CN106421208B - 一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物及其制备方法,所述药物组合物的有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,按其重量份数计慈姑提取物50‑70份、葛根提取物5‑15份、黄芪提取物5‑15份、五味子提取物5‑15份、枸杞子提取物5‑15份,通过混合方式获得;各组分协同作用,抗化学性肝损伤效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物组合物及其制备方法,尤其是一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物及其制备方法。
背景技术
化学性肝损伤是由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤。这些化学物质包括酒精、环境中的化学毒物及某些药物。作为人体的重要解毒器官的肝脏具有肝动脉和肝静脉双重血液供应。化学物质可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化,因此肝脏容易受到化学物中的毒性物质损害。大自然和人类工业生产过程中均存在一些对肝脏有毒性的物质,称为"亲肝毒物",这些毒物在人群中普遍易感,潜伏期短,病变的过程与感染的剂量直接相关,可引起肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变形、肝硬化和肝癌。
我国中草药资源丰富,对现有中草药进行提取并对其进行特定筛选和组方,实现抗化学性肝损伤的功效,将具有非常重要的应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法。
为解决上述技术问题,本发明的技术方案是:
一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,按其重量份数计慈姑提取物50-70份、葛根提取物5-15份、黄芪提取物5-15份、五味子提取物5-15份、枸杞子提取物5-15份。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,按其重量份数计慈姑提取物60份、葛根提取物10份、黄芪提取物10份、五味子提取物10份、枸杞子提取物10份。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,所述慈姑提取物是由水提醇沉方法得到的具有多糖成分的提取物。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,所述葛根提取物是由乙醇回流方法得到的具有黄酮成分的提取物。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,所述黄芪提取物是由乙醇回流方法得到的具有黄酮成分的提取物。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,所述五味子提取物是由超声提取工艺得到的具有多糖成分的提取物。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,所述枸杞子提取物是由水提醇沉方法得到的具有多糖成分的提取物。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,还包括稀释剂、助悬剂、抗氧化剂、乳化剂、崩解剂、黏合剂和/或稳定剂。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。
上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)按组方量称取慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物为原料;
(2)各组分混合均匀,即得。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法,所述步骤(2)所得混合物通过造粒成型、干燥得到片剂或颗粒剂。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法,以乳糖作为辅料,所述步骤(2)所得混合物与乳糖的重量比为1:2,乙醇浓度为80%(v/v),所得颗粒剂的颗粒成型性好、溶化速度快且静置后无沉淀、休止角小于40°,并且易成粒不粘连。
优选的,上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法,所述步骤(2)所得混合物通过干燥、过筛放入胶囊中,得到胶囊剂。
上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的用量为60kg成人5g/天。
本发明的有益效果是:
上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,各组分协同作用,抗化学性肝损伤的效果显著;其制备方法简单,使用方便,适合规模化工业生产的需要。
附图说明
图1是正常组小鼠肝脏组织H-E染色图200X;
图2是模型组小鼠肝脏组织(渗出性病变)H-E染色图200X;
图3是模型组小鼠肝脏组织(淤血性病变)H-E染色图200X;
图4是模型组小鼠肝脏组织(气球样变性样病变)H-E染色图200X;
图5是水飞蓟素组小鼠肝脏组织H-E染色图200X;
图6是非慈姑组合物组小鼠肝脏组织H-E染色图200X;
图7是慈姑提取物组小鼠肝脏组织H-E染色图200X;
图8是慈姑组合物小剂量组小鼠肝脏组织H-E染色图200X;
图9是慈姑组合物中剂量组小鼠肝脏组织H-E染色图200X;
图10是慈姑组合物大剂量组小鼠肝脏组织H-E染色图200X。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
下述实施例中各组分的获得方法如下:
慈姑提取物是由下述方法获得的:
(1)市售云南产新鲜慈姑,削皮切片55℃烘干,慈姑干(片)加10倍水煎煮提取3次(各1.5、1、0.5小时),80目尼龙网过滤除渣;滤液加热浓缩至煎煮水体积的15%后离心后取上清液,沉淀加上清液一半体积的水煮沸保温30分钟后再次离心取上清液,合并两上清液;
(2)上清液加热浓缩至原体积的15%后加5倍重量硅胶(80-100目)拌匀,真空干燥(60℃,-0.08兆帕)干燥后装柱;
(3)依次用95%乙醇(煎煮水体积的15%)和85%乙醇(煎煮水体积的12%)洗脱,合并洗脱液并减压抽干(78℃,-0.08兆帕),加水(煎煮水体积的0.2%)溶解,再用95%乙醇稀释到水溶液体积的12倍(乙醇含量低于85%),静置过夜,倾出上清液,得少量未精制慈姑组合物;
(4)样品柱先用水(煎煮水体积的25%)洗脱,再用60-70℃热水(煎煮水体积的12.5%)洗脱,合并洗脱液并加热浓缩至原体积的7%,得未精制慈姑组合物溶液;
(5)将步骤(3)与步骤(4)所得未精制慈姑组合物溶液合并,放入分液漏斗,并加入合并液体积30%的氯仿及合并液体积6%的正丁醇震荡混匀,静置过夜;
(6)取分液漏斗下层及中间乳化层离心,用80目尼龙网过滤除去固体(蛋白质)后,液相再次倒回分液漏斗震荡混匀,静置过夜(此步骤重复3次);
(7)最终过滤液加热浓缩至粗多糖合并溶液体积的40%,趁热加入10倍体积95%乙醇静置过夜,倾出上清液得精制慈姑组合物;倾出的上清液减压抽干(78℃,-0.08兆帕),加水(煎煮水体积的0.2%)溶解,再用95%乙醇稀释到水溶液体积的12倍(乙醇含量低于85%),静置过夜,再次倾出上清液,得少量精制慈姑组合物;合并两部份精制慈姑组合物,真空干燥(60℃,-0.08兆帕)得慈姑组合物产品(慈姑干的2.3%);利用苯酚-硫酸法对精制慈姑组合物含量进行测定:测定波长490nm,多糖换算因子f=1.82;在范围20μg-100μg内呈良好线性关系,r=0.9992。结果表明,供试溶液在2h内显色稳定,重现性好,平均回收率为104%,RSD=4.72(n=5),多糖含量为34.31%。
葛根提取物是由下述方法获得的:
葛根药材,购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。乙醇回流法提取工艺如下:选取50%的乙醇溶液为提取溶剂,溶剂用量为20倍,提取时间为120min,提取2次,葛根素得率为1.998%,葛根总黄酮得率为8.914%。
黄芪提取物是由下述方法获得的:
黄芪饮片购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。乙醇回流法提取工艺如下:提取温度75℃,提取时间2.5h,提取液乙醇浓度90%(v/v),液料比20mL/g,在此工艺条件下进行实验,黄芪黄酮的提取得率为0.934mg/g。
五味子提取物是由下述方法获得的:
五味子药材,购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。超声辅助提取工艺如下:料液比1:25(g:ml),超声时间40min,超声功率600w,提取温度55℃,五味子多糖的提取得率为4.67%,在此工艺条件下进行实验,工艺简便安全,稳定可行。
枸杞子提取物是由下述方法获得的:
枸杞子药材,购自北京同仁堂(毫州)饮片有限责任公司。水提醇沉法提取工艺如下:料液比为1∶35(g∶mL),温度为90℃,pH为11,浸提3h,提取2次,合并提取液,加3倍体积95%乙醇沉淀6h时,提取效果最佳,提取率为18.56%。另外,在提取时,采用超声波辅助提取30min,可提高多糖提取率。
实施例1
一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,其中,慈姑提取物60kg、葛根提取物10kg、黄芪提取物10kg、五味子提取物10kg、枸杞子提取物10kg。
上述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法,具体制备步骤如下:
(1)按组方量称取慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物为原料;
(2)各组分混合均匀,即得。
实施例2
一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,其中,慈姑提取物70kg、葛根提取物15kg、黄芪提取物5kg、五味子提取物5kg、枸杞子提取物15kg。
制备方法同实施例1。
实施例3
一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,其中,慈姑提取物50kg、葛根提取物5kg、黄芪提取物15kg、五味子提取物15kg、枸杞子提取物5kg。
制备方法同实施例1。
实施例4
一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,其中,慈姑提取物65kg、葛根提取物12kg、黄芪提取物7kg、五味子提取物8kg、枸杞子提取物13kg。
制备方法同实施例1。
实施例5
一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,其中,慈姑提取物55kg、葛根提取物8kg、黄芪提取物11kg、五味子提取物13kg、枸杞子提取物6kg。
制备方法同实施例1。
实施例1-5之一所述各组分用量按照相同比例增加或减少,所得各组分的重量份数关系均属于本发明的保护范围。
组方分析:
慈姑(Sagittaria Sagittifolia L)又名茨菇、燕尾草和剪刀草等,为泽泻科水生草本植物。南朝陶弘景《名医别录》中就对慈姑进行了记载,并被列为中品,在现存最早的食疗专著《食疗本草》中也对慈姑进行了论述。慈姑药食兼用,其价格低廉,在全国范围内有广泛分布和栽培,资源十分丰富,民间常为药用和风味食用。据文献记载,慈姑性味苦甘,微寒,无毒,归肝、肺、脾、膀胱经,具有滋养强身、清热解毒、清肺止咳及消肿散结的功效,临床主治产后血闷、胎衣不下、咳血、石淋和疮毒等病症。中医学对化学性肝损伤的辨证论治认为,其中毒是由于热毒奎盛,熏蒸肝胆所致,治宜清热解毒。
对慈姑的植物化学分析发现,其活性成分主要为多糖、酚类、生物碱和蛋白酶抑制剂,尚含有少量的黄酮、绿原酸和皂苷等。其中,慈姑多糖(Sagittaria sagittifolinpolysaccharide,SSP)含量较高,约占慈姑总含量的13.5%左右。
慈姑作为一种食用性中药,其营养价值也备受关注,对其进行营养保健成分分析发现,慈姑总淀粉含量高达55%以上,以支链淀粉为主,食味较好。慈姑膳食纤维含量较高,以不溶性膳食纤维为主,远远高于其他粮食作物。高膳食纤维与降低血糖、血清甘油三酯和胆固醇有很大关系。慈姑球茎可食部各种抗氧化相关的营养素含量丰富,成分较为齐全,包含铁、锰、锌、铜、硒、VitE及VitC等,尤其是VitE及硒含量引人注目,说明慈姑具有提高机体抗氧化能力和抑制肝脏氧化损伤的物质基础。动物实验研究也证实慈姑对大鼠体内抗氧化能力和DNA修复能力有显著作用。
葛根入脾胃经,且味甘。符合中医肝病治法中首先兼顾脾胃,甘缓的治疗大法,根据前期文献数据分析,葛根具有较显著的保肝作用。
黄芪味甘,入肺肝肾经,味甘同样符合甘缓的治疗大法,其功效益气,扶正补虚,是免疫增强药,可以通过补气增强免疫力保肝。
五味子味酸,酸收,酸缓急止痛是其保肝的基础。
枸杞子具有滋补肝肾的功能为其保肝的基础。
上述各组分相互协同作用,抗化学性肝损伤的效果显著。
实验例
Ⅰ体外实验研究表明慈姑组合物对化学性肝损伤保护作用显著
1实验材料
1.1实验细胞
人肝癌细胞株HepG2细胞株(中国人民解放军军事医学科学院赠予)。HepG2细胞接种于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml链霉素的DMEM高糖培养基中,于37℃,5%CO2饱和湿度细胞培养箱中静置培养,0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期的细胞用于实验。
1.2实验药物
慈姑提取物,制备方法同上述实施例。
慈姑组合物,为实施例1所述药物组合物。
非慈姑组合物,由葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物按重量比1:1:1:1混合制备而得。
1.3实验试剂与仪器
1.3.1实验试剂
异烟肼(INH)、噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(sigma公司);利福平(RFP,北京华威锐科化工有限公司);丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒、天冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所);胰蛋白酶、青链霉素(北京索莱宝公司);DMEM高糖培养基(Gibco公司);胎牛血清(德国Pan);维生素E(上海生工生物公司)。
1.3.2实验仪器
FW-400A倾斜式高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司);R系列旋转蒸发器(上海申生科技有限公司);DLSB-30/40低温冷却循环泵(上海上登实验设备有限公司);DU800紫外/可见光分光光度计(美国贝克曼库尔特有限公司);细胞培养箱(日本SANYO公司);酶标仪(美国BIORED);倒置显微镜(日本Olymupus公司);高速离心机(美国IEC)。
2实验方法
2.1细胞分组
取生长状态良好的HepG2细胞以每孔5×104个·mL-1接种于96孔细胞培养板中,每孔100μL,置37℃,5%CO2的培养箱内培养,24h后,肝细胞全部贴壁生长,用于实验。实验随机分成6组:空白组、正常对照组、模型组(INH/RFP组)、阳性对照药(维生素E组)、慈姑提取物组、慈姑组合物组和非慈姑组合物组。
2.2给药方法
空白组无细胞,只加培养基;正常对照组换入正常培养液;模型组加入INH/RFP使其浓度为1μg·mL-1;慈姑提取物组、慈姑组合物组和非慈姑组合物组分别对应加入浓度为500μg·mL-1的慈姑提取物、慈姑组合物和非慈姑组合物、阳性对照组加入浓度为50μmol·mL-1的维生素E,2h后这四组(慈姑提取物组、慈姑组合物组、非慈姑组合物组和维生素E组)再加入浓度为1μg·mL-1的INH/RFP,继续培养24h,每个组设6个平行孔。
2.3观察指标与方法
2.3.1细胞存活率的检测
取生长状态良好的HepG2细胞以每孔5×104个·mL-1接种于96孔细胞培养板中,每孔100μL,置37℃,5%CO2的培养箱内培养24h后,肝细胞全部贴壁生长,用于实验。每孔加入浓度为5g·L-1的MTT溶液,继续培养4h,弃上清,每孔加入150μl DMSO,摇床震荡10min,放入酶标仪上测定570nm处的光吸收值,重复3次,计算细胞存活率。
细胞存活率=(实验组-空白组)/(正常对照组-空白组)×100%。
2.3.2细胞培养液中LDH、ALT、AST、MDA的释放
取对数生长期的HepG2细胞以每孔5×104个·mL-1接种于24孔细胞培养板中,置37℃,5%CO2的培养箱内培养24h后,肝细胞全部贴壁生长,用于实验。按2.1和2.2分组加药,24h后收集上清,按试剂盒说明书步骤测定各组细胞上清液中AST(天门冬氨酸氨基转移酶)、ALT(丙氨酸氨基转移酶)、乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)的活性。
2.4统计学方法
统计学分析采用SPSS 16.0统计软件,所有实验均重复3次以上,实验结果用表示,2个独立样本组间均数比较用t检验,多组间采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法,以P<0.05表示差异具有统计学意义。
3结果
3.1非慈姑提取物、慈姑提取物和慈姑组合物对肝细胞活力的影响,见表1。
注:与正常对照组相比,#:p<0.05,##:p<0.01;与模型组相比,*:P<0.05,**:P<0.01
如表1所示,与正常对照组比较,INH/RFP模型组的细胞存活率明显降低(P<0.01),经非慈姑组合物、慈姑提取物、慈姑组合物和维生素E的处理后细胞存活率由64.2%增加到73.2%、76.4%、78.3%和80.4%,与损伤模型组相比,均有统计学意义(P<0.05),其中慈姑组合物的细胞存活率更接近阳性对照组(维生素E),高于慈姑提取物和非慈姑组合物。慈姑提取物细胞存活率稍高于非慈姑组合物,两者的相加作用更好。
注:与正常对照组相比,#:p<0.05,##:p<0.01;与模型组相比,*:P<0.05,**:P<0.01
由表2所示,HepG2细胞与INH/RFP共同孵育24h后,细胞培养上清液中的LDH、ALT、AST和MDA水平均较正常对照组明显升高(P<0.01),表明造模成功。经非慈姑组合物、慈姑提取物和慈姑组合物及维生素E的预处理2h后再与INH/RFP共同孵育,细胞培养上清液中的LDH、ALT、AST、MDA水平有所下降,均有统计学意义(P<0.05),其中慈姑组合物的降低程度好于慈姑提取物和非慈姑组合物,慈姑提取物又好于非慈姑组合物。提示非慈姑组合物和慈姑提取物均有保肝作用,两者相加保肝效果更好。
Ⅱ体内实验研究表明慈姑组合物对化学性肝损伤保护作用显著
1材料与方法
1.1材料
丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所),异烟肼INH(Sigma公司),利福平RFP(北京华威锐科化工有限公司),水飞蓟素(德国马博士大药厂)。
1.2实验动物及分组
BALB/c小鼠80只,雄性,体重为(20±2)g,购自中国人民解放军军事科学院实验动物中心,许可证号:SCXK(军)2012-0004。置于温度在(25±3)℃、湿度在(45±10)%的动物房内饲养,自由饮水、摄食。采用随机数字表法将小鼠随机分成8组:对照组,模型组,阳性对照药(水飞蓟素)组,非慈姑组合物组、慈姑提取物组和低、中、高剂量慈姑组合物组,每组10只。
1.3方法
1.3.1药物制备
(1)精密称取I NH和RFP各2g,分别置于100ml的容量瓶中,各加入生理盐水定容至刻度即得20mg/ml的溶液。
(2)取水飞蓟素胶囊5粒,加入70ml生理盐水即得10mg/ml的溶液。
(3)非慈姑组合物、慈姑提取物和慈姑组合物,制备同前述实验例Ⅰ。精密称取制备所得非慈姑组合物、慈姑提取物和慈姑组合物各6.4g,分别加入生理盐水80ml即得各组80mg/ml的溶液,其中慈姑组合物组摇匀后再稀释成40mg/ml和20mg/ml的溶液,为慈姑组合物组的中、低剂量组。
1.3.2给药方法
非慈姑组合物组和慈姑提取物组:给予0.8g/kg的非慈姑组合物和慈姑提取物;低、中、高剂量慈姑组合物组:给予0.2g/kg、0.4g/kg和0.8g/kg的慈姑组合物;阳性对照组:给予0.1g/kg的水飞蓟素,对照组和模型组给予等体积的生理盐水。4h后除对照组外,其他各组给予(0.1+0.1)g/kg的I NH/RFP,对照组给予等体积的生理盐水,连续灌胃30d。
1.3.3样品处理
全部动物末次给药后禁食12h,称量体重,眼球取血,3000r/min离心,取上清;快速取出肝脏,称重;称取定量的肝组织加入生理盐水制成10%的肝匀浆;另取相同部位肝叶,置10%甲醛溶液中固定,切片。
1.3.4计算肝指数
肝指数=肝脏重量(mg)/体重(g)
1.3.5检测生化指标
血清ALT、AST、LDH的活性以及肝匀浆MDA、GSH的含量,均按试剂盒说明进行测定。
1.3.6病理学检查
10%甲醛溶液固定的肝组织,进行常规脱水、石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察。
1.4统计学处理
2结果
2.1慈姑组合物对肝损伤小鼠肝脏指数的影响
与对照组比较,模型组的肝指数增大,有非常显著性差异(P<0.01),与模型组比较,非慈姑组合物、慈姑提取物和慈姑组合物低、中、高剂量组及水飞蓟素组的肝指数均有降低,有显著性差异(P<0.05),其中非慈姑提取物组接近低剂量慈姑组合物组,慈姑提取物组接近中剂量慈姑组合物组,高剂量慈姑组合物组肝脏指数降低最为明显。见表3。
注:与正常对照组比较,a:P<0.01;与模型组比较,b:P<0.05,c:P<0.01
2.2慈姑组合物对肝损伤小鼠血清ALT、AST、LDH的影响
与对照组比较,模型组ALT、AST、LDH活性均增加,有非常显著性差异(P<0.01),与模型组比较,非慈姑组合物组、慈姑提取物组和慈姑组合物低、中、高剂量组和水飞蓟素组ALT、AST、LDH活性均有降低,有显著性差异(P<0.05),其中高剂量慈姑组合物组效果最好,接近甚至超过水飞蓟素组。见表4。
注:与正常对照组比较,a:P<0.01;与模型组比较,b:P<0.05,c:P<0.01
2.3慈姑组合物对肝损伤小鼠肝匀浆中MDA、GSH的影响
与对照组比较,模型组MDA含量升高、GSH含量下降,有非常显著性差异(P<0.01),与模型组比较,非慈姑组合物组、慈姑提取物组和慈姑组合物低、中、高剂量组和水飞蓟素组MDA含量下降;慈姑组合物中、高剂量组和水飞蓟素组GSH含量升高,有显著性差异(P<0.05)。见表5。
注:与正常对照组比较,a:P<0.01;与模型组比较,b:P<0.05,c:P<0.01
2.4肝脏形态学改变
正常组小鼠肝脏切片H-E染色,肝细胞多边形,细胞核蓝色,细胞质红色,相互排列成索状;肝索以中央静脉为起点,向四周伸展;肝索间为血窦,血窦处见有短杆状巨噬细胞;中央静脉圆形,其间有少数红细胞;未见肝细胞渗出、变性、坏死等病理变化,整体切片属正常组织(见图1)。
模型组肝细胞索排列紊乱,肝小叶结构破坏,界限模糊,肝细胞变性,可见到不同程度的空泡变性,部分已有肝细胞脂肪变性,点片状坏死灶,伴有炎性细胞浸润和血液渗出。即模型组小鼠肝细胞切片同时存在渗出性病变、淤血病变和气球样变病理改变。
图2所示模型组小鼠肝脏整体切片属渗出性病变肝炎组织。小鼠肝脏切片H-E染色,肝细胞多边形,细胞核蓝色,细胞质红色,相互排列成索状;肝索以中央静脉为起点,向四周伸展;肝索间为血窦,血窦处见有巨噬细胞;中央静脉圆形,其间有少数红细胞;汇管区静脉中红细胞聚集,小胆管椭圆结构明显;另见有炎性细胞渗出,细胞核圆形胞质很少,排列成小团,小团分别散居组织各处,构成渗出性炎症病灶。
图3所示模型组小鼠肝脏整体切片属局部血液循环障碍肝淤血肝炎组织形态。小鼠肝脏切片H-E染色,切片组织呈粉红与深红不均匀显色。粉红组织中有些细胞结构完整,呈多边形,核圆形蓝色,胞浆粉红色;另一些细胞核圆形蓝色,但胞体肿大,胞浆疏松半透明,是胞浆疏松化变性;有肝索结构,血窦血少,有巨噬细胞。深红组织中有成不规则形扩展区,其中红细胞聚集或散在,与其它扩展区相连,是渗出液凝聚肝组织间隙形成炎性积液病灶;扩展边缘细胞缩小,核亦小且形状不规则,细胞被血包裹,血窦血浆充盈,组成渗出液凝聚肝组织间隙液体渗出病灶,病灶组织不规则条状延伸,将粉红色组织相互分割。
图4所示模型组小鼠肝脏整体切片属气球样变性肝变质性肝炎组织形态。小鼠肝脏切片H-E染色,肝组织多有不着色形态,呈细胞大小不规则网形;肝细胞大小不一,形态不一;细胞核大小不一,形态不一;一些肝细胞肿大,胞浆疏松呈网状半透明,是胞浆疏松化;另一些肝细胞膨大呈球形,胞浆几乎完全透明,胞膜处显圆形红色,是气球样变性;肝血窦扩张,其间有血液。
水飞蓟素组大部分肝小叶结构、细胞形态正常,较模型组改善显著。
图5所示阳性对照水飞蓟素小鼠肝脏切片H-E染色,肝细胞多边形,细胞核蓝色,细胞质红色,相互排列成索状;肝索以中央静脉为起点,向四周伸展;肝索间为血窦,血窦处见有体型较小的巨噬细胞;中央静脉圆形,其间有的有红细胞集中,有的则无;整体切片属正常组织。
非慈姑组合物组小鼠肝脏切片H-E染色,细胞核蓝色,细胞质粉红色,血液红色,组织着色均匀;肝细胞多边形,相互排列呈索状,有功能活跃的大核细胞和双核细胞,个别细胞发生胞浆疏松化;肝索间血窦清楚,个别血窦有所扩展;肝静脉圆形或不规则形,有的含有血液有的则无;整体切片属肝正常有异变相组织形态(见图6)。
慈姑提取物组小鼠肝脏切片H-E染色,汇管区小胆管、小动脉、静脉清楚,小叶间静脉扁长形或多边形;见有渗出液凝聚在扩张肝血窦中,面积小,互不相连,淤血含量少;肝细胞多边形,细胞核蓝色,细胞质红色,相互排列成肝索;一些肝细胞核圆形蓝色,但体积增大,胞质无色成空泡状,是胞浆疏松化形态;整体切片属正常(异变)组织形态(图7)。
慈姑组合物组随着剂量的升高,肝细胞病变较模型组明显减轻,慈姑组合物低、中剂量组尚可见轻度空泡变性,有少量炎性细胞浸润,而慈姑组合物高剂量组绝大部分肝小叶结构、细胞形态正常,肝索排列接近正常,改善效果好于水飞蓟素组。见图8-10。
慈姑组合物小剂量组小鼠肝脏切片H-E染色,细胞核蓝色,细胞质紫红色,红细胞红色,组织着色均匀;肝细胞多边形,相互紧密排列呈索状,有肝细胞肿大,胞浆疏松呈网状半透明,是胞浆疏松化;肝索间血窦清楚,含有血细胞和巨噬细胞;肝静脉形状不规则,其中有红细胞;整体切片属正常有变异组织形态(图8)。
慈姑组合物中剂量组小鼠肝脏切片H-E染色,各中央静脉清楚,呈圆形,各含有少量血液,内皮细胞清楚处于其壁内侧;肝细胞多边形,细胞核蓝色,细胞质红色,相互构成肝索,以中央静脉为起点向四周延伸;肝索间血窦清晰,血窦中显有红细胞,边缘显有小巨噬细胞;另见有数处血窦点状扩张形态;整体切片虽有血窦扩张但属正常组织形态(图9)。
慈姑组合物大剂量组小鼠肝脏切片H-E染色,细胞核蓝色,细胞质紫红色,组织着色均匀;肝细胞多边形,相互紧密排列呈索状;肝索间血窦清楚,含有血细胞,边缘有巨噬细胞;肝静脉圆形或不规则形;整体切片属正常组织形态(图10)。
综上所述,肝损伤小鼠在给予慈姑组合物后,能降低肝脏指数、血清ALT、AST、LDH活性,降低肝匀浆中MDA含量,同时升高GSH含量,并且与慈姑组合物呈明显的剂量依赖性。通过肝组织形态学HE染色观察发现,与模型组比较,慈姑组合物组的肝细胞病变随着剂量的增加明显减轻,慈姑组合物高剂量组绝大部分肝小叶结构、细胞形态正常,肝索排列接近正常。
所使用的阳性对照药水飞蓟素为临床广泛使用,具有绿色、环保、天然、疗效显著等特点(可治疗脂肪肝、酒精肝、乙肝、丙肝)。此外,水飞蓟素被广泛地应用于保健品开发领域。本实验例采用水飞蓟素体内试验小鼠灌胃剂量为0.1g/kg,相当于60kg标准人给予剂量660mg,达到水飞蓟素重症患者的治疗剂量(420mg),水飞蓟素组肝组织形态学HE染色观察发现,大部分肝小叶结构、细胞形态正常,较模型组改善显著。慈姑组合物高剂量组改善效果好于阳性对照水飞蓟素组,且慈姑组合物组改善效果好于同剂量的慈姑提取物组和非慈姑组合物组,还表明慈姑提取物的保肝效果好于非慈姑组合物组,两者协同作用保肝效果更优。
可见,本发明所述药物组合物在体内和体外均对化学性肝损伤(INH/RFP肝损伤模型)具有显著保护作用,保肝效果显著,其高剂量组保肝效果接近阳性药物水飞蓟素。
上述参照实施例对该具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物及其制备方法进行的详细描述,是说明性的而不是限定性的,可按照所限定范围列举出若干个实施例,因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改,应属本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,其特征在于:有效成分由慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物组成,按其重量份数计慈姑提取物50-70份、葛根提取物5-15份、黄芪提取物5-15份、五味子提取物5-15份、枸杞子提取物5-15份。
2.根据权利要求1所述的具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,其特征在于:按其重量份数计慈姑提取物60份、葛根提取物10份、黄芪提取物10份、五味子提取物10份、枸杞子提取物10份。
3.根据权利要求1所述的具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,其特征在于:所述慈姑提取物是由水提醇沉方法得到的具有多糖成分的提取物。
4.根据权利要求1所述的具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,其特征在于:所述葛根提取物是由乙醇回流方法得到的具有黄酮成分的提取物。
5.根据权利要求1所述的具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,其特征在于:所述黄芪提取物是由乙醇回流方法得到的具有黄酮成分的提取物。
6.根据权利要求1所述的具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,其特征在于:所述五味子提取物是由超声提取工艺得到的具有多糖成分的提取物。
7.根据权利要求1所述的具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物,其特征在于:所述枸杞子提取物是由水提醇沉方法得到的具有多糖成分的提取物。
8.权利要求1所述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法,其特征在于:具体制备步骤如下:
(1)按组方量称取慈姑提取物、葛根提取物、黄芪提取物、五味子提取物和枸杞子提取物为原料;
(2)各组分混合均匀,即得。
9.根据权利要求8所述具有抗化学性肝损伤功能的药物组合物的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)所得混合物通过造粒成型、干燥得到颗粒剂,其中,以乳糖作为辅料,所述混合物与乳糖的重量比为1:2,采用乙醇浓度为80%(v/v)。
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