CN102071239A

CN102071239A - 一种抗肿瘤绿豆多肽及其制备方法和在癌症方面的用途

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Publication number: CN102071239A
Application number: CN 201010516627
Authority: CN
Inventors: 张娜; 梁伟力; 刘桂霞; 李汝发; 王晶晶; 高东兴; 王立昆; 郭庆林; 郭成红; 赵俊考; 孟园园; 赵洁; 张�杰; 张莉; 赵燕禹; 郭成铁; 郭瑞; 马玉飞; 赵会兰; 杨雅楠
Original assignee: TIANJIN JUXIAN TECHNOLOGY RESEARCH DEVELOPMENT CENTER
Current assignee: TIANJIN JUXIAN TECHNOLOGY RESEARCH DEVELOPMENT CENTER
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2011-05-25

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤绿豆多肽，并提供了其制备方法和用途。该发明采用乙醇脱脂、碱提、酶解的方法制备绿豆多肽粗提物，然后采用阴离子交换树脂分离的到绿豆多肽，该方法简便易行，原料来源广泛。同时提供了以活性绿豆多肽在抗肿瘤方面的应用。

Description

一种抗肿瘤绿豆多肽及其制备方法和在癌症方面的用途

技术领域

本发明属于生化制药领域，公开一种生物活性肽的制备及应用，特别涉及一种抗肿瘤及其制备方法和应用。

背景技术

癌症是所有疾病中对人类威胁最大、恐惧心理最强的疾病，几乎属于“不治之症”，人们无不谈癌色变。近来年，癌症的发病率显著提高，由于传染病的减少，癌症和心血管疾病已上升为第一第二位的疾病。癌症严重威胁着人们的健康与生命，危害着经济建设与社会发展。目前对肿瘤患者常见的化疗和放疗手段往往导致严重的副作用，因此寻找高校、低毒的抗肿瘤药物是目前的热点之一，而新型的多肽药物恰恰具备了这些特点，小分子多肽广泛存在于自然界，并可通过人工方法，由于其具有相对分子量小、活性高、毒性低的特点，在肿瘤的临床治疗上有重要的价值。

绿豆是豆科(Leguminosae)蝶形花科(Papilionoideas)菜豆族(Phaseoleae)豇豆属(Vigna)中的一个种，属一年生草本自花授粉植物。绿豆在我国已有两千多年的栽培史，资源丰富。绿豆营养丰富，主要含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、钙、磷、铁、胡萝卜素、硫胺素、核黄素和尼克酸等。具有一定的药用价值。其种子性味甘寒，内服具有清热解毒、消暑利尿、抗炎消肿、保肝明目、止泻痢、润皮肤、降血压降胆固醇、防止动脉粥样硬化等功效。外用可治疗创伤、烧伤、疮疖、痈疽等症。故有“食中佳品，济世长谷”之称，是极具研究价值的生物材料。

发明内容

本发明提供一种由绿豆中提取的生物活性肽，并证实其具有抗肿瘤活性。

本发明还提供了绿豆多肽的制备方法，该方法简单易行、流程可控、成本较低廉，适用于工业化生产。

本发明进一步提供了绿豆多肽在肿瘤治疗或预防中应用的证据。

本发明的优点：

1、本发明从市售绿豆中提取生物活性肽，原料成本低廉、来源广泛。

2、绿豆多肽的提取工艺简单易行、流程可控、成本较低廉，适用于工业化生产。

3、绿豆多肽可直接有效地杀伤多种肿瘤细胞，尤其在肝癌细胞的抑制中具有显著效果。

说明书附图：图1是从绿豆中提取生物活性肽用于抗癌的示意图

具体实施方法

实施例1：绿豆生物活性肽的制备

以市售绿豆为原料，粉碎后加入95％乙醇浸提过夜脱脂。过滤，挥干溶媒残渣中加入pH值为9～11的碱液，60～80℃提取2次，每次5小时。合并上清液于60℃加入3％的Alcalase碱性蛋白酶，然后在90℃中反应10min以灭活蛋白酶，离心分离上清液，用盐酸调pH 7.0，减压浓缩后冷冻干燥，粉碎成细粉，即得绿豆多肽粗提物。

采用阴离子交换树脂对绿豆多肽进行初步纯化。将绿豆多肽粗提物用pH6.0的磷酸缓冲液配制成一定浓度的溶液，离心去除沉淀，上样于预处理过的阳离子交换树脂的层析柱(30mm×350mm)，先用pH6.0的缓冲液洗柱，将未吸附的物质洗出，在用含1mol/L NaCl的pH6.0的缓冲液进行洗脱，在波长280nm处检测并收集洗脱峰，冷冻干燥得到绿豆多肽。

实施例2：绿豆多肽对多种癌细胞系的体外抑制作用

分别采用50、100、200mg/kg绿豆多肽处理小鼠，制备含药血清，备用。用0.25％胰酶消化、传代各细胞。以含10％灭活胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞，并将细胞浓度调整至1×10⁴个/ml，向96孔培养板每孔中加入100μl，于37℃，5％CO₂中孵育24h，弃培养液，加入10％过滤除菌的含药血清，37℃，5％CO₂孵育48h，采用MTT法检测细胞的增殖情况。

表1绿豆多肽对不同癌细胞株细胞体外增殖的影响(

n＝10)

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

结果如表1所示，与空白组相比较，绿豆多肽高、中、低三个剂量组对人宫颈癌Hela细胞、A549肺癌细胞和BEL-7402肝癌细胞的生长均有显著的抑制作用，且存在一定的浓度依赖性。

实施例3：对肝癌腹水瘤的抑制作用

取昆明种小鼠2只，腹腔接种复苏的肝癌腹水瘤细胞(1×10⁷个/mL)0.2mL/只，常规饲养8天后，脱颈椎处死，75％乙醇浸泡消毒，纱布吸干乙醇，无菌取腹水，再用无菌生理盐水配成1×10⁷个/mL细胞悬液，取0.2ml腋下注射小鼠，次日分组、称重，设绿豆多肽高剂量组(5mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、低剂量组(20mg/kg)，实验同时设环磷酰胺(CTX)阳性对照组及生理盐水对照组，每组在实验每组腹腔注射给药10天，停药次日，称体重，处死小鼠、剥离实体瘤、称瘤重，计算抑瘤率(％)。

结果如表2，与生理盐水对照组比较，阳性对照组(CTX)对肝癌腹水瘤有较强的抑制作用。绿豆多肽高、中剂量组对肝癌腹水瘤的生长均有明显的抑制作用，其中中剂量组的抑瘤率最大，为66.67％，由此可见，绿豆多肽对小鼠S₁₈₀瘤体生长有明显的抑制作用，且存在一定的浓度依赖性。

表2绿豆多肽对肝癌腹水瘤瘤体生长的影响

与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

实施例4：对S₁₈₀肉瘤株的抑制作用

取健康雄性BALB/c小鼠2只，腹腔接种复苏的S₁₈₀肉瘤细胞(1×10⁷个/mL)0.2mL/只，常规饲养8天后，脱颈椎处死，75％乙醇浸泡消毒，纱布吸干乙醇，无菌取腹水，再用无菌生理盐水配成1×10⁷个/mL细胞悬液，取0.2ml腋下注射小鼠，次日分组、称重，设绿豆多肽高剂量组(5mg/kg)、中剂量组(10mg/kg)、低剂量组(20mg/kg)，实验同时设替加氟(FT207)阳性对照组及生理盐水对照组，每组在实验每组腹腔注射给药10天，停药次日，称体重，处死小鼠、剥离实体瘤、称瘤重，计算抑瘤率(％)。

结果如表3，与生理盐水对照组比较，绿豆多肽高、中剂量组对S₁₈₀瘤体生长均有明显的抑制作用，抑瘤率分别为56.83％和49.16％，由此可见，绿豆多肽对小鼠S₁₈₀瘤体生长有明显的抑制作用，且存在一定的浓度依赖性。

表3绿豆多肽对S180荷瘤小鼠瘤体生长的影响

与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

Claims

1.一种绿豆多肽的制备方法，其特征步骤依次为：

(1)原材料的脱脂处理，对绿豆进行有机溶剂脱脂；

(2)蛋白质的提取，采用碱提法对绿豆中的蛋白质进行提取；

(3)蛋白质的水解，采用碱性蛋白酶对绿豆蛋白进行水解；

(4)绿豆多肽的纯化，采用阴离子交换树脂对绿豆多肽粗提物进行分离纯化。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的脱脂步骤其方法为：以市售绿豆为原料，粉碎后加入95％乙醇浸提过夜脱脂，过滤，挥干溶媒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的蛋白质提取步骤其方法为：向脱脂的绿豆残渣中加入pH值为9～11的碱液，60～80℃提取2次，每次5小时。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的蛋白质水解步骤其方法为：将提取的滤液于60℃加入3％的Alcalase碱性蛋白酶，然后在90℃中反应10min以灭活蛋白酶，离心分离上清液，用盐酸调pH7.0，减压浓缩后冷冻干燥，粉碎成细粉，即得绿豆多肽粗提物。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的多肽纯化步骤其方法为：将绿豆多肽粗提物用pH6.0的缓冲液配制成一定浓度的溶液，离心去除沉淀，上样于预处理过的阴离子交换树脂的层析柱(30mm×350mm)，先用pH6.0的缓冲液洗柱，将未吸附的物质洗出，在用含1mol/L NaCl的pH6.0的缓冲液进行洗脱，在波长280nm处检测并收集洗脱峰，冷冻干燥得到绿豆多肽。

6.一种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防癌症药物中的应用。

7.一种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防宫颈癌药物中的应用。

8.一种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防肺癌药物中的应用。

9.一种权利要求1绿豆多肽在治疗或预防肝癌药物中的应用。