CN115895974B

CN115895974B - 一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN115895974B
Application number: CN202211662746.XA
Authority: CN
Inventors: 王德星; 王钟浩; 吴伟斌; 陈威威; 严锦华; 陈光富; 陈晓峰; 曾瑜
Original assignee: Minrong Tea Co ltd
Current assignee: Minrong Tea Co ltd
Priority date: 2022-12-23
Filing date: 2022-12-23
Publication date: 2024-02-13
Anticipated expiration: 2042-12-23
Also published as: CN115895974A

Abstract

本发明公开了一株富硒且高产γ‑氨基丁酸的植物乳杆菌MR327及其应用，该菌株于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221756；本发明采用常压室温等离子体诱变技术，经过诱变筛选得到一株高效富硒且高产γ‑氨基丁酸的植物乳杆菌MR327，将此植物乳杆菌MR327接种至含有亚硒酸钠和谷氨酸的发酵培养基中发酵72h，植物乳杆菌MR327胞内有机硒含量高达137µg/g，γ‑氨基丁酸的含量高达96.3mg/g；本发明的植物乳杆菌MR327属于可食用乳酸菌，具有很好的安全性，可广泛应用于功能食品、保健品、药品等领域，具有巨大的应用价值和市场开发潜力。

Description

一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明具体涉及一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

近年来，随着经济发展和人民生活水平的提高，高血压、高血脂、冠心病、动脉硬化等一系列心脑血管疾病疾病对人体健康的影响越来越严重。据统计，每年全球约1750万人死于心脑血管疾病。动脉粥样硬化、高脂血症和体内硒元素的缺失等因素是导致心脑血管疾病的重要原因。因此，通过在食品中补充硒元素、降血脂和降血压的功能营养成分是当前营养保健领域的研宄热点。

益生菌是一类能够对宿主产生有益作用的微生物，与人体的健康密切相关。益生菌一般定植于人体的肠道和生殖系统内，对于维持人体内微生态平衡具有重要作用。已有的研究结果表明，人体微生物群的稳定对于维持人体健康非常重要，衰老、高血压、糖尿病及肠道疾病等都与人体微生物群有关。乳酸益生菌常添加于食品中以增进人体健康，其中植物乳杆菌是人体肠道菌群之一，肠道黏着率高，定植能力强，并具有高效降胆固醇，调节肠道菌群、提高机体免疫力等重要的生理保健功能，也是功能研究较多的乳杆菌，广泛应用于酸奶、奶酪和固体饮料等食品的生产中。

硒是人体必需的微量元素之一，具有多种生物活性功能，与人类的健康密切相关，在维持心血管系统的功能，预防动脉硬化和冠心病的发生，预防和抑制肿瘤、抗衰老等方面具有重要作用。如果机体细胞长期缺硒，那么与硒相关的代谢过程被阻滞后会带来一系列的疾病的发生。现如今利用无机硒化合物制成补充剂，但是其毒副作用和利用率的弊端越来越被大，需要改变补硒方式。有机硒补硒被认为是最安全也是最有效的手段。自上世纪八九十年代起，国内外对生物补硒的关注和研究持续至今，对硒的转化机理的了解越来越深入。因此，通过生物富硒手段强化食品中硒的含量，从而增加人体对硒元素的摄入，是目前功能性食品的热点研究方向。

γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，简称GABA)是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸，科学研究表明GABA具有降血压、防止肥胖、降血氨、活化肝功能等功能，广泛应用于食品、保健品和药品中。目前，合成GABA的方法分有化学法和生物法。化学法存在吡咯烷酮残留、副反应多等问题，不能应用于食品领域。生物法包括植物富集法和微生物法，但是提取成本高无法大规模生产，导致GABA价格昂贵，不利于大规模推广应用。

针对人们一系列的心脑血管疾病，筛选出富含有机硒和GABA的益生菌，开发出价格低廉的复合功能性益生菌应用于功能食品，来防治肥胖和脂代谢异常等一系列疾病，具有重要的社会意义和经济价值。

发明内容

为了克服现有技术上的不足，本发明提供一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌MR327及其应用，该乳酸安全菌株在高效富硒的同时GABA的产量也能达到较高的水平，达到功能多效叠加的目的，在食品、保健品和药品领域具有重要的应用价值。

第一方面，本申请提供了一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌MR327，采用如下的技术方案：

植物乳杆菌MR327（Lactobacillus plantarum MR327）于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO：M20221756，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编：430072。

本发明提供的富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌MR327的形态学及生理化学特征如下：

菌落颜色：乳白色；

需氧方式：兼性厌氧；

适宜生长温度：30℃-35℃；

适宜生长pH：5-6；

菌落形态：杆状；

革兰氏染色：阳性。

第二方面，本申请提供了植物乳杆菌MR327在发酵富集有机硒和γ-氨基丁酸中的应用，采用如下的技术方案：

植物乳杆菌MR327在发酵富集有机硒和γ-氨基丁酸中的应用。

植物乳杆菌MR327经发酵富含有机硒和γ-氨基丁酸的方法，本发明提供的植物乳杆菌MR327经过活化培养、种子培养、发酵培养，制备成富含有机硒和GABA的菌体。

进一步的，活化培养是采用MRS固体培养基培养进行活化，接种植物乳杆菌MR327甘油菌至MRS固体培养基平皿，于37℃静置培养48h，再用5mL无菌生理盐水洗下菌体细胞，制备菌株细胞悬液，此即为活化后的菌株悬液。

种子培养是指将活化的菌株悬液，按5%接种量，转接于MRS液体培养基中，于培养箱中37℃静置培养48h，进一步强化菌株活力。

发酵培养是将培养好的种子培养物按15%接种量接种至发酵罐，在发酵培养起始阶段，通气比为0.05(V/V·m)，罐压为0.01Mpa，搅拌控制为50rpm，温度控制在35℃，初始葡萄糖的浓度控制在15g/L，并通过流加质量浓度为70%的葡萄糖控制发酵体系中的残糖(以葡萄糖计)为1-3g/L； OD₆₀₀达到20后，通过流加谷氨酸控制发酵体系中的谷氨酸浓度保持在2-4g/L，全过程控制溶解氧(DO)在10-15%，pH为5.0-5.5，发酵周期控制在72h，所得菌体发酵液10000rpm条件下离心10min，弃上清液，收集菌体沉淀，用质量浓度为0.9％的无菌生理盐水漂洗菌体2次并低温干燥后得到富硒产GABA植物乳杆菌MR327，测定菌体中有机硒和GABA的含量。

进一步的，发酵培养基配方为：葡萄糖 1.5%，蛋白胨 2%，酵母粉2.5%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温80 0.2%，谷氨酸 3%，亚硒酸钠 0.01%，其余为水，pH调至5.5。

第三方面，本申请提供了植物乳杆菌MR327在发酵制备富含有机硒和γ-氨基丁酸的植物乳杆菌冻干菌粉、益生菌冲剂中的应用，采用如下的技术方案：

植物乳杆菌MR327在发酵制备富含有机硒和γ-氨基丁酸的植物乳杆菌冻干菌粉、益生菌冲剂中的应用。

第四方面，本申请提供了一种植物乳杆菌冻干菌粉，采用如下的技术方案：

一种植物乳杆菌冻干菌粉，包括植物乳杆菌MR327。

第五方面，本申请提供了一种复合功能益生菌冲剂，采用如下的技术方案：

一种复合功能益生菌冲剂，包括植物乳杆菌MR327和/或植物乳杆菌冻干菌粉。

进一步的，一种复合功能益生菌冲剂，包括如下按质量百分比计的组份：植物乳杆菌MR327冻干菌粉65%，菊粉10%，草莓水果粉10%，蓝莓水果粉10%，低聚木糖2.5%，赤藓糖醇2.5%。

综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：

1、本发明采用常温常压等离子体诱变技术，首次提供能够高效富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌MR327，该菌株经过分批补料发酵，植物乳杆菌MR327胞内有机硒含量高达137µg/g，γ-氨基丁酸的含量高达96.3mg/g，生物利用率高，环境污染小，可实现大规模产业化生产。

2、本发明提供的富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌MR327是食品安全乳酸菌，在商业上广泛应用的一种益生菌菌种，同时兼具富硒和联产GABA的能力，可广泛应用于制备富含有机硒和GABA的复合功能食品、保健品、饮料等，大幅降低制备成本，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中植物乳杆菌CICC 23133诱变致死率曲线；

图2是本发明实施例1中植物乳杆菌CICC 23133和初筛优良突变株96孔板发酵结果；

图3是本发明实施例1中植物乳杆菌CICC 23133和优良突变株摇瓶复筛发酵结果；

图4是本发明实施例2中植物乳杆菌MR327发酵工程曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。

以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

MRS液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K₂HPO₄ 2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄ 4H₂O 0.25g，蒸馏水1000mL。

MRS固体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，K₂HPO₄2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温80 1mL，MgSO₄·7H₂O 0.58g，MnSO₄·4H₂O 0.25g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL。

植物乳杆菌CICC 23133，购自于中国工业微生物菌种保藏中心。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本实施例中，有机硒检测方法参考食品安全国家标准GB 5009.93-2017食品中硒的测定方法进行检测，GABA检测方法参考参照中华人民共和国轻工行业标准QB/T4587-2013γ-氨基丁酸检测方法进行检测。

实施例1：植物乳杆菌MR327的常温常压等离子体诱变选育

1、出发菌株活化培养及菌悬液制备

取出发菌植物乳杆菌CICC 23133的甘油菌100µL接种至5mL MRS液体培养基，37℃静置培养24h，于10000rpm离心5min，弃上清液收集菌体，用含5%（v/v）甘油的生理盐水洗涤菌体两遍，并重悬浮，制成分散均匀的菌悬液，调整细菌的终浓度为100-110CFU·mL^-1。

2、常温常压等离子体诱变致死率曲线及最佳参数

取20μL的步骤1制备的菌悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体，设置电源功率50W，照射距离4mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，处理菌物载片，照射时间为0(对照)、10s、20s、30s、40s、50s、55s、60s、65s、70s、80s、90s、100s。处理后将载片转移到1.5mL的EP管中，震荡洗脱形成新的菌悬液，涂布MRS固体培养基平板后置于37℃培养箱内培养，培养48h，观察菌株生长情况，统计菌落数，绘制致死率曲线（如图1所示），选择致死率为75%的处理时间。

植物乳杆菌CICC 23133诱变的具体处理方式为：将20μL步骤1制备的菌悬液涂布在金属载体上，置于诱变系统托盘上，设置电源功率50W，照射距离4mm，等离子体的温度26℃，气流量10L/min，处理菌物载片，照射时间为55s。样品处理完毕后，用无菌镊子将载片放至装有1mL MRS液体培养基的EP管中，在振荡器上再生培养60min，再用含5%（v/v）甘油的生理盐水稀释10倍，形成新的菌悬液。

3、富硒和高产GABA植物乳杆菌突变株的初筛

取步骤2经过诱变处理后得到的菌悬液200µL分别涂板于含有100µg/mL、300µg/mL、500µg/mL、1000µg/mL亚硒酸钠的MRS固体培养基，37℃静置培养48h分离单克隆，再分别挑取平板上生长情况较好单克隆到含有1mL亚硒酸钠（浓度为1000 µg/mL）的初筛液体培养基的96孔板培养，培养条件35℃，100rpm，培养72h，离心收集菌体，检测细胞内有机硒和GABA含量，筛选有机硒和GABA含量高的菌种，共筛选得到三株高产突变株作为初筛菌株，分别命名MR203、MR327、MR1028，并进行甘油保藏，三株菌株的有机硒和GABA产量如图2所示。

其中，初筛液体培养基的配方为：

蔗糖1.5%，蛋白胨2%，酵母粉2%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温800.1%，L-半胱氨酸0.1%，对氨基苯甲酸0.01%，其余为水，pH调至5.5。

4、富硒和高产GABA的植物乳杆菌突变株的复筛

将步骤3初筛获取的三株优良突变株和对照菌（植物乳杆菌CICC 23133）的甘油菌分别按5%接种量，取1mL甘油菌液接种至25mL种子培养基（MRS液体培养基）培养，摇管装液量50%（v/v），培养温度为35℃，静置培养时间48h，将静置后的种子培养液按15%接种量取18.75mL种子培养液接种至125mL的发酵培养基培养，250mL摇瓶装液量125mL，发酵温度37℃，静置发酵72h，然后离心收集上清，检测菌株胞内有机硒和GABA含量，筛选出高产菌株植物乳杆菌MR327，该菌经72h摇瓶发酵，10000rpm离心10min收集菌体，低温冷冻干燥后，菌株胞内有机硒达到21.3µg/g，与对照菌相比提高2130倍，GABA浓度达到17.8mg/g，与对照菌相比提高10.1倍，如图3所示。

经筛选获得的高产菌株植物乳杆菌MR327（Lactobacillus plantarum MR327）于2022年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC），保藏地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M20221756。

其中，发酵培养基配方为：葡萄糖1.5%，蛋白胨2%，酵母粉2.5%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温80 0.2%，谷氨酸 3%，亚硒酸钠 0.01%，其余为水，pH调至5.5。

实施例2：植物乳杆菌MR327在发酵富集有机硒和γ-氨基丁酸中的应用。

1、菌种活化

取50µL植物乳杆菌MR327甘油菌，接种含MRS固体培养基的18×180mm试管斜面，培养箱中于37℃ 培养48h，再用5mL无菌生理盐水洗下菌体细胞，制备菌株细胞悬液。

2、种子培养

取75ml步骤1得到的活化好的菌株细胞悬液按5%的接种量接到含1.5L MRS液体培养基的5L种子摇瓶，于37℃进行静置培养48h，制备种子培养液。

3、植物乳杆菌MR327补料反馈发酵

采用20L 全自动发酵罐（装液量为10L）进行植物乳杆菌MR327补料反馈发酵，取1.5L步骤2得到的种子培养液按15%的接种量无菌接种于10L发酵培养基中。在发酵培养起始阶段，通气比为0.05(V／V•m)，罐压为0.01Mpa，搅拌控制为50rpm，温度控制在35℃，初始葡萄糖的浓度控制在15g/L，并通过流加质量浓度为70%的葡萄糖控制发酵体系中的残糖(以葡萄糖计)为1-3g/L；当OD₆₀₀达到20后，通过流加谷氨酸控制发酵体系中的谷氨酸浓度保持在2-4g/L，全过程控制溶解氧(DO)在10-15%，pH为5.0-5.5，发酵周期控制在72h，所得菌体发酵液10000rpm条件下离心10min，弃上清液，收集菌体沉淀，用质量浓度为0.9%的无菌生理盐水漂洗菌体2次并低温干燥后得到富硒产GABA植物乳杆菌MR327，测定菌体中有机硒和GABA的含量，检测结果如下：植物乳杆菌MR327经72h补料反馈发酵，植物乳杆菌MR327胞内有机硒含量高达137µg/g，γ-氨基丁酸的含量高达96.3mg/g，极具工业化运用价值，见图4。

实施例3：植物乳杆菌MR327在制备复合功能益生菌冲剂中的应用。

1、冻干菌粉保护剂的制备

每100mL冻干菌粉保护剂中含有脱脂奶粉20%，海藻糖5%，谷氨酸钠5%。

冻干菌粉保护剂的制备方法为：称取脱脂奶粉20g，海藻糖5g，谷氨酸钠5g，溶于水后，容量瓶定容到100mL，装入广口瓶，115℃灭菌10min备用。

2、植物乳杆菌MR327冻干菌粉的制备

将实施例1制备的植物乳杆菌MR327菌泥10g与冻干菌粉保护剂50g充分混匀后，于-80℃条件下预冻16h，然后进行真空冷冻干燥24h，测得植物乳杆菌MR327菌粉中活菌数为5.0×10⁹-10.0×10⁹CFU/g。

3、复合功能植物乳杆菌MR327益生菌冲剂的制备

复合功能植物乳杆菌MR327益生菌冲剂包括以下百分比的原料组成：植物乳杆菌MR327冻干菌粉65%，菊粉10%，草莓水果粉10%，蓝莓水果粉10%，低聚木糖2.5%，赤藓糖醇2.5%。

复合功能植物乳杆菌MR327益生菌冲剂的制备工艺如下：依次称取植物乳杆菌MR327冻干菌粉650g，菊粉100g，草莓水果粉100g，蓝莓水果粉100g，低聚木糖25g，赤藓糖醇25g到无菌混匀机中，50rpm 搅拌混匀30min后，以5g/袋分装，制备复合功能益生菌冲剂。

本发明提供的富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌MR327是食品安全乳酸菌，在商业上广泛应用的一种益生菌菌种，同时兼具富硒和联产GABA的能力，可广泛应用于制备富含有机硒和GABA的复合功能食品、保健品、饮料等，大幅降低制备成本，具有广阔的应用前景。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一株富硒且高产γ-氨基丁酸的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）MR327，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221756，保藏日期为2022年11月10日。

2.一种如权利要求1所述的植物乳杆菌MR327在发酵富集有机硒和γ-氨基丁酸中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤如下：将权利要求1所述植物乳杆菌MR327经过活化培养、种子培养、发酵培养，制备成富含有机硒和γ-氨基丁酸的菌体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵培养的步骤如下：在发酵培养起始阶段，初始葡萄糖的浓度控制在15g/L，并通过流加质量浓度为70%的葡萄糖控制发酵体系中的残糖为1-3g/L；当OD₆₀₀达到20后，通过流加谷氨酸控制发酵体系中的谷氨酸浓度在2-4g/L。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：发酵培养全过程控制溶解氧为10-15%，发酵周期为72h。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基包括以下重量百分比的原料：葡萄糖1.5%，蛋白胨2%，酵母粉2.5%，七水硫酸镁0.03%，一水硫酸锰0.01%，吐温80 0.2%，谷氨酸3%，亚硒酸钠0.01%，其余为水，pH调至5.5。

7.一种如权利要求1所述的植物乳杆菌MR327在发酵制备富含有机硒和γ-氨基丁酸的冻干菌粉或益生菌冲剂中的应用。

8.一种冻干菌粉，其特征在于，包括权利要求1所述的植物乳杆菌MR327。

9.一种益生菌冲剂，其特征在于：包括权利要求1所述的植物乳杆菌MR327和/或权利要求8所述的冻干菌粉。