CN103408645B - 一种云芝糖肽制备的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种云芝糖肽的制备方法，属于生物技术范畴。本发明既用水提醇沉法提取了发酵液中的胞外糖肽，又通过碱提的方法来处理菌丝体，获取胞内糖肽类物质，并对碱提后的菌丝体残渣再依次用冷碱和热碱进行提取，提高了胞内糖肽的得率，云芝糖肽的总得率可达到10.50g/L以上，获得的云芝糖肽中糖含量达到56.00％以上，蛋白含量达到35.80％以上。本发明具有技术先进、工艺简单、产率高、成本低、产品纯度高等优点，有利于我国云芝糖肽生产技术和产业化水平的提高。

Description

一种云芝糖肽制备的方法
一、技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及到一种云芝糖肽高效制备的方法。
二、背景技术
云芝[Coriolus versicolor]，又称千层蘑、彩纹云芝、多色云芝、采绒革盖菌等，隶属于真菌门(Mycology)、担子菌亚门(Basidiomycotina)、多孔菌科(Polyporales)、栓菌属(Trametes)。曾用名：Polystictuis Versicolor(L)Fr。
云芝糖肽(Polysacchride Peptide of Coriolus versicolor，简称PSP)是从中国云芝担子菌纲多孔菌科中的一些属、种中提取的一种蛋白多糖类物质，是良好的生物效应剂，适用于食管癌、胃癌等癌症的治疗，具有免疫调节作用，对肿瘤患者的细胞免疫功能和血液系统有一定保护作用，可提高患者的生活质量。在近期的研究中人们又发现它具有抗艾滋病毒活性，近十几年来它引起了人们越来越大的兴趣，成为了很有潜力的抗癌药物。
云芝糖肽最早是由日本从211种担子菌中筛选出的云芝里提取获得的，经过21年的研究，于1981年在美国获得专利，是一种新型的生物反应调节剂类药物，命名为polysaccharides K，简称：PSK，在当时引起了整个医药界广泛的兴趣。目前，云芝糖肽既可由云芝子实体中提取，也可通过液体发酵的方法从云芝菌丝体中提取获得，现大都采用后种提取方法。日本是最先提取获得云芝糖肽的国家，他们采用静置培养法培养菌膜，并用匀浆机将菌膜打碎，以制备发酵种子。在提取工艺上，日本先用NaOH在95-98℃的温度下碱提3个小时，后用5kd滤膜超滤，以除去小分子成分，再用硫酸铵盐析，喷雾干燥以后得到云芝糖肽。
自从云芝糖肽的分离后，国内外学者从体内到体外都进行了大量的实验，目前云芝糖肽已被定位为生物学应答调节剂，在体内，能增加γ-IFN，IL-2的分泌和促进T细胞的增殖，调节体液免疫和细胞免疫功能，同时，能中和环磷酰胺等化疗药物对白细胞和IL-2的抑制作用并且推迟超敏反应，并对于体内的抗肿瘤细胞的增殖活性已得到很好的证明。PSP目前临床上主要应用于放疗、化疗及手术治疗后的联合治疗，能缓解肿瘤患者免疫功能下降的状况，同时应用于抗HBV及HCV等病毒感染的辅助治疗，有助于调节患者的免疫状态。
而当今云芝发酵生产云芝糖肽的过程中，存在着投入较大，成本较高，而云芝糖肽的收率较低，经济效益不高等问题，阻碍了产品的发展。
三、发明内容
本发明的目的是提出高效制备云芝糖肽的一种工艺，依此法可以有效提高云芝糖肽的产量和产品纯度，提高产率，降低生产成本。
一种云芝糖肽高效制备的方法，主要通过如下技术方案实现：
(1)碱液提取发酵菌丝体获得云芝糖肽的菌丝体提取液
微生物发酵后获得菌丝体烘干，研细，精密称定，按比例加入碱液，提取数次后，离心获得云芝糖肽初提液。
(2)冷热碱提取菌丝体残渣获得云芝糖肽菌丝体残渣提取液
菌丝体残渣烘干，研细，精密称定，按比例加入碱液，常温下提取，离心获得部分提取液，碱提后残渣按比例加入碱液，高温提取，离心后合并提取液获得菌丝体残渣提取液。
(3)从云芝糖肽提取液中制备获得云芝糖肽
碱提获得菌丝体提取液及菌丝体残渣提取液混合，减压浓缩至约原体积的 1/5，加入HCl中和；中和处理后提取液同菌株发酵上清液合并，减压浓缩约至原体积的1/5，将浓缩液移至透析袋中流水透析72小时；缓慢加入4倍体积95％乙醇，搅拌均匀，4℃下静置12h，倒出上清液，取沉淀，分别用95％乙醇和丙酮洗涤，70℃真空干燥，即得到云芝糖肽，得率高于10.50g/L以上。
四、本发明的优点
(1)本发明对云芝糖肽的提取工艺进行了深入研究，既用水提醇沉法提取了发酵液中的胞外糖肽，又分别通过水提、碱提的方法来处理菌丝体，获取胞内糖肽类物质，并对水提后的菌丝体残渣再依次用冷碱和热碱进行提取，有效提高了云芝糖肽的得率；
(2)本发明脱色工艺中用树脂法取代传统的活性炭和双氧水脱色的方法，具有脱色时间短、多糖损失小、脱色效率高、易分离等优点，可有效提高云芝糖肽的色泽和质量；
(3)本发明提供的一种云芝糖肽的制备工艺具有技术先进、工艺简单、产率高、成本低、产品纯度高等优点，有利于我国云芝糖肽生产技术和产业化水平的提高。
五、附图说明
附图1是先通过碱提的方法来处理菌丝体，获得含有胞内糖肽类物质的溶液，进一步对碱提后的菌丝体残渣再依次用冷碱和热碱进行提取，获得的提取液同发酵液及菌丝体提取液合并，采用水提醇沉淀的方法处理，获得高质量云芝糖肽的工艺流程图。
六、具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。
实施例一
微生物发酵完毕，离心分离发酵液50L，上清液保留备用；菌丝体烘干，研细，精密称定，按1∶10的比例加入0.3mol/L的NaOH碱液，90℃提取2次，一次2h，合并各次提取液备用；收集碱提菌丝体残渣烘干，研细，精密称定，按1∶10的比例加入0.5mol/L的NaOH碱液，常温下提取2次，一次2h，提取液合并备用，碱提后残渣按1∶10的比例加入0.3mol/L的NaOH碱液，90℃下提取2次，一次2h，菌丝体提取液与菌丝体残渣提取液合并，减压浓缩至约原体积的1/5，加入HCl中和后，获得中和提取液同发酵离心后获得上清液合并，浓缩至云芝糖肽浓度为5mg/mL的溶液，按照m树脂∶V溶液为0.06的比例加入D392树脂，55℃下水浴振荡2h，过滤，滤液即为脱色后云芝糖肽溶液；减压浓缩约至原体积的1/5，将浓缩液移至透析袋中流水透析72小时，缓慢加入4倍体积95％乙醇，搅拌均匀，4℃下静置12h，倒出上清液，取沉淀，分别用95％乙醇和丙酮洗涤，70℃真空干燥，得到云芝胞外糖肽537.5g，糖含量为56.12％，蛋白含量为35.81％。
实施例二
微生物发酵完毕，离心分离发酵液50L，上清液保留备用；菌丝体烘干，研细，精密称定，按1∶11的比例加入0.5mol/L的NaHCO3碱液，92℃提取2次，一次2h，合并各次提取液备用；收集碱提菌丝体残渣烘干，研细，精密称定，按1∶11的比例加入0.5mol/L的NaOH碱液，常温下提取2次，一次2h，提取液合并备用，碱提后残渣按1∶10的比例加入0.5mol/L的NaOH碱液，92℃下提 取2次，一次2h，菌丝体提取液与菌丝体残渣提取液合并，减压浓缩至约原体积的1/5，加入HCl中和后，获得中和提取液同发酵离心后获得上清液合并，浓缩至云芝糖肽浓度为5mg/mL的溶液，按照m树脂∶V溶液为0.06的比例加入D392树脂，55℃下水浴振荡2h，过滤，滤液即为脱色后云芝糖肽溶液；减压浓缩约至原体积的1/5，将浓缩液移至透析袋中流水透析72小时，缓慢加入4倍体积95％乙醇，搅拌均匀，4℃下静置12h，倒出上清液，取沉淀，分别用95％乙醇和丙酮洗涤，70℃真空干燥，得到云芝胞外糖肽561.5g，糖含量为56.24％，蛋白含量为35.85％。
实施例三
微生物发酵完毕，离心分离发酵液50L，上清液保留备用；菌丝体烘干，研细，精密称定，按1∶10的比例加入0.6mol/L的NaHCO3碱液，90℃提取3次，一次2h，合并各次提取液备用；收集碱提菌丝体残渣烘干，研细，精密称定，按1∶10的比例加入0.8mol/L的NaHCO3碱液，常温下提取2次，一次2h，提取液合并备用，碱提后残渣按1∶10的比例加入0.6mol/L的NaHCO3碱液，92℃下提取2次，一次2h，菌丝体提取液与菌丝体残渣提取液合并，减压浓缩至约原体积的1/5，加入HCl中和后，获得中和提取液同发酵离心后获得上清液合并，浓缩至云芝糖肽浓度为5mg/mL的溶液，按照m树脂∶V溶液为0.06的比例加入D392树脂，55℃下水浴振荡2h，过滤，滤液即为脱色后云芝糖肽溶液；减压浓缩约至原体积的1/5，将浓缩液移至透析袋中流水透析72小时，缓慢加入4倍体积95％乙醇，搅拌均匀，4℃下静置12h，倒出上清液，取沉淀，分别用95％乙醇和丙酮洗涤，70℃真空干燥，得到云芝胞外糖肽556.7g，糖含量为56.08％，蛋白含量为35.89％。
实施例四
微生物发酵完毕，离心分离发酵液50L，上清液保留备用；菌丝体烘干，研细，精密称定，按1∶12的比例加入0.3mol/L的NaOH碱液，90℃提取3次，一次2h，合并各次提取液备用；收集碱提菌丝体残渣烘干，研细，精密称定，按1∶8的比例加入1.0mol/L的NaOH碱液，常温下提取2次，一次2h，提取液合并备用，碱提后残渣按1∶12的比例加入0.6mol/L的NaOH碱液，90℃下提取2次，一次2h，菌丝体提取液与菌丝体残渣提取液合并，减压浓缩至约原体积的1/5，加入HCl中和后，获得中和提取液同发酵离心后获得上清液合并，浓缩至云芝糖肽浓度为5mg/mL的溶液，按照m树脂∶V溶液为0.06的比例加入D392树脂，55℃下水浴振荡2h，过滤，滤液即为脱色后云芝糖肽溶液；减压浓缩约至原体积的1/5，将浓缩液移至透析袋中流水透析72小时，缓慢加入4倍体积95％乙醇，搅拌均匀，4℃下静置12h，倒出上清液，取沉淀，分别用95％乙醇和丙酮洗涤，70℃真空干燥，得到云芝胞外糖肽549.8g，糖含量为56.07％，蛋白含量为35.91％。

Claims (1)

1.一种云芝糖肽的制备方法，包括以下步骤：
步骤（1）碱液提取发酵菌丝体获得云芝糖肽的菌丝体提取液，
将微生物发酵后获得的菌丝体分离烘干，研细，精密称定，按菌丝体和碱液的质量体积比例为1:8-1:12，加入碱液0.3mol/L-0.5mol/L的NaOH溶液或0.3mol/L-0.7mol/L的NaHCO3溶液，在温度为90-92℃下提取，提取2-3次，一次2h，离心获得菌丝体提取液和菌丝体残渣；
步骤（2）冷热碱提取菌丝体残渣获得云芝糖肽菌丝体残渣提取液，
将步骤（1）获得的菌丝体残渣烘干，研细，精密称定，按菌丝体残渣和碱液的质量体积比例为1:8-1:12，加入碱液0.3mol/L-1.0mol/L的NaOH溶液或0.8mol/L的NaHCO3溶液，在常温下提取，提取2次，一次2h，离心获得部分提取液和冷碱提取后残渣；按冷碱提取后残渣和碱液的质量体积比例为1:10，加入碱液0.1mol/L-0.7mol/L的NaOH溶液或0.3mol/L-1.0mol/L的NaHCO3溶液，在温度为90-92℃下提取，提取2次，一次2h，离心后合并步骤（2）的所有提取液获得菌丝体残渣提取液；
步骤（3）从云芝糖肽提取液中制备获得云芝糖肽，
将步骤（1）的菌丝体提取液和步骤（2）的菌丝体残渣提取液混合，减压浓缩至原体积的1/5，加入HCl中和；中和处理后的提取液同微生物发酵上清液合并，浓缩至云芝糖肽浓度为5mg/mL的溶液，按照m树脂:V溶液为0.06的比例加入D392树脂，55℃下水浴振荡2h，过滤，滤液即为脱色后云芝糖肽提取液；减压浓缩至原体积的1/5，将浓缩液移至透析袋中流水透析72小时；缓慢加入4倍体积95％乙醇，搅拌均匀，4℃下静置12h，倒出上清液，取沉淀，分别用95％乙醇和丙酮洗涤，70℃真空干燥，即得到云芝糖肽；
上述制备方法的云芝糖肽得率达到10.50g/L以上，产品中糖含量达到56.00％以上，蛋白质含量达到35.80％以上。
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