酶解温度为31℃。
表5-1、试验因素和水平
表5-2、试验方案及结果
表5-3、方差分析
6、甘草水提条件优化实验
将甘草超微粉体加水煎煮,以加水量(A)、浸泡时间(B)、煎煮时间(C)和煎煮次数(D)为四因素,各取三个水平,以甘草酸溶出量为优化指标,采用L9(34)正交表设计正交试验。试验方案及结果如表6-1、6-2和6-3所示,因素A、B和D对提取效果均具有显著性影响(p<0.05),影响大小为D>A>B>C;最佳提取条件为A3B3C1D3,即加水量为10倍,浸泡时间为40分钟,煎煮时间为20分钟,煎煮次数为3次。
表6-1、试验因素和水平
表6-2、试验方案及结果
表6-3、方差分析
7、甘草发酵处理条件优化实验
(1)接种种龄优化实验
将植物乳杆菌ODK-LR1接种于甘草发酵原液中,在温度35℃、间歇搅拌条件下厌氧发酵,定时考察发酵液中的活菌生物量。结果见图2,适宜种龄应选择菌株对数生长后期,处于此期的菌株对新培养环境的适应期缩短,接种后能够迅速生长,有利于缩短发酵周期,从图2可知,植物乳杆菌ODK-LR1复苏后培养24小时,菌株繁殖已处于对数生长后期,因此,植物乳杆菌ODK-LR1适宜接种种龄为24小时。
(2)接种量优化实验
将种龄24小时的植物乳杆菌ODK-LR1以不同接种量接种于甘草发酵原液中,在温度35℃、间歇搅拌的条件下厌氧发酵48小时,用平板计数法考察发酵液中的活菌生物量,用高效液相色谱法测定甘草酸含量和甘草次酸含量。结果见表7,接种量对发酵性能有显著影响,植物乳杆菌ODK-LR1适宜接种量为10mL/L。
表7、接种量优化实验结果
(3)发酵培养基优化实验
以甘草煎滤液浓度(A)、多价蛋白胨浓度(B)为二因素,各取三个水平,采用L9(34)正交表设计正交试验,制备甘草发酵原液;将种龄24小时的植物乳杆菌ODK-LR1以接种量为10mL/L接种于甘草发酵原液中,在温度35℃、间歇搅拌条件下厌氧发酵48小时,考察发酵液中的活菌生物量。试验方案及结果见表8-1、8-2和8-3,因素A和B对活菌生物量均具有显著性影响(p<0.05),影响大小为A>B;以活菌生物量高为优化指标,最佳发酵培养基配方为A2B2,即甘草发酵原液由浓度为200mL/L的甘草煎滤液和浓度为10g/L的多价蛋白胨组成。
表8-1、试验因素和水平
表8-2、试验方案及结果
表8-3、方差分析
(4)发酵条件优化实验
将种龄24小时的植物乳杆菌ODK-LR1以接种量为10mL/L接种于甘草发酵原液(由浓度为200mL/L的甘草煎滤液和浓度为10g/L的多价蛋白胨组成)中进行厌氧发酵,以发酵温度(A)、发酵时间(B)、初始pH值(C)为三因素,各取三个水平,采用L9(34)正交表设计正交试验,考察发酵液中的活菌生物量。试验方案及结果见表9-1、9-2和9-3,因素A、B和C对活菌生物量均具有显著性影响(p<0.05),影响大小为A>B>C;以活菌生物量高为优化指标,最佳发酵条件为A2B2C2,即发酵温度35℃,发酵时间72小时,初始pH值6.0。
表9-1、试验因素和水平
表9-2、试验方案及结果
表9-3、方差分析
(5)甘草酸含量与活菌生物量的关联度分析
将种龄24小时的植物乳杆菌ODK-LR1以接种量为10mL/L接种于甘草发酵原液(由浓度为200mL/L的甘草煎滤液和浓度为10g/L的多价蛋白胨组成)中,在温度35℃、初始pH值6.0、间歇搅拌条件下厌氧发酵72小时,定时考察发酵液中的活菌生物量、甘草酸含量和甘草次酸含量。结果见图3,发酵过程前后,甘草酸含量增加了1倍以上,而活菌生物量也提高了大约3个数量级,随着发酵时间的延长,甘草酸含量及活菌生物量均呈逐渐上升趋势,并显示出良好的平行性,提示甘草酸含量与活菌生物量呈一定相关性。
8、发酵处理对螺旋藻寡肽得率的影响
取螺旋藻发酵原液和螺旋藻发酵液,测定总氮含量和氨基酸态氮含量。结果见表10,与发酵原液比较,螺旋藻发酵液的总氮含量明显增加,而氨基酸态氮含量几乎不变,表明发酵处理提高了螺旋藻的蛋白质提取率且提取的高分子蛋白均有效转化为寡肽而非游离氨基酸,使螺旋藻寡肽得率增加。
表10、螺旋藻发酵前后总氮、氨基酸态氮含量测定结果
9、螺旋藻发酵处理条件优化实验
(1)接种种龄优化实验
将长双歧杆菌ODK-BS1接种于螺旋藻发酵原液中,在温度35℃、间歇搅拌条件下厌氧培养,定时考察发酵液中的活菌生物量。结果见图4,长双歧杆菌ODK-BS1复苏后培养34小时,菌株繁殖已处于对数生长后期,因此,长双歧杆菌ODK-BS1适宜接种种龄为34小时。
(2)接种量优化实验
将种龄34小时的长双歧杆菌ODK-BS1以不同接种量接种于螺旋藻发酵原液中,在温度35℃、间歇搅拌的条件下厌氧发酵34小时,考察发酵液中的活菌生物量和寡肽含量(以质量百分浓度为16%的单宁酸为蛋白质沉淀剂,使发酵液中2300Da以上的高分子蛋白沉淀后,离心,用考马斯亮兰微量法测定上清液中的寡肽含量)。结果见表11,接种量对发酵性能有显著影响,长双歧杆菌ODK-BS1适宜接种量为20mL/L。
表11、接种量优化实验结果
(3)发酵培养基优化实验
以螺旋藻超微粉体浓度(A)、水苏糖浓度(B)、质量百分浓度为5%的猪肝浸液浓度(C)为三因素,各取三个水平,采用L9(34)正交表设计正交试验,制备螺旋藻发酵原液;将种龄34小时的长双歧杆菌ODK-BS1以接种量为20mL/L接种于螺旋藻发酵原液中,在温度35℃、间歇搅拌条件下厌氧发酵34小时,考察发酵液中的活菌生物量。试验方案及结果见表12-1、12-2和12-3,因素A、B和C对活菌生物量均具有显著性影响(p<0.05),影响大小为A>C>B;以活菌生物量高为优化指标,最佳发酵培养基配方为A2B2C1,即螺旋藻发酵原液由下述按质量百分浓度计的成分组成:螺旋藻超微粉10%,水苏糖5%,质量百分浓度为5%的猪肝浸液4%,余量为水。
表12-1、试验因素和水平
表12-2、试验方案及结果
表12-3、方差分析
(4)发酵条件优化实验
将种龄34小时的长双歧杆菌ODK-BS1以接种量为20mL/L接种于螺旋藻发酵原液中(由下述按质量百分浓度计的组分组成:螺旋藻超微粉10%,水苏糖5%,质量百分浓度为5%的猪肝浸液4%,余量为水)进行厌氧发酵,以发酵温度(A)、发酵时间(B)、初始pH值(C)为三因素,各取三个水平,采用L9(34)正交表设计正交试验,考察发酵液中的活菌生物量。试验方案及结果见表13-1、13-2和13-3,因素A、B和C对活菌生物量均具有显著性影响(p<0.05),影响大小为A>C>B;以活菌生物量高为优化指标,最佳发酵条件为A2B2C2,即发酵温度35℃,发酵时间72小时,初始pH值6.5。
表13-1、试验因素和水平
表13-2、试验方案及结果
表13-3、方差分析
(5)寡肽含量与活菌生物量关联度分析
将种龄34小时的长双歧杆菌ODK-BS1以接种量为20mL/L接种于螺旋藻发酵原液中(由下述按质量百分浓度计的组分组成:螺旋藻超微粉10%,水苏糖5%,质量百分浓度为5%的猪肝浸液4%,余量为水),在温度35℃、初始pH值6.5、间歇搅拌条件下厌氧发酵72小时,定时考察发酵液中的活菌生物量和寡肽含量。结果见图5,随着发酵时间的延长,寡肽含量与活菌生物量均呈逐渐上升趋势,提示寡肽含量与活菌生物量呈一定相关性;寡肽含量在发酵40小时下降至最低,此时长双歧杆菌ODK-BS1处于对数生长期,可能与细菌繁殖消耗利用有关。
二、本发明复方制剂的优选制备实施例
处方:甘草12kg、螺旋藻4kg
制备方法:如图1所示,包括以下步骤:
A、甘草发酵液的制备
A1、将甘草洗净,除杂,烘干,切片,机械粉碎过100目筛,制得平均粒径为100~150μm的甘草细粉体;
A2、将步骤A1所得的甘草细粉体进行高压蒸气爆碎处理:气爆温度130℃,气爆时间10分钟,制得甘草气爆细粉体;
A3、将步骤A2所得的甘草气爆细粉体与木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液按1∶2∶2(w/v/v)混合后,温度31℃酶解反应48小时,制得甘草酶解细粉体;
所述木质素降解酶系粗酶液的制备方法为:将云芝ODK-CY1接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面培养基,恢复培养7天,转种至PDA液体培养基,在温度28℃、振荡速度150r/min条件下培养5天,再按接种量为50mL/L接种至PDA液体培养基中,在温度30℃、振荡速度100r/min条件下进行好氧发酵,待多酚氧化酶活性达到高峰时终止发酵,离心去除菌体,收集上清液,即得木质素降解酶系粗酶液,密封冷藏,备用;
所述纤维素降解酶系粗酶液的制备方法为:将绿色木霉ODK-TL1接种于PDA斜面培养基上,恢复培养5天,转种至PDA液体培养基中,在温度32℃、振荡速度120r/min条件下培养3天,再按接种量为50mL/L接种至PDA液体培养基中,在温度35℃、振荡速度100r/min条件下进行好氧发酵,待滤纸酶活性达到高峰时终止发酵,离心去除菌体,收集上清液,即得纤维素降解酶系粗酶液,密封冷藏,备用;
A4、将步骤A3所得的甘草酶解细粉体在液氮(温度-123℃)中浸没4-5次,每次2分钟,充分冻结至玻璃点后,置圆盘式气流磨中进行气流粉碎,制得平均粒径为5~25μm的甘草超微粉体;
A5、将步骤A4所得的甘草超微粉体加水煎煮3次,每次加入10倍量水煎煮20分钟,第1次加水后在室温下浸泡40分钟再煎煮,合并提取液,以60目、100目、200目、300目滤布分级过滤,滤液浓缩至原体积的1/2,加入多价蛋白胨和水,调节滤液终浓度为200mL/L、多价蛋白胨终浓度为10g/L,制得甘草发酵原液;
A6、将种龄24小时的植物乳杆菌ODK-LR1按接种量为10mL/L接种至步骤A5所得的甘草发酵原液中,在温度35℃、初始pH值6.0、间歇搅拌条件下厌氧发酵72小时,制得甘草发酵液;
B、螺旋藻发酵液的制备
B1、将螺旋藻粉过60目筛,除杂,得平均粒径为150~250μm的螺旋藻细粉体;
B2、将步骤B1所得的螺旋藻细粉体置深低温冰箱(温度-85℃)中冷冻1小时,充分冻结至玻璃点后,置循环式气流磨中进行气流粉碎,制得平均粒径为60~80μm的螺旋藻超微粉体;
B3、在步骤B2所得的螺旋藻超微粉体中加入水苏糖和质量百分浓度为5%的猪肝浸液,按下述质量百分浓度配比制得螺旋藻发酵原液:螺旋藻超微粉体10%、水苏糖5%、质量百分浓度为5%的猪肝浸液4%,余量为水;
B4、将种龄34小时的长双歧杆菌ODK-BS1按接种量为20mL/L接种至步骤B3所得的螺旋藻发酵原液中,在温度35℃、初始pH值6.5、间歇搅拌条件下厌氧发酵72小时,制得螺旋藻发酵液;
C、抗肝炎天然药物复方制剂的制备
将步骤A所得的甘草发酵液和步骤B所得的螺旋藻发酵液混合,4000r/min离心10分钟,去除中层菌体,分别收集上清液和下层药泥,上清液用超声处理去除残留菌体,合并超声处理后的上清液和药泥,加热至温度100℃灭酶20分钟,冷冻干燥,即得抗肝炎天然药物复方制剂。
本发明的抗肝炎天然药物复方制剂可作为药物中间体,单独应用或与其它药物中间体联用,进一步采用药学上可接受的辅料和制剂常规方法,制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液或注射液等各种剂型的抗肝炎药物。如:将抗肝炎天然药物复方制剂经粉碎机粉碎均匀后,以体积百分浓度为75%的乙醇为润湿剂,200目筛制粒,50~60℃干燥,50目筛整粒,填入1号胶囊,即得胶囊剂。
三、本发明复方制剂的抗肝炎疗效评价
1、本发明复方制剂对大鼠重度肝损伤(肝衰竭)的保护作用
实验共分3组:本发明复方制剂(简称为GSY-1)组、一线护肝药甘立欣(简称为GLX,阳性对照)组、生理盐水(简称为NS,阴性对照)组,每组用SD大鼠12只,雌雄各半,体重约150克,标准条件饲养。GSY-1组和GLX组分别将GSY-1和GLX用NS溶解并稀释至适当浓度后,每日3次灌胃给药,每次2ml,连续给药7天;NS组按同样方法给予相同剂量的NS。在给药第6天,对各组大鼠行实验性肝衰竭造模处理:用D-氨基半乳糖以1.3g/kg(体重)的剂量1次性腹腔注射造模。造模后36小时各组大鼠开始禁食、水,造模后48小时采集各组大鼠血液标本和肝组织标本,测定如下指标:血清学指标:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(p-ALB)、内毒素(LPS)和肿瘤坏死因子(TNF-α)含量;组织学指标:肝组织外观、光镜下病理、电镜下病理、肝免疫组化。
结果:造模后24小时,NS组的大部分大鼠生活状态开始发生明显变化,主要表现为食欲变差,活动减少,毛发色暗稀疏,尿黄,少数大便不成形;造模后36小时左右,NS组的大鼠开始陆续死亡,多数亡鼠口鼻出血,GLX组约半数大鼠有中毒表现,GSY-1组仅数只大鼠有中毒表现;造模后48小时,各组大鼠死亡率分别为:NS组80%,GLX组30%,GSY-1组20%。
血清学指标检测结果见表14-1和14-2。可见肝衰造模后,NS组ALT、AST、TBIL、DBIL以及p-ALB、LPS、TNF-α均有极显著增高,提示肝损伤严重;而GSY-1组和GLX组的上述指标增高幅度远小于NS组,提示GSY-1和GLX对实验性肝衰竭有确切保护作用,且GSY-1的保护作用强于GLX。此外,表中还显示出GSY-1对肝脏蛋白制造功能的保护作用要明显优于GLX。
表14-1、血清学指标检测结果(x±s)
表14-2、血清学指标检测结果(x±s)
肝组织学指标检测结果:①肉眼观察可见:NS组肝脏严重失血坏死;GLX组和GSY-1组肝脏未见明确坏死组织。②光镜下观察可见:NS组肝细胞大片坏死,残留肝细胞变形或明显浊肿;GLX组肝细胞肿胀,肝窦扩张充血,部分区域见片状和灶性坏死;GSY-1组肝细胞嗜酸变性或轻度坏死,汇管区轻度扩张,胆管细胞肿胀;说明GLX组和GSY-1组肝组织破坏程度较NS组明显为轻,但有明确病变。③电镜下观察可见:NS组核膜破坏,线粒体固缩,内质网发生断裂,高尔基体缺如;GLX组核膜完整但出现裂隙,线粒体肿胀,胞浆内脂滴聚集明显;GSY-1组核膜完整,线粒体肿胀和脂滴聚集不明显,但内质网散乱并减少;说明GLX组和GSY-1组肝细胞亚结构的破坏程度较NS组明显减轻。④免疫组化:NS组细胞数量减少,大小不一,可见坏死细胞和碎片,基本无增殖细胞;GLX组细胞数量显著多于NS组,大小较均匀,可见部分新增殖细胞;GSY-1组细胞数量显著多于NS组且完整性好,可见较多新增殖细胞;说明GLX组和GSY-1组肝细胞再生活动明显,且以GSY-1组为显著。
2、本发明复方制剂对大鼠急性肝损伤的保护作用
实验共分3组:本发明复方制剂(简称为GSY-1)组、一线护肝药甘立欣(简称为GLX,阳性对照)组、生理盐水(简称为NS,阴性对照)组,每组用Wistar大鼠10只,雌雄各半,体重约120克,标准条件饲养。GSY-1组和GLX组分别将GSY-1和GLX用NS溶解并稀释至适当浓度后,每日3次灌胃给药,每次2ml,连续给药7天;NS组按同样方法给予相同剂量的NS。在给药第6天,对各组大鼠行实验性急性肝损伤造模处理:用体积百分浓度为25%的四氯化碳溶液(用花生油稀释)以5ml/kg(体重)的剂量1次性皮下注射造模。造模后36小时各组大鼠开始禁食、水,造模后48小时采集各组大鼠血液标本和肝组织标本,测定如下指标:血清学指标:ALT、AST、TBIL、DBIL、TP、ALB、线粒体天门冬氨酸氨基转移酶同工酶(m-AST)、LPS、TNF-α、血清超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽转移酶(px-GSH)含量;组织学指标:光镜下病理、电镜下病理、肝免疫组化。
结果:造模后48小时,NS组大鼠死亡率为10%,GLX组和GSY-1组均无大鼠死亡。
血清学指标检测结果见表15-1、15-2和15-3。由表15-1和15-2可知,NS组ALT、AST、TBIL、DBIL极显著增高,m-AST亦显著增高,而TP、ALB极显著降低,表明急性肝损伤造模成功;除蛋白系统外,GSY-1组和GLX组各指标与NS组差别显著,表明二者护肝效果肯定,其中GSY-1组优于GLX组。由表15-3可知,NS组LPS、TNF-α、SOD、MDA显著增高而px-GSH降低;GLX组LPS、TNF-α亦增高但幅度明显低于NS组,而px-GSH增高幅度非常显著;GSY-1组LPS、TNF-α水平明显低于GLX组,SOD和px-GSH的增高幅度亦明显低于GLX组,表明GSY-1抗氧化损伤的作用优于GLX。
表15-1、血清学指标检测结果(x±s)
与NS组比:P<0.01;与GLX组比:※P<0.05,※※P<0.01。
表15-2、血清学指标检测结果(x±s)
表15-3、血清学指标检测结果(x±s)
肝组织学指标检测结果:①光镜下观察可见:NS组肝细胞灶性坏死,坏死灶内有中性粒细胞;广泛脂肪变性;GLX组以小细胞样脂肪变性为主,部分区域点状坏死;GSY-1组肝组织基本正常,中央V周围可见浊肿肝细胞和少量大泡样脂肪变性。②电镜下观察可见:NS组细胞核破坏,线粒体固缩,内质网散乱、断裂,高尔基体缺如;GLX组细胞核核膜受损,内容尚正常;线粒体肿胀,内质网减少,可见较多脂滴;GSY-1组细胞核及线粒体基本正常,内质网离散,滑面内质网减少;说明GLX组和GSY-1组肝细胞亚结构的破坏程度较NS组明显减轻。③免疫组化:NS组细胞数量稀少,大小不一,可见坏死的细胞和碎片,未见增殖细胞;GLX组细胞数量显著多于NS组,大小较均匀,见部分新增殖细胞;GSY-1组细胞数量显著多于NS组且完整性好,可见较多新增殖细胞;说明GLX组和GSY-1组肝细胞再生活动明显,且以GSY-1组为显著。
3、本发明复方制剂对大鼠慢性肝损伤的保护作用
实验共分3组:本发明复方制剂(简称为GSY-1)组、一线护肝药甘立欣(简称为GLX,阳性对照)组、生理盐水(简称为NS,阴性对照)组,每组用Wistar大鼠10只,雌雄各半,体重约120克,标准条件饲养。GSY-1组和GLX组分别将GSY-1和GLX用NS溶解并稀释至适当浓度后,每日2次灌胃给药,每次3ml,连续给药90天,同时常规喂予鼠粮和水。NS组按同样方法给予相同剂量的NS。在给药的90天内,同时对各组大鼠行实验性慢性肝损伤造模处理:用不同体积百分浓度的四氯化碳溶液(用花生油稀释)以0.2ml/kg(体重)的剂量皮下注射造模,每周1次,连续注射12周,四氯化碳溶液的起始浓度为5%,以后每2周递增5%,依次为10%、15%、20%、25%、30%。第91天时采集各组大鼠血液标本和肝组织标本(采集标本前12小时开始禁食、水),测定如下指标:血清学指标:ALT、AST、TBIL、DBIL、TP、ALB、ALP、脯氨酸肽酶(PLD)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和透明质酸(HA)含量;组织学指标:肝组织外观、光镜下病理、电镜下病理、肝免疫组化。
结果:在实验期间,NS组、GLX组和GSY-1组均无大鼠死亡。
血清学指标检测结果见表16-1、16-2和16-3。由表16-1和16-2可知,NS组ALT、AST、TBIL、DBIL均极显著增高,而TP、ALB极显著降低,表明慢性肝损伤造模成功;除白蛋白指标外,GLX组各指标与NS组差别均极显著,表明其护肝效果肯定;除蛋白系统外,GSY-1与NS组比较,对各肝功指标均有明显改善,且改善程度显著优于GLX组。由表16-3可知,NS组PLD、TGF-β1和HA三个肝纤维化指标亦非常显著增高,提示慢性肝损伤的机理与以上指标相关;GLX组上述各指标与NS组有差别,表明GLX可改善上述指标但并不完全;GSY-1则对上述指标有明显改善,优于GLX。
表16-1、血清学指标检测结果(x±s)
表16-2、血清学指标检测结果(x±s)
表16-2、血清学指标检测结果(x±s)
与NS组比:P<0.01;与GLX组比:※P<0.05,※※P<0.01。
肝组织学指标检测结果:①光镜下观察可见:NS组肝细胞灶性坏死,见中等量小泡和大泡样脂肪变性;GLX组广泛小泡样脂肪变性,以中央V周围为主;GSY-1组小泡样脂肪变性为主,少量点状坏死。②电镜下观察可见:NS组核结构破坏,线粒体固缩,内质网散乱、缠绕、断裂,大量脂滴;GLX组核膜及核内容完整,线粒体肿胀,内质网尚整齐,脂滴较多;GSY-1组核膜完整,线粒体肿胀,内质网丰富,以粗面内质网为主;说明GLX组和GSY-1组肝细胞亚结构破坏程度较NS组明显减轻,但GLX组脂肪聚集多见,而GSY-1组脂肪聚集不明显。③免疫组化:NS组细胞大小不一,分布不均,可见坏死细胞、碎片及融合的增殖细胞;GLX组细胞数量显著多于NS组,大小较均匀,见部分新增殖细胞;GSY-1组细胞数量显著多于NS组且完整性好,新增殖细胞多处可见;表明GLX组和GSY-1组肝细胞增殖活动明显,且以GSY-1组为显著。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (9)
1.抗肝炎天然药物复方制剂,其特征在于:由甘草和螺旋藻按质量比为1~6∶1~6制成。
2.根据权利要求1所述抗肝炎天然药物复方制剂,其特征在于:由甘草和螺旋藻按质量比为4∶1制成。
3.权利要求1或2所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
A、甘草发酵液的制备
A1、将甘草进行细粉化处理,制得甘草细粉体;
A2、将步骤A1所得的甘草细粉体进行高压蒸气爆碎处理,制得甘草气爆细粉体;
A3、将步骤A2所得的甘草气爆细粉体与来自微生物的木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应,制得甘草酶解细粉体;
A4、将步骤A3所得的甘草酶解细粉体进行超微粉化处理,制得甘草超微粉体;
A5、将步骤A4所得的甘草超微粉体加水提取,提取液滤过,滤液浓缩,加入发酵辅助营养成分和水,制得甘草发酵原液;
A6、将步骤A5所得的甘草发酵原液接种嗜甘草乳杆菌进行厌氧液体深层发酵,制得甘草发酵液;
B、螺旋藻发酵液的制备
B1、将螺旋藻进行细粉化处理,制得螺旋藻细粉体;
B2、将步骤B1所得的螺旋藻细粉体进行超微粉化处理,制得螺旋藻超微粉体;
B3、在步骤B2所得的螺旋藻超微粉体中加入发酵辅助营养成分和水,制得螺旋藻发酵原液;
B4、将步骤B3所得的螺旋藻发酵原液接种嗜螺旋藻双歧杆菌进行厌氧液体深层发酵,制得螺旋藻发酵液;
C、抗肝炎天然药物复方制剂的制备
将步骤A所得的甘草发酵液和步骤B所得的螺旋藻发酵液混合,离心去除菌体,超声去除上清液残留菌体,合并上清液和药泥,高温灭酶,干燥,即得抗肝炎天然药物复方制剂。
4.根据权利要求3所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法,其特征在于:所述木质素降解酶系粗酶液来自保藏号为CCTCC No.M207024的云芝(Polystictus versicolor)ODK-CY1,所述纤维素降解酶系粗酶液来自保藏号为CCTCC No.M207025的绿色木霉(Trichoderma viride)ODK-TL1;所述嗜甘草乳杆菌为保藏号为CCTCC No.M207026的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ODK-LR1;所述嗜螺旋藻双歧杆菌为保藏号为CCTCC No.M207027的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ODK-BS1。
5.根据权利要求4所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤A甘草发酵液的制备方法为:
A1、将甘草机械粉碎过100目筛,制得平均粒径为100~150μm的甘草细粉体;
A2、将步骤A1所得的甘草细粉体进行高压蒸气爆碎处理:气爆温度为115~131℃,气爆时间为5~15分钟,制得甘草气爆细粉体;
A3、将步骤A2所得的甘草气爆细粉体与来自微生物的木质素降解酶系粗酶液和纤维素降解酶系粗酶液进行共酶解反应:木质素降解酶系粗酶液与纤维素降解酶系粗酶液的体积比为1~2∶1~2,酶解温度为25~31℃,酶解时间为24~72小时,制得甘草酶解细粉体;
A4、将步骤A3所得的甘草酶解细粉体深低温冷冻至玻璃点后进行气流粉碎,制得平均粒径为5~25μm的甘草超微粉体;
A5、将步骤A4所得的甘草超微粉体加水煎煮1~3次,每次加6~10倍量水煎煮20~60分钟,首次煎煮前加水浸泡20~40分钟,合并提取液,分级过滤至300目,滤液浓缩至原体积的1/2,再加入多价蛋白胨和水,调节甘草煎滤液浓度为100~300mL/L、多价蛋白胨浓度为5~20g/L,制得甘草发酵原液;
A6、将步骤A5所得的甘草发酵原液接种嗜甘草乳杆菌进行厌氧液体深层发酵:发酵菌种种龄为24~48小时,接种量为5~15mL/L,发酵温度为28~40℃,初始pH值为5.0~7.0,发酵时间为48~96小时,制得甘草发酵液。
6.根据权利要求5所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤A2中气爆温度为131℃,气爆时间为10分钟;所述步骤A3中木质素降解酶系粗酶液与纤维素降解酶系粗酶液的体积比为1∶1,酶解温度为31℃,酶解时间为48小时;所述步骤A5中加水煎煮3次,每次加10倍量水煎煮20分钟,首次煎煮前加水浸泡40分钟,最后调节甘草煎滤液浓度为200mL/L、多价蛋白胨浓度为10g/L;所述步骤A6中发酵菌种种龄为24小时,接种量为10mL/L,发酵温度为35℃,初始pH值为6.0,发酵时间为72小时。
7.根据权利要求4所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤B螺旋藻发酵液的制备方法为:
B1、将螺旋藻粉碎过60目筛,制得平均粒径为150~250μm的螺旋藻细粉体;
B2、将步骤B1所得的螺旋藻细粉体深低温冷冻至玻璃点后进行气流粉碎,制得平均粒径为60~80μm的螺旋藻超微粉体;
B3、在步骤B2所得的螺旋藻超微粉体中加入水苏糖、质量百分浓度为5%的猪肝浸液和水,制得螺旋藻发酵原液;其中各组分按质量百分浓度计的配比为:螺旋藻超微粉体5~15%、水苏糖3~7%、质量百分浓度为5%的猪肝浸液4~8%,余量为水;
B4、将步骤B3所得的螺旋藻发酵原液接种嗜螺旋藻双歧杆菌进行厌氧液体深层发酵:发酵菌种种龄为34~48小时,接种量为5~30mL/L,发酵温度为28~40℃,初始pH值为6.0~7.0,发酵时间为48~96小时,制得螺旋藻发酵液。
8.根据权利要求7所述抗肝炎天然药物复方制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤B3中各组分按质量百分浓度计的配比为:螺旋藻超微粉体10%、水苏糖5%、质量百分浓度为5%的猪肝浸液4%,余量为水;所述步骤B4中发酵菌种种龄为34小时,接种量为20mL/L,发酵温度为35℃,初始pH值为6.5,发酵时间为72小时。
9.权利要求1或2所述抗肝炎天然药物复方制剂在制备抗肝炎药物中的应用。
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