CN101249259B - 一种高含量、高活性口服云芝糖肽及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高含量、高活性口服云芝糖肽及其制备方法和应用。这种高含量、高活性口服云芝糖肽在水中易溶，糖肽总量≥70％，重均分子量在10kd以上的多糖肽占糖肽总量80％以上。其中糖含量50％～80％，肽含量16％～30％。制备方法为，(1)取云芝粗提取物混悬或溶解于80～100℃水中，提取分离云芝粗提取物溶液，或者用80～100℃热水提取云芝菌丝体或者云芝子实体制备云芝粗提取物溶液；(2)将云芝粗提取物溶液或者云芝粗提取物混悬液的ph值控制在4～8，过滤或离心分离得到澄清提取液，浓缩至比重为1.05～1.3；(3)用水提醇沉法进行纯化。得到的产品比现有的云芝糖肽具有更有效的抗肿瘤作用，对骨髓功能和免疫功能的保护作用也更好，适用于肿瘤的预防和治疗。

Description

一种高含量、高活性口服云芝糖肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于药品领域，具体涉及一种口服吸收的高含量、高活性云芝糖肽及其制备方法和用途。

背景技术

免疫增强剂云芝糖肽是从云芝深层发酵菌丝体中采用一次水提醇沉法提取的糖肽粗品，是少数几种能口服吸收的糖肽类免疫增强剂之一。能抑制人肺癌、胃癌、食道癌、白血病、腹水癌等多种癌细胞的增殖，同时可有效提高人体免疫机能，增进食欲，缓解疼痛，提高耐缺氧能力，降低放化疗引起的毒副反应，国内已经作为肿瘤的辅助治疗药物上市销售。中国专利89105471.5报道了“一种云芝糖肽的生产方法”，其提取方法为：将云芝菌丝体破碎后，在90～100℃热水中回流浸取3～5小时，浸取液用1∶3～4(V/V)比例的乙醇在0～4℃醇析6～8小时，得醇析物，干燥即得黑褐色的云芝糖肽。以此工艺生产的云芝糖肽在水中溶解性差，产品中糖含量为30～40％，肽含量为10～25％。

另一种产品云芝胞内糖肽在水中易溶，国家食品药品监督管理局颁布的国家药品标准WS₁-XG-021-2002中规定，其糖含量≥35％，肽含量≥20％。其他供口服用云芝提取物中糖和肽的含量均低于云芝糖肽。

中国专利200410103414.3也公开了一种从云芝糖肽粗品中提取注射用云芝糖肽的方法，得到了高纯度的云芝糖肽，其中多糖含量≥75％，蛋白含量≤15％，平均分子量范围30Kd～300Kd。但是其产品及其纯化工艺还是存在三方面不足：第一，采用Savege法进行脱蛋白虽然可以 脱除游离蛋白，但是也不可避免地脱除了具有生理活性的部分多糖肽和多糖，造成了活性成分的损失、产品得率下降；第二，采用分子量为30Kd和300Kd的超滤膜截留除去分子量小于30Kd和大于300Kd物质时也造成了相应的活性糖肽的损失，产品得率进一步下降。而且分子量小于30Kd或大于300Kd的糖肽也具有增强免疫活性和抗肿瘤作用，并无研究表明其活性比分子量在30Kd～300Kd的糖肽弱。第三，经过多次纯化后，虽然产品中多糖含量从35～40％提高到75％以上，但产品得率已经成倍下降、成本成倍上升，所以只能作为注射用中药原料，且其糖肽，特别是含有部分游离蛋白和多量不明杂质的糖肽类中药注射剂，在注射给药时不可避免地产生过敏反应等毒副反应，增加了肿瘤患者的临床风险。

发明内容

本发明目的在于提供一种高含量、高活性口服云芝糖肽，易溶于水，而且尽可能保留了云芝糖肽中的活性成分。

本发明的第二个目的在于提供这种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法。

本发明第三个目的在于提供这种高含量、高活性口服云芝糖肽在制备抗肿瘤药物方面的应用。

一种高含量、高活性口服云芝糖肽，糖肽总量≥70％；经HPLC凝胶柱层析、GPC软件统计分析，产品中重均分子量在10Kd以上的多糖肽在占糖肽总量中的含量≥80％。这种口服云芝糖肽尽可能保留了云芝糖肽中的活性成分，而且在水中易溶。

其中糖含量为50～80％，肽含量为16～30％。

这种高含量、高活性口服云芝糖肽为云芝子实体或发酵生产的云芝菌丝体中提取纯化的产物，既可以从云芝子实体或菌丝体中直接水 提醇沉纯化得到，也可以从市售的云芝糖肽、云芝胞内糖肽、云芝胞外糖肽等云芝提取物粗品中纯化得到。由于云芝糖肽中的多糖富含羟基，且具有三维立体结构，在乙醇沉淀时很容易与色素等物质结合而形成共沉淀，带进了大量杂质，降低了产品中多糖肽的含量，影响了产品的质量。为了减少杂质与多糖共沉淀的形成，提高产品质量，本发明采用调节pH、微孔滤膜精密过滤或离心分离提取液、减压浓缩、边搅拌边缓慢加入乙醇进行沉淀且搅拌平衡一定时间、多次水提醇沉进行纯化的技术方案。还可进一步采用膜滤和柱层析技术进行精制得到更高纯度的云芝糖肽。

这种高含量、高活性口服云芝糖肽制备方法如下：

(1)取云芝粗提取物混悬或溶解于80～100℃热水中，提取分离云芝粗提取物溶液，或者用80～100℃热水提取云芝菌丝体或者云芝子实体制备云芝粗提取物溶液；

(2)将云芝粗提取物溶液的ph值控制在4～8，过滤或离心分离得到澄清提取液，浓缩至比重为1.05～1.3；

(3)采用水提醇沉法进行纯化，获得浓缩料。

步骤(1)中所述的云芝粗提取物包括云芝糖肽、云芝胞内糖肽、云芝多糖以及云芝菌丝体或子实体的水提取物。

步骤(2)中所述的过滤为0.1～5μm的微孔滤膜精密过滤。所述的离心速率为4000-12000rpm。

步骤(3)中所述水提醇沉的方法为：

(a)边搅拌边加入1～5倍体积80％～100％的乙醇，继续搅拌0.5～2小时；

(b)过滤或离心分离得到沉淀，挥干乙醇；

(c)用1～5倍重量水复溶沉淀，重复步骤(a)和(b)1～2次。

将步骤(3)得到的产物进行干燥、粉碎，或者采用膜分离技术或柱层析技术进行精制后干燥、粉碎。

所述的膜分离技术为透析和超滤；所述柱层析技术为DEAE-纤维素柱、DEAE-Sephadex柱、Sephadex凝胶柱、Saphrose凝胶柱、Biogel凝胶柱或大孔吸附树脂柱层析分离技术。

所述的干燥为：喷雾干燥、减压干燥、冰冻干燥或常压干燥。

这种高含量、高活性口服云芝糖适用于肿瘤的预防和治疗，可应用于制备抗肿瘤药物，单用和联用环磷酰胺抗瘤时，本品比现有的云芝糖肽具有更有效的抗肿瘤作用，对骨髓功能和免疫功能的保护作用也更好。与医药学上可接受的原辅料复配后制成各种口服制剂，包括散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液等常释和缓释制剂。

本发明的高含量、高活性口服云芝糖纯度高，制备工艺简单、成本低，抗肿瘤效果及对骨髓和免疫功能的保护作用更好。

具体实施方式

举以下实施例的目的是为了更好地理解本发明，本发明不受以下实施例的限制。

实施例1

取云芝糖肽10kg，加100L水，在90℃溶解提取2小时，调节pH4-8，以0.5μm的微孔滤膜精密过滤得到澄清提取液。残渣重复提取2次，澄清提取液合并，减压浓缩至密度为1.2；边搅拌边缓慢加入3倍体积95％的乙醇进行沉淀，继续搅拌1小时，离心分离沉淀，60℃减压干燥，粉碎，即得高含量、高活性口服云芝糖肽。1g该糖肽可完全溶解于5ml水中，其中糖肽总量为75.6％，糖含量为52.4％，肽含量为23.2％，分子量在10kd以上的多糖肽占糖肽总量84.6％。

实施例2

取云芝多糖10kg，加40L水，100℃溶解提取0.5小时，调节pH4，5000转/分高速离心分离得到澄清提取液。残渣重复提取3次，澄清提取液合并，减压浓缩至密度为1.05，边搅拌边缓慢加入4倍体积80％的乙醇进行沉淀，继续搅拌2小时，离心分离沉淀，50℃减压干燥燥，粉碎，即得高含量、高活性口服云芝糖肽。1g该糖肽可完全溶解于5ml水中，其中糖肽总量为72.2％，糖含量为51.9％，肽含量为20.3％，分子量在10kd以上的多糖肽占糖肽总量81.8％。

实施例3

取云芝胞内糖肽10kg，加200L的水，80℃溶解提取6小时，调节pH8，过5μm的微孔滤膜精密过滤得到澄清提取液。残渣重复提取1次，澄清提取液合并，减压浓缩至密度为1.3，边搅拌边缓慢加入2倍体积无水乙醇进行沉淀，继续搅拌0.5小时，过滤分离沉淀，冷冻干燥，粉碎，即得高含量、高活性口服云芝糖肽。1g该糖肽可完全溶解于5ml水中，其中糖肽总量为75.1％，糖含量为50.8％，肽含量为24.3％，分子量在10kd以上的多糖肽占糖肽总量为86.8％。

实施例4

液体发酵云芝菌丝体10kg，用水清洗祛除残留培养基，加50L水，100℃提取3小时，板框压滤，滤渣重复提取2次，滤液合并，调节pH6，5000转/分离心分离得到澄清液体，70℃减压浓缩至密度为1.2，边搅拌边缓慢加入4倍体积95％的乙醇进行沉淀，继续搅拌1小时，过滤分离沉淀，挥干乙醇。重复上述水提醇沉1次，沉淀70℃减压干燥，粉碎，即得高含量、高活性口服云芝糖肽。1g该糖肽可完全溶解于5ml水中，其中糖肽总量为73.9％，糖含量为51.6％，肽含量为22.3％，分子量在10kd以上的多糖肽占糖肽总量85.1％。

实施例5

云芝子实体10kg，切成小块，加100L水，100℃提取3小时，板框压滤，滤渣重复提取2次，滤液合并。过0.5μm的微孔滤膜精密过滤得到澄清提取液，70℃减压浓缩至密度为1.2，边搅拌边缓慢加入4倍量95％的乙醇进行沉淀，继续搅拌1小时，过滤分离沉淀，挥干乙醇。重复上述水提醇沉1次，沉淀用5倍质量的水复溶，经10kd的超滤膜超滤，收集分子量≥10kd的部分，50～70℃减压浓缩，浓缩液喷雾干燥，即得高含量、高活性口服云芝糖肽。1g该糖肽可完全溶解于5ml水中，其中糖肽总量为93.1％，糖含量为68.6％，肽含量为24.6％，分子量在10kd以上的多糖肽占糖肽总量95.1％。

实施例6

取按实施例1制备的高活性、高含量云芝糖肽10kg，加100L水90℃溶解，过0.5μm的微孔滤膜精密过滤得到澄清提取液，上Sepharose凝胶柱进行层析精制，收集分子量≥10kd的部分，70℃减压浓缩，喷雾干燥，粉碎，即得精制的高含量、高活性口服云芝糖肽。1g该糖肽可完全溶解于5ml水中，其中糖肽总量为95.2％，糖含量为69.6％，肽含量为25.6％，分子量在10kd以上的多糖肽占糖肽总量97.8％。

实施例7

取按实施例2制备的的高活性、高含量云芝糖肽10kg，微晶纤维素1kg，硬脂酸镁0.05kg，滑石粉0.20kg，置混合机中混合均匀，分装胶囊，即得高活性、高含量云芝糖肽胶囊。

实施例8

取按实施例3制备的的高活性、高含量云芝糖肽10kg，微晶纤维 素1kg，羧甲基淀粉钠0.5kg，置混合机中混合均匀，用70％乙醇水溶液湿法制粒，70℃干燥，整粒，加硬脂酸镁0.05kg，滑石粉0.20kg，总混均匀，压片，即得高活性、高含量云芝糖肽片。

实施例9

取按实施例1制备的的高活性、高含量云芝糖肽10kg，溶解于190L纯水，微孔滤膜过滤，分装于有效容积10ml的口服液瓶中，121℃灭菌20分钟，即得高活性、高含量云芝糖肽口服液。

实施例10  高含量、高活性口服云芝糖肽的药理学实验

1材料

1.1药品与试剂：云芝糖肽(以下用PSP表示，糖肽总量为55.2％，糖含量为38.3％，肽含量为16.8％，分子量在10kd以上的多糖肽含量为53.7％)，批号050901；实施例1中的高含量、高活性的可溶性口服云芝糖肽(用pPSP表示，糖肽总量为75.6％，糖含量为52.4％，肽含量为23.2％，分子量在10kd以上的多糖肽含量为84.6％)，批号051111，均由上海新康制药厂提供。环磷酰胺(CTX)，200mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，批号05101721。

1.2实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重18±2g，由中国科学院上海实验动物中心提供。

1.3细胞株：肉瘤180(S180)腹水型瘤株由上海药物研究所提供。

1.4主要仪器：SysmexF-820半自动血细胞分析仪(日本东亚)。2方法

2.1荷瘤模型制作方法

处死S180腹腔传代小鼠，常规消毒后腹腔注入灭菌生理盐水 (NS)5ml，抽取腹水，再用灭菌NS稀释瘤细胞至8×106个/ml(死亡率＜5％)。按无菌操作要求接种于小鼠右前肢腋下皮下0.2ml/只。

2.2动物分组与给药方法

分组：每批次90只动物，除10只用于正常对照组外，其余均荷瘤，次日随机分为8组，每组10只。分组包括荷瘤模型对照组、CTX对照治疗组、联用治疗组和单用治疗组。CTX对照治疗组、联用治疗组的CTX用量均为30mg/kg(注射)，pPSP及PSP均为口服给药。

联用治疗组：CTX+pPSP低剂量组(200mg/kg)、CTX+pPSP中剂量组(400mg/kg)、CTX+pPSP高剂量组(800mg/kg)、CTX+PSP中剂量(400mg/kg)；单用治疗组：pPSP中剂量组(400mg/kg)、PSP中剂量组(400mg/kg)。

批次：共分2个批次：批次I、II分别于荷瘤后第8、12天处理。

给药方法：各组都在荷瘤次日起给药，腹腔注射(i.p.)和灌胃(i.g.)给药各每天一次，各0.1ml/10g；i.p.连用7天；i.g.用至大处理前一天，即荷瘤后第7天(批次I)和第11天(批次II)。

荷瘤模型组：i.p.和i.g.都为NS；CTX对照治疗组：i.p.CTX，30mg/kg；i.g.NS；联用治疗组：i.p.CTX，30mg/kg；分别i.g.pPSP：200mg/kg、400mg/kg、800mg/kg或PSP：400mg/kg。单用治疗组：i.p.NS；i.g.pPSP：400mg/kg或PSP：400mg/kg。

2.3观察指标与检测方法

各批次观察体重增长、进食、排便、毛发、活动等一般情况；其中批次II兼做血常规(第4、8、12天剪尾采血)。

各批次大处理时，先称体重、采血(批次II)；处死后取瘤、胸腺、脾脏称重，进而换算出抑瘤率、胸腺指数、脾脏指数；批次I、II另取右后肢股骨作骨髓有核细胞(BMNC)计数。

血常规检测：使用血细胞分析仪测定白细胞(WBC)、血红蛋白(HB)、血小板(PLT)。

抑瘤率(％)：即(荷瘤模型组瘤重-治疗组瘤重)/荷瘤模型组瘤重×100％。

胸腺指数、脾脏指数(mg/10g体重)：即胸腺重量、脾脏重量与体重的比值。

BMNC计数：先除尽股骨外周软组织，再用3％醋酸溶液10ml冲出全部骨髓，过4号针头，使成单细胞悬液，显微镜下计数BMNC。

2.4统计分析  计量资料以 

表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

3结果

3.1pPSP、PSP对荷瘤小鼠的抗肿瘤效应

单用时，pPSP、PSP都只在第12天体现抑瘤效应；联用CTX时，两者都能在第8、12天可增强抑瘤效应，提高抑瘤率；联用不同剂量的pPSP对抑瘤效应增强程度无明显区别(见表1、2)。

表1  pPSP、PSP对荷瘤小鼠的抑瘤作用

与荷瘤模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与CTX对照治疗组比较：*P＜0.05，**P＜0.01。

表2  pPSP、PSP对荷瘤小鼠的抑瘤率比较

3.2pPSP、PSP对荷瘤小鼠免疫器官的影响

单用时，pPSP具有对抗荷瘤所致的胸腺指数降低的作用，PSP则仅有对抗降低的趋势；两者对脾脏指数的动态变化无差异，对荷瘤第12天脾脏指数回降都有抑制作用。联用CTX时，pPSP比PSP更早促进胸腺指数、脾脏指数的回升。联用不同剂量的pPSP对胸腺指数、脾指数无明显剂量依赖关系(见表3、4)。

表3  pPSP、PSP对荷瘤小鼠胸腺指数的影响

与荷瘤模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与CTX对照治疗组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

表4  pPSP、PSP对荷瘤小鼠脾脏指数的影响

与荷瘤模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与CTX对照治疗组比较：*P＜0.05。

3.3pPSP、PSP对荷瘤小鼠外周血象的影响

单用时，pPSP明显增加外周血白细胞、血红蛋白、血小板的数量；PSP明显增加外周血白细胞数量、但对血红蛋白、血小板的数量影响较小。联用CTX时，两者都不能阻止CTX的初期降低白细胞的作用，但都能促进后期白细胞的回升；两者都有对抗CTX降低血红蛋白的作用；两者对血小板都无明显影响。联用不同剂量的pPSP对血常规改善无明显剂量依赖关系(见表5～7)。

表5  pPSP、PSP对荷瘤小鼠WBC的影响

与荷瘤模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与CTX对照治疗组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

表6  pPSP、PSP对荷瘤小鼠HB的影响

与荷瘤模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.001；与CTX对照治疗组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与PPSP中剂量比较：&P＜0.05。

表7  pPSP、PSP对荷瘤小鼠PLT的影响

与荷瘤模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.001；与CTX+PPSP低剂量组比较：*P＜0.01，**P＜0.001。

3.4pPSP、PSP对荷瘤小鼠骨髓功能的影响

单用时，两者对荷瘤所致的骨髓有核细胞减少都有明显的促进回升作用。联用CTX时，两者对荷瘤及CTX所致的骨髓有核细胞减少都有明显的促进回升作用；并且存在PPSP剂量越大，回升作用越强的趋势(见表8)。

表8  pPSP、PSP对荷瘤小鼠骨髓有核细胞数的影响

与荷瘤模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；与CTX对照治疗组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；与CTX+PPSP低剂量组比较：&P＜0.05。

3.5pPSP、PSP对荷瘤小鼠一般情况的影响

单用时，两者对体重增长、进食、排便、毛发、活动等均无明显影响。联用CTX时，两者对CTX所致的排稀软粪便、毛发稀疏干枯、活动抑制均有所改善；但对于体重增长延缓，初期反而有加重的趋势，且pPSP量越大越明显，至后期才与CTX对照治疗组无差异。

4结论

S180皮下荷瘤小鼠的瘤体呈进行性增长，小鼠的体重增长、进食、排便、毛发、活动等一般情况与正常小鼠无明显差异；虽然外周血象基本无异常变化，但是骨髓有核细胞数明显减少，表明荷瘤导致一定程度的骨髓抑制；胸腺指数降低和脾脏指数先升后降，表明荷瘤导致免疫功能的抑制。单用CTX治疗时，瘤体生长明显受抑；但是抑制骨髓功能和免疫功能进一步加剧；并出现一般情况的恶化，如，体重增长延缓、进食减少、排稀软粪便、毛发稀疏干枯、蜷缩少动等。单用pPSP或PSP治疗时，能发挥一定程度的抑瘤作用，并在一定程度上保护了骨髓功能和免疫功能。CTX联用pPSP或PSP治疗时，则抑瘤作用进一步加强，同时联用pPSP或PSP能减轻荷瘤与CTX所致的骨髓功能和免疫功能的抑制，有效缓解一般情况的恶化。相比之下，单用和联用CTX抗瘤时，对骨髓功能和免疫功能的保护，pPSP优于PSP。

Claims (11)

1.一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取云芝粗提取物混悬或溶解于80～100℃水中，提取分离云芝粗提取物溶液，或者用80～100℃热水提取云芝菌丝体或者云芝子实体制备云芝粗提取物溶液；

(2)将云芝粗提取物溶液的 pH值控制在4～8，过滤或离心分离得到澄清提取液，浓缩至比重为1.05～1.3；

(3)采用水提醇沉法进行纯化，获得浓缩料。

2.权利要求1所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，将步骤(3)的产物进行干燥、粉碎，或者采用膜分离技术或柱层析技术进行精制后干燥粉碎。

3.权利要求1所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的云芝粗提取物选自云芝糖肽、云芝胞内糖肽、云芝多糖以及云芝菌丝体或子实体的水提取物。

4.权利要求1所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的过滤为0.1～5μm的微孔滤膜精密过滤；所述离心速率为4000-12000rpm。

5.权利要求1所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述水提醇沉方法为：

(a)边搅拌边加入1～5倍体积80～100％的乙醇，继续搅拌0.5～2小时；

(b)过滤或离心分离得到沉淀，挥干乙醇；

(c)再用1～5倍重量水复溶沉淀，重复步骤(a)和(b)1～2次。 

6.权利要求2所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，所述的膜分离技术为透析或超滤。

7.权利要求2所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，所述的柱层析技术为DEAE-纤维素柱、DEAE-Sephadex柱、Sephadex凝胶柱、Saphrose凝胶柱、Biogel凝胶柱或大孔吸附树脂柱层析分离技术。

8.权利要求2所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽的制备方法，其特征在于，所述的干燥为喷雾干燥、减压干燥、冰冻干燥或常压干燥。

9.一种高含量、高活性口服云芝糖肽，其特征在于，通过权利要求1～8所述方法制备，其中糖肽总量≥70％，重均分子量在10kd以上的多糖肽在糖肽总量中的含量≥80％。

10.权利要求9所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽，其特征在于，其中糖含量为50％～80％，肽含量为16％～30％。

11.权利要求9所述一种高含量、高活性口服云芝糖肽在制备抗肿瘤药物方面的应用，其特征在于，与医药学上可接受的原辅料复配后制成口服制剂，包括散剂、丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。