CN109674848A - 一种甘草提取物的制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘草提取物的制备方法，及其用于制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品中的用途。其制备方法是以甘草作为原料，采用极性有机溶剂进行提取，提取液经过滤，合并过滤液，滤液再经减压回收有机溶剂，真空浓缩成甘草粗提取物，粗提取物经大孔树脂处理后制备成甘草提取物，该提取物以甘草黄酮、三萜和香豆素类化合物为主要药用成分。该甘草提取物用于制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品的用途，如胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、糖浆剂、微囊剂、散剂、滴丸剂、丸剂或饮料等。本发明所采用的工艺简单，具有生产成本低，提取效率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种甘草提取物的制备方法，及其用于制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品中的用途。
背景技术
甘草（Licorice）为豆科甘草属多年生草本植物，以干燥根及根茎入药。甘草最早被收载《神农本草经》中，将其列入上品，素有“国老”之称，及“十方九草”和“无草不成方”之说。在2015年版《中国药典》中，被收载的甘草包括甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.) 和胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)三大品种，其味甘，性平；归心、肺、脾、胃经。具有健脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药的功能，用于治疗脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹，四肢挛急疼痛，痈肿疮毒，缓解药物毒性、烈性。甘草富含黄酮、三萜类其苷类和香豆素化合物等，其在保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗癌等方面都有较强的药理活性。申请人在近年来研究中发现，除甘草酸、甘草黄酮外，甘草香豆素类化合物也具有较好的保肝作用（Yan M, Ye L, Yin S, etal. Glycycoumarin protects mice against acetaminophen-induced liver injurypredominantly via activating sustained autophagy. Br J Pharmacol. 2018，175(19):3747-3757.）。甘草是药食两用的中药，除了被大量用于中药复方外，还常被应用于食品、轻工、日用化学用品等方面，其作为食品和日用化妆品的添加剂，可起到美白、防晒、消炎等作用。甘草在我国分布广泛，现可人工培植，产量丰富，原药材价格相对较低，具有较好的开发前景。
中国专利公开号CN1803789A，于2006年7月19日公开了“一种提取甘草酸、甘草黄酮和甘草多糖的方法”、中国专利公开号CN104479033A，于2015年04月01日公开了“一种从甘草中综合分离提取甘草酸、甘草黄酮、甘草多糖的方法” ，以上两个专利申请公开了提取甘草酸、甘草黄酮和甘草多糖的方法，但这些方法中存在一定的缺陷，一方面，提取分离步骤太多，很难实现工业化生产的要求；另一方面，在提取分离过程中加入大量的酸碱，不但会对环境造成污染，而且也会破坏有效物质成分的化学结构，尤其是香豆素类化合物。由于香豆素类化合物具有内酯环结构，碱性条件下可水解开环，生成顺式邻羟基桂皮酸的盐溶于水，在酸性条件下又闭环恢复为内酯环结构。但如果遇碱液长时间加热，开环结构将遭到破坏，异构化为反式邻羟基桂皮酸衍生物，再也不可能环合为内酯，失去原有的生物学活性。因此，上述公开技术均没有充分甘草中各成分的化学结构，采用不合理的提取方法，给工业化生产带来不便，甚至会造成环境污染。
发明内容
本发明的目的在于一种工艺简单、生产成本低、提取效率高的甘草提取物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供该甘草提取物用于制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品中的用途。
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以鲜甘草或甘草粉末为原料，采用30-100倍甘草干重的极性有机溶剂，于20-100℃条件下提取3次，每次0.5-10小时，合并提取液，过滤，滤液在30-60℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素类化合物经30-50倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经喷雾干燥或冷冻干燥，制得甘草提取物干粉。
上述的甘草提取物的制备方法，其中所述的甘草包括甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.) 和胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)中一种或几种，所选部位包括叶、花、根、茎或果实，优选药材部位根、茎。
上述的甘草提取物的制备方法，其中所述的提取方法是煎煮、加热回流提取、超声提取、冷浸或渗漉法。
上述的甘草提取物的制备方法，其中所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种或几种混合溶剂，优先选用乙醇或乙酸乙酯。
上述的甘草提取物的制备方法，其中所述的大孔树脂是AB-8、S-8、D201、D4020、D208或D101等的一种或几种混合，首选用AB-8或D101大孔树脂。
上述的甘草提取物，用于制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品的用途。
上述的甘草提取物的用途，是按照常规的制剂方法或保健食品制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品。
上述的甘草提取物的用途，其中所述的口服药剂或保健食品为胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、糖浆剂、微囊剂、散剂、滴丸剂、丸剂或饮料等。
上述的甘草提取物的用途，其中所述的甘草提取物的保肝作用，包括药物性的肝损伤、化学性肝损伤、酒精性肝损伤等的保肝作用。
本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本发明采用乙醇或甲醇等极性有机溶剂，以大孔树脂作为分离材料，提取、制备以甘草三萜、甘草香豆素和甘草黄酮等脂溶性药用活性成分为主要成分的甘草提取物，该制备方法不仅工艺简单、提取效率高，而且提取的黄酮、三萜和香豆素的收率高。其优点在于：一是充分利用了相似相溶原理，甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等活性成分与蛋白质、多糖、鞣酸、无机盐等杂质成分在高浓度的有机溶剂中溶解度的明显差异，真正到达活性物质的提取。二是利用了弱极性大孔树脂的分离能力，甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等活性成分与蛋白质、多糖、鞣酸、无机盐等杂质成分在大孔树脂上难吸附，从而达到了甘草三萜、甘草香豆素和甘草黄酮等药用活性成分与杂质成分的高效分离。三是采用中药现代化生产技术提取甘草主要药用活性成分制成国际通行的中药提取物，能适应和满足现代中医临床用药或保健食品的需求。
附图说明
图1为甘草提取物对APAP诱导急性肝损伤小鼠血浆ALT和AST含量的影响。
具体实施方式
实施例1
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取甘草经粉碎后，称量，用50倍甘草干重的甲醇溶液，超声提取3次，每次0.5小时，合并提取液，过滤，滤液在50℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂AB-8上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经30倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经喷雾干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例2
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取胀果甘草粉碎后，用60倍甘草干重的乙酸乙酯溶液，浸渍10小时后，超声提取3次，每次0.5小时，合并提取液，过滤，滤液在45℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂AB-8上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经50倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经冷冻干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例3
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取胀果甘草经粉碎后，称量，用60倍甘草干重的75%乙醇溶液，于90℃条件下，超声提取提取3次，每次2小时，合并提取液，过滤，滤液在50℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂S-8上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经50倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经喷雾干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例4
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取甘草经粉碎后，称量，用50倍甘草干重的丙酮溶液，浸渍12小时后，超声提取3次，每次0.5小时，合并提取液，过滤，滤液在40℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂D101上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经40倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经冷冻干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例5
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取光果甘草经粉碎后，称量，用30倍甘草干重的90%乙醇溶液，于90℃条件下，加热回流提取3次，每次1.5小时，合并提取液，过滤，滤液在40℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂D101上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经40倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经冷冻干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例6
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取甘草粉碎后，称量，加入用100倍甘草干重的甲醇，密封冷浸处理10小时，滤掉药渣，取滤液，合并滤液，滤液在60℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂D4020上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经30倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经冷冻干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例7
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取甘草，称量，置渗漉筒中，由渗漉筒上部加入用60倍甘草干重的90%乙醇溶液，使液面始终保持高出粉末约5cm左右，浸渍10小时后，以3ml/min的速度收集渗漉液，过滤，滤液在60℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂D201上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经30倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经喷雾干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例8
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取胀果甘草粉碎后，称量，置渗漉筒中，由渗漉筒上部加入用80倍甘草干重的90%乙醇溶液，使液面始终保持高出粉末约4cm左右，浸渍10小时后，以3ml/min的速度收集渗漉液，过滤，滤液在60℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂D201上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经40倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经冷冻干燥，制得甘草提取物干粉。
实施例9
一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）取光果甘草，称量，置渗漉筒中，由渗漉筒上部加入用100倍甘草干重的90%乙醇溶液，使液面始终保持高出粉末约3cm左右，浸渍10小时后，以3ml/min的速度收集渗漉液，过滤，滤液在50℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂D201上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素等经50倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经喷雾干燥，制得甘草提取物干粉。
试验例
甘草提取物对APAP诱导的急性肝损伤的保护作用
将前述实施例制备的甘草提取物进行冷冻干燥，然后进行保肝作用的动物药效学评价。
一、材料
C57BL/6N小鼠，雄性，6-8周龄（体重18-20 g），由北京维通利华生物科技有限公司提供。基础饲料，购自北京维通利华生物科技有限公司。谷丙转氨酶（ALT）谷草转氨酶 （AST）试剂盒法，购于南京建成生物工程研究所。对乙酰氨基酚（APAP）购于美国sigma公司。本发明实施制备的甘草提取物。
二、实验方法
取适量的甘草提取物，用PBS配制为质量浓度为5 mg/mL的溶液,保存于4℃。精密称取150 mg的对乙酰氨基酚（APAP），溶于10 mL的PBS中（55℃预温），得质量浓度为 15 mg/kg的溶液。APAP溶液须现用现配，不可长时间储存。
C57BL/6N雄性小鼠24只，随机分为4组，每组6只，分别为空白对照组（Control，PBS），APAP肝损伤模型组，给药3天的甘草提取物低、高剂量组（50、100 mg/kg）。适应性喂养一周后，开始正式实验。小鼠每天按0.1 mL/10 g灌胃给药。空白组和APAP肝损伤模型组前3天均给予PBS，给药组均给予相应剂量的甘草提取物溶液。给药第三天，即给予APAP造模的前一天，禁食过夜，保留充足饮水。实验第四天，空白对照组按0.1 mL/10 g 的体积腹腔注射无菌PBS，APAP肝损伤模型组、甘草提取物低、高剂量组则按相应体积腹腔注射300 mg/kg的APAP。给予APAP 6小时后，重新投掷鼠粮。在给APAP 24小时后，取全血备用。
三、实验结果
甘草提取物对APAP急性肝损伤小鼠血清中ALT和AST水平的影响如图1所示。结果显示空白对照组小鼠的血清ALT和AST均在正常生理水平，分别为25.01±2.84 IU/L和19.85±1.66 IU/L。当腹腔注射APAP后24小时再检测，ALT和AST分别升高至3233.50±344.06 IU/L和942.96±233.04 IU/L，提示该组小鼠已经出现了非常严重的肝损伤。与APAP模型组相比，甘草提取物能不同程度地降低ALT和AST水平，且存在一定的量效关系。甘草提取物50mg/kg预处理3天可以使ALT和AST分别下降7.28%（2998.23±522.66 IU/L）、24.19%（714.88±440.22 IU/L），但是与模型组相比并没有显著性差异。增加甘草提取物剂量至100 mg/kg时，即可使ALT和AST水平进一步下降至1371.02±805.25 IU/L和263.10±183.19 IU/L，与APAP模型组相比分别下降了57.60%（p＜0.01）和72.10%（p＜0.05）。以上研究结果表明甘草提取物对APAP诱导的急性肝损伤具有明显的保护作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单的修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (9)
1.一种甘草提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）以鲜甘草或甘草粉末为原料，采用30-100倍甘草干重的极性有机溶剂，于20-100℃条件下提取3次，每次0.5-10小时，合并提取液，过滤，滤液在30-60℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩成甘草粗提取物；
（2）将甘草粗提取物用蒸馏水溶解，该水溶液吸附于大孔树脂上，吸附后的大孔树脂经蒸馏水洗脱，至洗脱液无色为止，除去蛋白质、多糖、无机盐等杂质成分；
（3）吸附在大孔树脂上的甘草黄酮、三萜和甘草香豆素类化合物经30-50倍柱体积90%乙醇洗脱，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩得甘草提取物；
（4）经喷雾干燥或冷冻干燥，制得甘草提取物干粉。
2.如权利要求1所述的甘草提取物的制备方法，其特征在于：所述的甘草包括甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.) 和胀果甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)中一种或几种，所选部位包括叶、花、根、茎或果实，优选药材部位根、茎。
3.如权利要求1所述的甘草提取物的制备方法，其特征在于：所述的提取方法是煎煮、加热回流提取、超声提取、冷浸或渗漉法。
4.如权利要求1所述的甘草提取物的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂是甲醇、乙醇、丙醇、乙酸乙酯或丙酮中的一种或几种混合溶剂，优先选用乙醇或乙酸乙酯。
5.如权利要求1所述的甘草提取物的制备方法，其特征在于：所述的大孔树脂是AB-8、S-8、D201、D4020、D208或D101中的一种或几种混合，首选用AB-8或D101大孔树脂。
6.甘草提取物用于制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品中的用途。
7.如权利要求6所述的甘草提取物的用途，其特征在于：是按照常规的制剂方法或保健食品制备具有保肝作用的口服药剂或保健食品。
8.如权利要求6所述的甘草提取物的用途，其特征在于：所述的口服药剂或保健食品为胶囊剂、颗粒剂、片剂、口服液、糖浆剂、微囊剂、散剂、滴丸剂、丸剂或饮料。
9.如权利要求6所述的甘草提取物的用途，其特征在于：所述的甘草提取物的保肝作用，包括药物性的肝损伤、化学性肝损伤、酒精性肝损伤等的保肝作用。
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