CN110713513B - 一种云芝胞内糖肽的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高质量云芝胞内糖肽的提取方法，该方法对云芝菌丝体进行干燥，粉碎；煮沸提取2～4h得到提取液，料液比为1:5～1:15；将提取液离心，取上清液；将上清液浓缩，浓缩液常温下测定相对密度在0.98～1.18；加入95％乙醇至乙醇浓度为45～50％进行醇沉，冷藏过夜；离心，分离，取沉淀，干燥。通过本发明方法得到的产品总糖含量高，肽含量低。

Description

一种云芝胞内糖肽的提取方法
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，涉及一种从云芝菌丝体中提取云芝糖肽的方法，具体涉及一种控制总糖与肽含量的云芝胞内糖肽提取方法。
背景技术
云芝胞内糖肽，是从多孔菌科植物云芝菌丝体中提取的高分子糖肽聚合物。具有补益精气，健脾养心的，对细胞免疫功能和血象也有一定的保护作用。用于食管癌、胃癌及原发性肺癌患者放、化疗所致的气阴两虚、心脾不足症。据研究发现云芝糖肽中的多糖具有多种功效，对多种疾病有治疗效果的肽为与糖通过糖肽键结合的结合肽，但云芝糖肽提取过程中会有游离肽在醇沉时随多糖一起沉淀下来，降低总糖含量，增加无用的肽含量。
目前，已经申报国家食品药品监督管理局获批的关于云芝糖肽药品共20余种。云芝胞内糖肽工业大生产多为水提法，通过醇沉获得云芝糖肽，即使总糖含量高，但其中无用的游离肽含量太高，影响总体品质。目前，未有关于控制总糖与肽比例关系的云芝糖肽产品的提取方法的研究报。
发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处提供一种高总糖和低游离肽含量的高质量云芝胞内糖肽的提取方法。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
一种高质量云芝胞内糖肽的提取方法，该方法包括云芝菌丝体制备和云芝胞内糖肽的制备步骤，其中，云芝胞内糖肽的制备包括以下步骤:
1)对云芝菌丝体进行干燥，粉碎；
2)煮沸提取2～4h得到提取液，料液重量比为1:5～1:15；
3)将提取液离心，取上清液；
4)将上清液浓缩，浓缩液在常温下测定相对密度在0.98～1.18；
5)加入95％乙醇至乙醇浓度为45～50％进行醇沉，冷藏过夜；
6)离心，分离取沉淀，干燥。
优选步骤(1)为对云芝菌丝体进行干燥，粉碎至过20～60目筛。
优选步骤(3)和(6)分别是在转速4000～8000r/min条件下离心5～15min。
优选步骤(6)所述的干燥条件为75℃温度下烘干，样品过60～80目筛。
优选步骤(4)所述的相对密度为0.99～1.03。
优选步骤(5)所述的醇沉采用的乙醇浓度为50％。
优选步骤(5)中缓慢加浓度为入95％的乙醇，快速搅拌，当絮状物充满溶液，再搅拌1～2min，进一步确保了溶液混合均匀，多糖沉淀完全。
优选上述云芝菌菌丝体制备包括以下步骤：
1)斜面活化：取云芝斜面，接种于PDA斜面，25-30℃培养3-7d得到云芝菌丝块；
2)一级种子培养：将云芝菌丝块从PDA斜面接种到云芝种子培养基中，置于25-30℃摇床中，150-220rpm培养4d得到云芝一级种子；
3)二级种子培养：将云芝一级种子按10％(v/v)的接种量接种于发酵罐中，在温度25-30℃、转速150-220rpm、通气量1v/v·m的条件下培养3-7d；
4)发酵培养：将发酵罐中培养3-7d后的云芝种子液全部接种于发酵罐中，在温度25-30℃、转速150-220rpm、通气量1v/v·m的条件下培养2-5d；发酵结束后，发酵液采用离心机8000rpm离心5-15min，沉淀，65-75℃真空干燥后粉碎，得到云芝菌丝体。
发明人发现云芝中总糖与肽存在共沉淀现象，当提取液溶液密度越大，肽随总糖沉淀越多，导致总糖含量降低的同时肽含量升高，得率显著增大。当乙醇浓度增加，肽随总糖沉淀越多，导致总糖含量降低的同时肽含量升高，得率显著增大。总糖与肽的检测方法按照国家药品标准WS-XG-021-2002。
与现有技术比较本发明的有益效果：通过本发明方法得到的产品总糖含量高达40％以上的同时，游离肽含量少，糖肽聚合物含量高。而且，本发明还可通过调节提取液浓缩液密度、醇沉时乙醇浓度有效控制云芝胞内糖肽中总糖与肽的含量，满足市场对于云芝总糖、肽不同含量的需求。
附图说明
图1为云芝胞内糖肽对照品；
图2为本发明实施例云芝胞内糖肽样品。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明，其中，云芝菌丝体由江苏神华药业有限公司提供，制备方法如下：
1)斜面活化：取云芝斜面，接种于PDA斜面，25-30℃培养3-7d得到云芝菌丝块；
2)一级种子培养：将云芝菌丝块从PDA斜面接种到云芝种子培养基中，置于25-30℃摇床中，150-220rpm培养4d得到云芝一级种子；
3)二级种子培养：将云芝一级种子按10％(v/v)的接种量接种于发酵罐中，在温度25-30℃、转速150-220rpm、通气量1v/v·m的条件下培养3-7d；
4)发酵培养：将发酵罐中培养3-7d后的云芝种子液全部接种于发酵罐中，在温度25-30℃、转速150-220rpm、通气量1v/v·m的条件下培养2-5d；发酵结束后，发酵液采用离心机8000rpm离心5-15min，沉淀，65-75℃真空干燥后粉碎，得到云芝菌丝体。
实施例1：取已干燥并粉碎至过60目筛的云芝菌丝体粉(20190510)450g，加15倍重量纯化水，置于圆底烧瓶于电热套100℃煮沸提取3h，将得到的提取液4000r/min条件下离心，10min，得上清液4500ml，将上清液分成4份，分别为300ml、600ml、1200ml、2400ml，将,4份上清液分别浓缩至相对密度分别为0.99，1.04,1.09,1.18(常温下测定)。缓慢加入质量浓度为95％的乙醇，快速搅拌，当絮状物充满溶液，再搅拌1min，使得最终乙醇浓度达到70％，4℃静置过夜，4000r/min条件下，离心5min。收集沉淀，放入75℃烘箱中烘干。结果见表1
表1浓缩液密度对云芝胞内糖肽的影响
浓缩液密度 提取率％ 总糖％ 肽％
0.99 9.7 56.7 20.8
1.04 11.1 50.7 25.8
1.09 12.7 44.6 31.9
1.18 14.9 43.6 40.7
实施例2：取已干燥并粉碎至过60目筛的云芝菌丝体粉(批号20190607)1000g，加15倍重量纯化水，置于圆底烧瓶于电热套100℃煮沸提取3h，将得到的提取液4000r/min条件下离心10min，得上清液5890ml，将上清液分成6份，分别为190ml、380ml、760ml、1140ml、1520ml、1900ml，将6份上清液均浓缩成相对密度分别为0.988，0.991，1.028，1.066,1.094,1.119(常温下测定)。缓慢加入质量浓度为95％的乙醇，快速搅拌，当絮状物充满溶液，再搅拌1min，使得最终乙醇浓度达到70％，4℃静置过夜，收集沉淀，放入75℃烘箱中烘干。结果见表2：
表2浓缩液密度对云芝胞内糖肽的影响
浓缩液密度 提取率％ 总糖％ 肽％
0.988 4.0 62.8 21.6
0.991 5.5 49.6 25.2
1.028 8.3 37.3 27.4
1.066 10.5 33.5 30.1
1.094 11.6 31.2 31.5
1.119 14.2 24.4 33.5
实施例3：称取已干燥并粉碎至过60目筛的云芝菌丝体粉(批号20190819)1000g，加10倍重量纯化水，置于圆底烧瓶于电热套100℃煮沸提取3h，将得到的提取液4000r/min条件下离心5min，得上清液7750ml，将上清液浓缩得浓缩液1800ml，溶液在常温下测定相对密度为1.04。将浓缩液分为9份，每份200ml，缓慢加入95％乙醇，快速搅拌，当絮状物充满溶液，再搅拌1min，使得浓缩液乙醇浓度分别达到20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、80％。置于4℃冰箱中醇沉过夜。浓缩液液4000r/min,离心5min得沉淀，将沉淀置于75℃烘箱烘干。结果见表3
表3醇沉时乙醇浓度对云芝胞内糖肽的影响
乙醇浓度 干重g 提取率％ 总糖含量％ 肽含量％
20％ 0.8 0.8 22.2 38.4
30％ 3.1 3.0 22.1 36.1
40％ 7.5 7.3 30.8 27.2
50％ 7.8 7.6 41 20.5
60％ 9.7 9.5 44.2 26.3
65％ 11.4 11.1 41.1 29.5
70％ 12.4 12.1 38.8 34.6
80％ 15.5 15.1 32.5 38.8
检测发现，乙醇浓度60％时总糖含量最高，乙醇浓度为50％时，游离肽含量最低。
实施例4：称取已干燥并粉碎至过60目筛的云芝菌丝体粉600g，加10倍重量纯化水，置于圆底烧瓶于电热套100℃煮沸提取3h，将得到的提取液4000r/min条件下离心5min，得上清液4430ml，将上清液浓缩得浓缩液1000ml，溶液在常温下测定相对密度为1.03。将浓缩液分为5份，每份200ml，缓慢加入95％乙醇，快速搅拌，当絮状物充满溶液，再搅拌1min，使得浓缩液乙醇浓度达到45％、50％、55％、60％、65％。至于4℃冰箱中醇沉过夜。每份浓缩液4000r/min条件下，离心5min，得沉淀，至于75℃烘箱烘干。结果见表4：
表4醇沉时乙醇浓度对云芝胞内糖肽的影响
乙醇浓度 干重g 提取率％ 总糖含量％ 肽含量％
45％ 7.47 6.8 39.5 24.0
50％ 7.76 7.1 42.8 22.3
55％ 8.91 8.2 44.8 24.7
60％ 10.03 9.2 45.6 25.2
65％ 11.65 10.7 42.3 29.6
检测发现，当乙醇浓度为50％时，云芝总糖含量最高，游离肽含量最低，云芝胞内糖肽产品质量最好。

Claims (6)

1.一种云芝胞内糖肽的提取方法，其特征在于该方法包括云芝菌丝体制备和云芝胞内糖肽的制备步骤，其中，云芝胞内糖肽的制备包括以下步骤:
1）对云芝菌丝体进行干燥，粉碎；
2）煮沸提取2~4h得到提取液，料液重量比为1:5~1:15；
3）将提取液离心，取上清液；
4）将上清液浓缩，浓缩液在常温下测定相对密度在0.99~1.03；
5）加入95%乙醇至乙醇浓度为50%进行醇沉，冷藏过夜；
6）离心，分离取沉淀，干燥。
2.根据权利要求1所述的云芝胞内糖肽的提取方法，其特征在于步骤（1）为对云芝菌丝体进行干燥，粉碎至过20~60目筛。
3.根据权利要求1所述的云芝胞内糖肽的提取方法，其特征在于步骤（3）和（6）所述的离心分别是在转速4000~8000r/min条件下离心5~15min。
4.根据权利要求1所述的云芝胞内糖肽的提取方法，其特征在于步骤（6）所述的干燥条件为75℃温度下烘干，样品过60~80目筛。
5.根据权利要求1所述的云芝胞内糖肽的提取方法，其特征在于步骤（5）中缓慢加入浓度为95%的乙醇，快速搅拌，当絮状物充满溶液，再搅拌1~2min。
6.根据权利要求1所述的云芝胞内糖肽的提取方法，其特征在于云芝菌丝体制备包括以下步骤：
1）斜面活化：取云芝斜面，接种于PDA斜面，25-30℃培养3-7d得到云芝菌丝块；
2）一级种子培养：将云芝菌丝块从PDA斜面接种到云芝种子培养基中，置于25-30℃摇床中，150-220rpm培养4d得到云芝一级种子；
3）二级种子培养：将云芝一级种子按10％(v/v)的接种量接种于发酵罐中，在温度25-
30℃、转速150-220rpm、通气量1v/v·m的条件下培养3-7d；
4）发酵培养：将发酵罐中培养3-7d后的云芝种子液全部接种于发酵罐中，在温度25-
30℃、转速150-220rpm、通气量1v/v·m的条件下培养2-5d；发酵结束后，发酵液采用离心机8000rpm离心5-15min，沉淀，65-75℃真空干燥后粉碎，得到云芝菌丝体。
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