CN115820511B - 一株联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156及其应用，该菌株于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221757；本发明利用常压室温等离子体诱变技术，经过诱变筛选得到一株联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156，将此嗜热链球菌SMR1156接种至发酵培养基中发酵72h，嗜热链球菌SMR1156胞内叶酸含量高达52.6µg/g，谷胱甘肽的含量高达28.2mg/g；本发明的嗜热链球菌SMR1156属于可食用益生菌菌种，具有很好的安全性，可广泛应用于制备复含天然叶酸和谷胱甘肽的食品、发酵制剂、保健品等领域，具有巨大的应用价值和市场开发潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一株联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌及其应用。
背景技术
叶酸是一种由嘌呤、对氨基苯甲酸及多聚谷氨酸尾等3部分组成的水溶性B族维生素，叶酸有着重要的生理功能，叶酸缺乏会影响胎儿及婴幼儿神经系统发育；随着研究深入，发现叶酸还具备抗肿瘤，防治心脑血管疾病及肠道疾病的功能。人体由于缺乏相应的叶酸合成基因而不能合成自身所需叶酸，这些叶酸都只能通过饮食或吸收肠道菌群分解代谢产生叶酸的方式从外界摄入。在中国尤其是农村的妇女中叶酸摄入量远远达不到推荐水平。摄食天然植物组织的饮食补充是机体补充叶酸的传统方式，但植物来源的叶酸易受时间条件和生产成本限制。随着认识的深入，人们开始使用合成叶酸，虽然其吸收利用率高，但大剂量合成叶酸所造成的潜在的副作用还有认知功能障碍和癌症问题。与之相比，天然叶酸尤其是益生菌来源的叶酸有安全性高、吸收效果好、无毒副作用等优势，既能补充叶酸还能提供机体所需的其他营养素，即使机体代谢功能缺陷也不会影响它的生物利用率。乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)因其是国际公认的益生菌，被广泛应用于食品工业和医疗保健业。
还原性谷胱甘肽（GSH）是一种重要的生理活性物质，是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，研究表明具有抗氧化、清除自由基、解酒护肝、增强免疫力、美容防晒、抗辐射、延缓衰老、抗癌等功能。还原性谷胱甘肽还具有广谱的解毒作用，保护我们不受汽车尾气、致癌物、传染病、酒精等有毒物质的侵害。肝脏是人体中还原性谷胱甘肽含量最高最丰富的器官，肝脏的重要功能是解毒作用，当肝脏中还原性谷胱甘肽偏低时，会导致毒性物质代谢下降，无法排出体内有毒物质从而造成肝功能的伤害，适当补充GSH有利于肝脏功能的恢复，还可抑制酒精性脂肪肝的形成，保肝护肝。
针对人们的一系列的疾病，筛选出富含叶酸和谷胱甘肽的益生菌，利用益生菌在产叶酸的同时并获得高产量的谷胱甘肽，这无疑会扩大益生菌的应用范围，具有重要的社会意义和经济价值。
发明内容
为了克服现有技术上的不足，本发明提供了一株联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156，该乳酸安全菌株在产叶酸的同时GSH的产量也能达到较高的水平，达到功能多效叠加的目的，在制备复含天然叶酸和谷胱甘肽的食品、发酵制剂、保健品等领域，具有巨大的应用价值。
第一方面，本申请提供一株联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156（Streptococcus thermophilus SMR1156），采用如下的技术方案：
嗜热链球菌SMR1156（Streptococcus thermophilus SMR1156）于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M20221757，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072。
本发明提供的联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156的形态学及生理化学特征如下：
菌落颜色：乳白色；
需氧方式：兼性厌氧；
适宜生长温度：37℃-40℃；
适宜生长pH：5.5-6.5；
菌落形态：球形或卵圆形；
革兰氏染色：阳性。
第二方面，本申请提供一种嗜热链球菌SMR1156在发酵富集叶酸和谷胱甘肽中的应用，采用如下的技术方案：
嗜热链球菌SMR1156在发酵富集叶酸和谷胱甘肽中的应用。
嗜热链球菌SMR1156经发酵富集叶酸和谷胱甘肽的方法，将嗜热链球菌SMR1156经过活化培养、种子培养、发酵培养，制备成富含有叶酸和谷胱甘肽的菌体。
进一步的，活化培养是采用MRS固体培养基培养进行活化，接种嗜热链球菌SMR1156甘油菌至MRS固体培养基平皿，于37℃静置培养48h，再用5mL无菌生理盐水洗下菌体细胞，制备菌株细胞悬液，此即为活化后的菌株悬液。
种子培养是指将活化的菌株悬液，按5%接种量，转接于MRS液体培养基中，于培养箱中37℃静置培养48h，进一步强化菌株活力。
发酵培养是将培养好的种子培养物按15%接种量接种至发酵罐，在发酵培养起始阶段，通气比为0.05(V/V•m)，罐压为0.01Mpa，搅拌控制为100rpm，温度控制在37℃，初始蔗糖的浓度控制在20g/L，并通过流加质量浓度为50%的蔗糖控制发酵体系中的残糖(以蔗糖计)为0.5-1g/L；pH为5.5-6.5，发酵周期控制在72h，所得菌体发酵液10000rpm条件下离心10min，弃上清液，收集菌体沉淀，用质量浓度为0.9％的无菌生理盐水漂洗菌体2次并低温干燥后得到富含叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156菌粉，测定菌叶酸和谷胱甘肽的含量。
进一步的，发酵培养基配方为：蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉2.5%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温80 0.2%，L-半胱氨酸0.2%，对氨基苯甲酸0.01%，其余为水，pH调至5.5。
第三方面，本申请提供一种嗜热链球菌SMR1156在发酵制备富含叶酸和谷胱甘肽的冻干菌粉、益生菌冲剂中的应用，采用如下的技术方案：
一种嗜热链球菌SMR1156在发酵制备富含叶酸和谷胱甘肽的冻干菌粉、益生菌冲剂中的应用。
第四方面，本申请提供一种冻干菌粉，采用如下的技术方案：
一种冻干菌粉，包括嗜热链球菌SMR1156。
第五方面，本申请提供一种益生菌冲剂，采用如下的技术方案：
一种益生菌冲剂，包括嗜热链球菌SMR1156和/或嗜热链球菌冻干菌粉。
进一步的，益生菌冲剂包括如下按质量百分比计的组份：嗜热链球菌SMR1156 冻干菌粉 65%，脱脂乳粉2.5%、菊粉10%、蔓越莓水果粉10%、黑莓水果粉10%、低聚木糖2.5%。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
1、本发明采用常压室温等离子体诱变技术，首次提供能够高效联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156，该菌株经过分批补料发酵，嗜热链球菌SMR1156胞内叶酸含量高达52.6µg/g，谷胱甘肽的含量高达28.2mg/g，生物利用率高，环境污染小，可实现大规模产业化生产。
2、本发明提供的富含叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156是食品安全乳酸菌，在商业上广泛应用的一种益生菌菌种，在产叶酸的同时并获得高产量的谷胱甘肽，可用于制备复含天然叶酸和谷胱甘肽的食品、发酵制剂、保健品等领域，具有巨大的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中嗜热链球菌CICC 21729常压室温等离子体诱变致死率曲线；
图2为本发明实施例1中嗜热链球菌CICC 21729和初筛优良突变株96孔板发酵结果；
图3为本发明实施例1中嗜热链球菌CICC 21729和优良突变株摇瓶复筛发酵结果；
图4为本发明实施例2中嗜热链球菌SMR1156发酵曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4 ·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，蒸馏水1000mL。
MRS固体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K2HPO4 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL。
嗜热链球菌CICC 21729，购自于中国工业微生物菌种保藏中心。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本实施例中叶酸检测方法，步骤如下：
（1）将取0.1g菌粉加1mL去离子水充分混匀，在3000r/min的转速下离心15分钟，取上清液，通过0.45μm的有机滤膜进行过滤，得到待测样品；
（2）对待测样品进行高效液相色谱分析，对照叶酸纯品的高效液相色谱标准曲线，计算叶酸含量；
HPLC色谱条件：固定相：CLCODS-C18柱，4.6mm×250mm；流动相：甲醇：水(Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，pH 7.6)＝10：90；流速：1.5mL/min；柱温：25℃；检测波长：280nm；进样量：20μL。
谷胱甘肽检测方法参考专利CN202110432824.6进行检测，步骤如下：
（1）用十八烷基硅烷健合硅胶为填充剂；以磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠6.8g与庚烷磺酸钠2.2g，加水1000ml使溶解，用磷酸调节pH值只3.0）-甲醇（96:4）为流动相，检测波长为210nm，理论板数按谷胱甘肽峰计算不低于2000。
（2）将取0.1g冻干菌粉加入10mL去离子水混匀后，8000r/min离心10min得到上层清液， 取上清液经0.45μm膜过滤，作为供试品溶液（临用新制），精密量取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另精密称取谷胱甘肽对照品适量，加流动相溶解并定量稀释制成毎1ml中含0.2mg的溶液，作为对照品溶液（临用新制），同法测定，按外标法以峰面积计算即得。
实施例1：嗜热链球菌SMR1156的常温常压等离子体诱变选育
1、出发菌株活化培养及菌悬液制备
取出发菌嗜热链球菌CICC 21729的甘油菌100µL接种至5mL MRS液体培养基 37℃静置培养24h，于10000rpm 离心5min，弃上清液收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两遍，并重悬浮，制成分散均匀的菌悬液，调整细菌的终浓度为100CFU·mL-1。
2、常温常压等离子体诱变致死率曲线及最佳参数
取20μL的步骤1制备的菌悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，设置电源功率60W，照射距离3mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，处理菌物载片，照射时间为0(对照)、10s、20s、30s、40s、50s、55s、60s、65s、70s、80s、90s、100s。处理后将载片转移到1.5mL的EP管中，震荡洗脱形成新的菌悬液，涂布MRS固体培养基平板后置于37℃培养箱内培养，培养48h，观察菌株生长情况，统计菌落数，绘制致死率曲线（如图1所示），选择致死率为80%的处理时间。
嗜热链球菌SMR1156诱变的具体处理方式为：将20μL步骤1制备的菌悬液涂布在金属载体上，置于诱变系统托盘上，设置电源功率60W，照射距离3mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，处理菌物载片，照射时间为60s。样品处理完毕后，用无菌镊子将载片放至装有1mL MRS液体培养基的EP管中，在振荡器上再生培养60min，再用生理盐水稀释10倍，形成新的菌悬液。
3、联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌突变株的初筛
取步骤2经过诱变处理后得到菌悬液200µL涂板于MRS固体培养基上，37℃静置培养48h分离单克隆，再分别挑取平板上生长情况较好单克隆到初筛液体培养基的96孔板培养，培养条件35℃，100rpm，培养72h，离心收集菌体，检测细胞内叶酸和谷胱甘肽的含量，筛选叶酸和谷胱甘肽含量高的菌种，共筛选的到三株高产突变株作为初筛菌株，分别命名SMR356、SMR1156、SMR1289，并进行甘油保藏，三株菌株的叶酸和谷胱甘肽产量如图2所示。
其中，初筛液体培养基的配方为：
蔗糖1.5%，蛋白胨2%，酵母粉2%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温800.1%，L-半胱氨酸0.1%，对氨基苯甲酸0.01%，其余为水，pH调至5.5。
4、联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156突变株的复筛
将步骤3初筛获取的三株优良突变株和对照菌（嗜热链球菌CICC 21729）的甘油菌分别按5%接种量，取1mL甘油菌液接种至25mL种子培养基（MRS液体培养基）培养，摇管装液量50%（v/v），培养温度为35℃，静置培养时间48h，将静置培养后的种子培养液按15%接种量取18.75mL种子培养液接种至125mL的发酵培养基培养，250 mL摇瓶装液量125 mL，发酵温度37 ℃，静置发酵72h，然后离心收集上清，检测菌株胞内叶酸和谷胱甘肽含量，筛选出高产嗜热链球菌SMR1156，该菌经72h摇瓶发酵，10000rpm离心10min收集菌体，低温冷冻干燥后，菌株胞内叶酸达到5.87µg/g，与对照菌相比提高29.4倍，谷胱甘肽浓度达到4.23mg/g，与对照菌相比提高35.3倍，如图3所示。
经筛选获得的高产菌株嗜热链球菌SMR1156（Streptococcus thermophilusSMR1156）于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC）；保藏地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072；保藏编号为CCTCC NO：M20221757。
其中，发酵培养基的配方为：蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉2.5%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温80 0.2%，L-半胱氨酸0.2%，对氨基苯甲酸0.01%，其余为水，pH调至5.5。
实施例2：嗜热链球菌SMR1156在发酵制备富含叶酸和谷胱甘肽菌粉中的应用
1、菌种活化
取50µL嗜热链球菌SMR1156甘油菌，接种含MRS固体培养基的18×180mm试管斜面，培养箱中于37℃ 培养48h，再用5mL无菌生理盐水洗下菌体细胞，制备菌株细胞悬液。
2、种子培养
取75ml步骤1得到的活化好的菌株细胞悬液按5%的接种量接到含1.5L MRS液体培养基的5L种子摇瓶，于37℃进行静置培养48h，制备种子培养液。
3、嗜热链球菌SMR1156补料反馈发酵
采用20L全自动发酵罐（装液量为10L）进行嗜热链球菌SMR1156补料反馈发酵，取1.5L步骤2得到的种子培养液按15%的接种量无菌接种于10L发酵培养基中。在发酵培养起始阶段，通气比为0.05(V／V•m)，罐压为0.01Mpa，搅拌控制为100rpm，温度控制在37℃，初始蔗糖的浓度控制在20g/L，并通过流加质量浓度为50%的蔗糖控制发酵体系中的残糖(以蔗糖计)为0.5-1g/L；pH为5.5-6.5，发酵周期控制在72h，所得菌体发酵液10000rpm条件下离心10min，弃上清液，收集菌体沉淀，获得嗜热链球菌SMR1156菌泥，用质量浓度为0.9％的无菌生理盐水漂洗菌体2次并低温干燥后，得到富含叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156菌粉，测定菌体中叶酸和谷胱甘肽的含量，检测结果如下：嗜热链球菌SMR1156经72h补料反馈发酵，嗜热链球菌SMR1156胞内叶酸含量高达52.6µg/g，谷胱甘肽的含量高达28.2mg/g，极具工业化运用价值，见图4。
其中，发酵培养基配方为：蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉2.5%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温80 0.2%，L-半胱氨酸0.2%，对氨基苯甲酸0.01%，其余为水，pH调至5.5。
实施例3、嗜热链球菌SMR1156在制备复合功能益生菌冲剂中的应用
1、冻干菌粉保护剂的制备
每100mL冻干菌粉保护剂中含有脱脂奶粉15%，海藻糖10%，谷氨酸钠5%。
冻干菌粉保护剂的制备方法为：称取脱脂奶粉15g，海藻糖10g，谷氨酸钠5g，溶于水后，容量瓶定容到100mL，装入广口瓶，115℃灭菌10min备用。
2、嗜热链球菌SMR1156冻干菌粉的制备
按实施例2制备的嗜热链球菌SMR1156菌泥10g与冻干菌粉保护剂50g充分混匀后，于-80℃条件下预冻16h，然后进行真空冷冻干燥24h，测得嗜热链球菌SMR1156菌粉中活菌数为5.0×109-10.0×109CFU/g。
3、复合功能嗜热链球菌SMR1156益生菌冲剂的制备
复合功能嗜热链球菌SMR1156益生菌冲剂包括以下百分比的原料组成：嗜热链球菌SMR1156冻干菌粉65%、脱脂乳粉2.5%、菊粉10%、蔓越莓水果粉10%、黑莓水果粉10%、低聚木糖2.5%。
复合功能嗜热链球菌SMR1156益生菌冲剂的制备工艺如下：依次称取植嗜热链球菌SMR1156冻干菌粉650g，脱脂乳粉25g，菊粉100g，蔓越莓水果粉100g，黑莓水果粉100g，低聚木糖25g到无菌混匀机中，50rpm 搅拌混匀30min后，以5g/袋分装，制备复合益生菌冲剂。
本发明提供的富含叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌SMR1156是食品安全乳酸菌，在商业上广泛应用的一种益生菌菌种，在产叶酸的同时并获得高产量的谷胱甘肽，可用于制备复含天然叶酸和谷胱甘肽的食品、发酵制剂、保健品等领域，具有巨大的应用价值。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一株联产叶酸和谷胱甘肽的嗜热链球菌，其特征在于：所述嗜热链球菌为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）SMR1156，于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221757。
2.一种如权利要求1所述的嗜热链球菌SMR1156在发酵富集叶酸和谷胱甘肽中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：将权利要求1所述的嗜热链球菌SMR1156经过活化培养、种子培养、发酵培养，制备成富含叶酸和谷胱甘肽的菌体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养的步骤如下：在发酵培养起始阶段，初始蔗糖的浓度控制在20g/L，并通过流加质量浓度为50%的蔗糖控制发酵体系中的残糖为0.5-1g/L。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：发酵培养的周期为72h 。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基包括以下重量百分比的原料：蔗糖2%，蛋白胨2%，酵母粉2.5%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温80 0.2%，L-半胱氨酸0.2%，对氨基苯甲酸0.01%，其余为水，pH调至5.5。
7.一种如权利要求1所述的嗜热链球菌SMR1156在发酵制备富含叶酸和谷胱甘肽的冻干菌粉或益生菌冲剂中的应用。
8.一种冻干菌粉，其特征在于：包括权利要求1所述的嗜热链球菌SMR1156。
9.一种益生菌冲剂，其特征在于：包括权利要求1所述的嗜热链球菌SMR1156和/或权利要求8所述的冻干菌粉。
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