CN113061558B - 一种含有凝结芽孢杆菌halo178的复合益生菌和饲料添加剂 - Google Patents

一种含有凝结芽孢杆菌halo178的复合益生菌和饲料添加剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌，包括以下组分：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉、丁酸梭菌粉、枯草芽孢杆菌粉、地衣芽孢杆菌粉；所述凝结芽孢杆菌HALO178其于2021年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21689。本发明提供了包括所述复合益生菌的饲料添加剂。本发明复合益生菌克服了传统乳酸菌难以在常温下贮存的缺点，为下游饲料、动保企业提供了一种厌氧、兼性、好氧益生菌互相结合、互相协同、互相促进的益生菌制剂。本发明提供的包含HALO178凝结芽孢杆菌的饲料添加剂，利用了往常丢弃的罗汉果渣，抑制动物肠道致病菌，降低肠道疾病的发生率，提高农场经济效益，从而起到了替代抗生素的作用。

Description

一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌和饲料添加剂
技术领域
本发明涉及微生物学和益生菌领域，具体涉及一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌和饲料添加剂。
背景技术
随着我国经济的不断发展，人们对饮食健康和食品安全的需求不断提高，以乳酸菌为主的益生菌已经为消费者所熟知。益生菌是一类能够改善有机体胃肠道生态平衡，能提高免疫力和新陈代谢，提高对营养物质的吸收和利用，是一种有益食品或饲料添加剂。目前市场上的活菌型益生菌基本都需要在全冷链条件下运输、贮存和上架，保质期一般不超过1个月，常温食品中基本上不含有活菌。而当今食品行业对益生菌的需求越来越大，对益生菌可适用的范围提出更多的要求，尤其是可以适应烘焙、压片、造粒、喷雾、开水冲饮等应用场景的益生菌已经成为市场迫切需求。另外，即使是冷链食品中的普通乳酸菌在进入消化道后，经过胃中胃酸、胆汁中胆汁酸钠环境因素的影响，存活率往往极低，最终对肠道健康的帮助十分有限。其次，在畜牧养殖业中，由于抗生素过量使用带来的负面影响，人们逐渐寻找含有益生菌的饲料来替代常规的促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)。在食品和饲料中添加益生菌及其制剂是目前大健康产业发展的趋势，利用益生菌来替代抗生素是一个走可持续发展的优质解决方案，对食品、农牧行业有着重大的意义。
以往在农牧生产过程中，为了提高生产效率，养殖和饲料从业单位普遍在动物饲料中添加促生长类药物，例如抗生素，但在抗生素的滥用过程中，不可避免会出现耐药性强的超级细菌，直接对人类的生物安全构成威胁。根据中国农业农村部公告第194号，2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料。在饲料全面禁药后，寻找稳定、高效的替代方案成了农牧行业的共同目标。复合益生菌是饲料添加剂中代替抗生素的很好的代替品。科学合理的复合益生菌制剂配伍可以更好的发挥各益生菌的特点，达到相互补充、协同促进的效果，在饲料中添加后可替代抗生素，起到降低料肉比、缩短养殖周期、降低肠道疾病发病率、改善棚舍异味等作用。人们已经对复合益生菌制剂展开相关研究，例如：
1)申请号202010371335.X，公开了一种耐胆盐耐胃酸益生菌制剂及其制备方法和应用，所述益生菌制剂包括四层结构，分别为核心多孔糊精结构、油包水结构、耐胆盐结构和耐胃酸结构，制备时，通过先制备益生菌乳化液，再制备益生菌油包水反胶束乳液，接着制备耐胆盐益生菌胶束乳液，最后制备耐胃酸益生菌胶束乳液。
2)申请号202010651991.5，公开了一种复合型益生菌制剂及其制备方法和应用。所述复合型益生菌制剂包括益生菌粉、鱿鱼膏、蚯蚓提取物、二甲基-β-丙酸噻亭、大豆寡糖、螺旋藻粉。
3)申请号202011255449.4，提供了一种仔猪腹泻益生菌制剂，其按重量份计，由如下组分组成：枯草芽孢杆菌的冻干菌粉10～15份、地衣芽孢杆菌的冻干菌粉4～6份，艾叶发酵冻干粉1～3份；所述枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.9660，所述枯草芽孢杆菌的冻干菌粉中，活菌含量≥40亿个/g；所述地衣芽孢杆菌的保藏号为CGMCC No.5686，所述地衣芽孢杆菌的冻干菌粉中，活菌含量≥50亿个/g。该专利提供了制备上述制剂的方法和在制备防止仔猪腹泻方面药物的应用，能显著的降低仔猪腹泻的发生率。
4)申请号202011595609.X，提供了一种具有增强免疫功能的多效益生菌制剂及其应用。所述多效益生菌制剂包括：药用植物提取物和益生菌剂；所述药用植物提取物包括如下重量份数的组分：姜黄提取物10～20份、朝鲜蓟提取物10～15份、铁皮石斛提取物5～10份和黄芪提取物5～10份；所述益生菌剂包括如下组分：保加利亚乳杆菌剂、动物双歧杆菌剂、瑞士乳杆菌剂、鼠李糖乳杆菌剂、副干酪乳杆菌剂、干酪乳杆菌剂和罗伊氏乳杆菌剂。所述多效益生菌制剂可以有效改善益生菌定植抗性、调节肠道微生态环境、增强机体免疫力，具有减少胃肠道等消化系统疾病、抗皮炎、抗肿瘤、降血脂、降胆固醇的作用。
但是，优异的复合益生菌制剂在益生菌的需氧类型、产酶特性，配方中的生长因子、效果保持剂上的选择尤为重要，选择科学合理的复合益生菌制剂配伍可以更好的发挥各益生菌的特点，达到相互补充、协同促进的效果，不仅可以起到降低料肉比、缩短养殖周期、降低肠道疾病发病率、改善棚舍异味等作用，还能降低养殖场同类产品的使用成本。
凝结芽孢杆菌是目前发现的唯一一种孢子型乳酸菌，具有优异的生物学特征，已经广泛应用到养殖业。其具有良好抗逆性，通过产生的乳酸来抑制肠道病原菌的繁殖，进而维持肠道的健康。人们已经对凝结芽孢杆菌展开相关研究，例如：
1)申请号CN202010361948.5，其公开了一株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)JA845及其应用，其中该凝结芽孢杆菌JA845具有多种功效，特别是调控代谢综合征大鼠的体质、改善机体的胰岛素抵抗、降低血浆中血脂含量、缓解肝损伤以及降低脂质代谢蛋白SREBP的含量等，从而能够预防和治疗代谢综合征。
2)申请号CN201310093459.6，其公开了凝结芽孢杆菌HM-09，保藏号为CGMCCNo.6729，其中所述菌株能够调节微生态平衡、增强免疫功能，从而促进育肥猪对饲料的消化吸收。
3)申请号CN201510649951.6，其公开了一种凝结芽孢杆菌菌株FM603，其保藏号为CGMCC NO.10221。该菌株能够产生细菌素类抗菌物质，对多种革兰氏阳性病原菌具有抗菌活性。所述凝结芽孢杆菌菌株的发酵物能够提高仔猪采食量和日增重、肉鸡日增重和血清溶菌酶含量，降低料肉比和死亡率。
4)申请号CN201611025225.8，其公开了一株拮抗链球菌的凝结芽孢杆菌及其应用，其中该菌株可制成菌粉添加到动物饲料中，且可有效防治链球菌病。该菌株的发酵液可以用作养殖环境改良剂来降低养殖水体中链球菌的数量，同时在低氧条件下还可清除水体中的亚硝酸盐。
5)申请号CN201911113013.9，其公开了一种凝结芽孢杆菌L-H7及其应用，其中该菌株L-H7能够耐受高浓度的氯化钠、亚硝酸钠，有效抑制食源性致病菌的生长，且蛋白酶、酯酶、糖苷酶等活性较强。在消化环境中的凝结芽孢杆菌L-H7的存活率更高，从而有效发挥益生功效。
然而，上述专利申请并没有很好地解决凝结芽孢杆菌菌株在食品和饲料添加剂领域实际复杂环境下的有效存活问题。在实际生产应用中，生产加工环境带来的高温、人和动物消化道中胃酸的低pH和胆汁中的胆酸盐均会极大影响凝结芽孢杆菌的有效存活，因此在实际应用中难以达到实验室中取得的效果。因此，如何筛选得到一株具有强抗逆性能的凝结芽孢杆菌并实现其高密度发酵，对于解决凝结芽孢杆菌在复杂环境下的有效存活问题显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种含有含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌，所述凝结芽孢杆菌HALO178是一株具有强抗逆和高产乳酸性能的芽孢乳酸菌，相比传统需要全冷链运输和贮存的乳酸菌具有显著优势。本发明还针对性了选择了好氧菌、兼性厌氧菌、严格厌氧菌相结合的复合益生菌配伍，同时添加微量元素和氨基酸作为生长因子，选择罗汉果粉作为效果保持剂和风味剂，达到了适口性好，各组分之间相互补充、协同促进的效果，起到了降低料肉比、缩短养殖周期、降低肠道疾病发病率、改善棚舍异味等作用，可以替代养殖场日粮中添加的抗生素、酶制剂，实现无抗养殖的同时降低养殖成本。
本发明通过反复施加极限选择性压力，进行培养筛选并验证，得到一种新型的具有强耐高温、低pH、胆盐和高产乳酸性能的强抗逆性凝结芽孢杆菌新菌株，命名为HALO178，经过胃酸和胆汁的影响后仍然能够大量存活并进入肠道，解决传统芽孢杆菌不能长期储存、不能在食品和饲料生产过程中的高温环境中使用等问题，以及解决了进入动物肠道后，性能受到胃肠道内额酸性和胆盐环境下减弱益生菌功效的问题。本发明还利用丁酸梭菌剂、枯草芽孢杆菌剂、地衣芽孢杆菌剂，以及罗汉果提取物一起复配得到的益生菌，能够有效抑制肠道病原菌的繁殖，作为动物饲料添加剂可以替代抗生素的使用，提高动物(比如仔猪)的机体生产能力。
本发明的技术方案通过以下技术方案得以实现：
一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌，包括以下组分：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉、丁酸梭菌粉、枯草芽孢杆菌粉、地衣芽孢杆菌粉；所述凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HALO178，其于2021年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏编号为CGMCC No.21689，保藏日期2021年1月20日。
进一步地，所述凝结芽孢杆菌HALO178的16SrDNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
进一步地，所述凝结芽孢杆菌HALO178菌粉，每克所述微生物菌剂的芽胞含量1.2×1011-2.5×1011CFU，且芽孢率为至少98％。
进一步地，所述复合益生菌，包括以下质量份的组分：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1～5份、枯草芽孢杆菌菌粉1～5份、地衣芽孢杆菌菌粉1～5份、丁酸梭菌菌粉5～10份。优选地，所述复合益生菌，包括以下质量份的组分：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1～2份、枯草芽孢杆菌菌粉1～3份、地衣芽孢杆菌菌粉2～4份、丁酸梭菌菌粉5～10份。
本发明所用到凝结芽孢杆菌HALO178菌粉是通过包括以下步骤的制备方法得到：凝结芽孢杆菌HALO178菌株复壮、种子培养、高密度液态发酵，待芽孢率大于98％后，结束发酵，得到发酵液；发酵液依次进行离心、喷雾干燥、混匀包装后，得凝结芽孢杆菌HALO178菌粉。
所述菌粉在得到菌株的情况下，关于复壮、种子培养、发酵等工艺条件为本领域所熟知。在本发明一个具体实施方式中，所述菌株复壮的方法如下：在MRS培养基中加入0.5-0.6％的胆汁酸钠，并将pH调至3.0-4.5，取已保藏的菌种进行平板涂布，于60℃下恒温培养24～32h后挑取单菌落培养即成。所述种子培养分为一级和二级种子培养，其工艺如下：所用培养基按重量体积比计，包括：酵母粉5.0～10.0g/L，胰蛋白胨10.0～15.0g/L，葡萄糖5.0～10.0g/L，牛肉浸膏10.0～20.0g/L，罗汉果粉1.0～5.0g/L，氯化钠2.5g/L；所用设备、器材没有特别限定，一级种子使用250～2000mL锥形瓶、恒温摇床，二级种子使用50～500L发酵罐；发酵温度45℃，转速50～100rpm，时间20～30h，至发酵液OD600＞10.0即成。所述高密度液态发酵，其工艺如下：所用培养基按重量体积比计，包括：罗汉果粉5.0～15.0g/L，多聚果糖5.0～15.0g/L，酵母粉1.0～10.0g/L，胰蛋白胨5.0～15.0g/L，牛肉浸膏1.0～10.0g/L，无水氯化钙0.1～0.2g/L，氯化钠2.0～5.0g/L，磷酸氢二钾1.0～2.0g/L，一水合硫酸锰0～0.1g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2～0.6g/L；发酵温度45～55℃，转速50～100rpm，pH控制范围4.0～5.5，发酵周期24～32h，待发酵液芽孢率＞98％，结束发酵。所述离心，为使用碟式离心机分离上清，转速8000～10000rpm；或使用管式离心，离心后使用软化水重悬菌体；所述喷雾干燥，其进风温度设置为180～220℃，出风温度设置为60～90℃。
本发明所述凝结芽孢杆菌HALO178菌株是通过包括以下步骤的制备方法得到：
(S1)凝结芽孢杆菌纯菌株分离：泡菜研磨的浆料经过反复稀释、加热水浴，碳酸钙平板培养，挑取产生溶钙透明圈的单菌落，直到平板划线培养得到的菌落形态一致进行进一步筛选；
(S2)强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株的筛选：进行极限选择性压力筛选，在不利于凝结芽孢杆菌生存的极限选择性压力条件下，在筛选组选择存活率的各单菌落；
(S3)：重复步骤(S2)的筛选，直倒在极限选择性压力条件下培养均未能提高存活率百分比，挑取在筛选组存活的各单菌落进行菌种保藏并编号；
(S4)：对(S3)的菌种进行摇瓶培养，选取产乳酸能力最强的菌株进行菌种保藏并编号；
(S5)：将步骤(S4)所得强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株进行16S rDNA序列同源性分析验证后，进行菌种保藏。该菌种并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.21689。
进一步地，所述凝结芽孢杆菌HALO178的制备方法包括以下步骤：
(S1)凝结芽孢杆菌纯菌株分离：取泡菜研磨匀浆，无菌生理盐水稀释，70-90℃水浴5-20min，碳酸钙平板培养24～36h，挑取产生溶钙透明圈的单菌落，所得单菌落反复进行步骤(S1)的无菌生理盐水稀释、水浴、碳酸钙平板培养、挑取单菌落，直到平板划线培养得到的菌落形态一致后，得到纯菌株使用MRS固体培养基进行斜面保藏；
(S2)强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株的筛选：将步骤(S1)所得凝结芽孢杆菌菌株进行极限选择性压力筛选，每个菌株设立筛选组和对照组，筛选组条件相比于对照组不利于凝结芽孢杆菌生存的极限选择性压力条件下，在筛选组选择存活率的各单菌落进行菌种保藏并编号，记录为第1代凝结芽孢杆菌；
(S3)重复步骤(S2)的筛选，记录为第2代强抗逆性菌株。并以此类推，每进行一次筛选，则传代数加1；直到在极限选择性压力条件下培养均未能提高存活率百分比，挑取在筛选组存活的各单菌落进行菌种保藏并编号；
(S4)将步骤(S3)所得所有强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株在MRS液体培养基中进行摇瓶培养，测定各菌株的产乳酸能力，选取产乳酸能力最强的菌株进行菌种保藏并编号；
(S5)将步骤(S4)所得强抗逆性凝结芽孢杆菌菌株进行16S rDNA序列同源性分析验证后，进行菌种保藏。该菌种并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.21689。
进一步地，步骤(S1)中所述泡菜没有特别限定，包扩但不限于泡椒、老坛酸菜、酸笋、辣白菜中的一种；优选为泡椒，于湖南邵阳地区采样，其点坛用的酸水经过煮沸后冷却的过程，入坛腌制时间为4～6天。
进一步地，步骤(S1)中，所述碳酸钙平板的配制方法如下：将蛋白胨10-15g/L，酵母粉5-10g/L，葡萄糖5-10g/L，氯化钠5-10g/L，碳酸钙2.5-5g/L，以水为溶剂充分溶解并定容至所需体积后，pH调至6.5-7，最后加入琼脂粉20-30g/L，于120-130℃下高压蒸汽灭菌15-30min后取出，冷却至50～60℃，在超净工作台内每个无菌培养皿中倒入20～30ml培养基，待彻底冷却凝固后即成。如无特殊说明，上述操作适用于本发明所有固体培养基的配制。
所述菌落形态如下：培养至24～26h时，菌落呈乳白色，边缘整齐无褶皱，光滑微凸起，使用放大镜观察表面呈磨砂状，菌落大小在1.5～3mm之间。
所述MRS固体培养基的配制方法如下：蛋白胨10-20g/L，酵母粉5-10g/L，牛肉膏10-15g/L，葡萄糖10-15g/L，氯化钠5-10g/L，磷酸氢二钾0.5-1g/L，柠檬酸二胺2-4g/L，吐温80 1-2g/L，以水为溶剂充分溶解并定容至所需体积后，pH调至6.5-7，最后加入琼脂粉20-30g/L。MRS液体培养基与MRS固体培养基唯一的区别在于MRS液体培养基不加入琼脂粉。
纯菌株使用MRS固体培养基进行斜面保藏之前，进行生理生化分析后，选取符合凝结芽孢杆菌特性的菌株。所述生理生化分析，包括但不限于革兰氏染色镜检、过氧化氢酶试验、产气试验、产硫化氢试验中的一种或几种。
所述菌种保藏方法如下：将在MRS液体培养基中培养至12～24h的发酵液与50％～75％含量的无菌甘油充分混合后，分装至1～2ml菌种保藏管中，于-80℃下保藏。如无特殊说明，上述操作适用于本技术方案中所有菌种保藏。
进一步地，步骤(S2)中筛选组的极限选择性压力筛选的条件是温度为50～60℃、pH为3.0～5.0、胆汁酸钠浓度为0.3％～0.6％；对照组温度为40～45℃、pH为6.5～7.0、胆汁酸钠浓度为0.03～0.1％；优选地，所述筛选组温度为52～60℃、pH为3.5～5.0、胆汁酸钠浓度为0.4％～0.6％；最优选地，随着筛选传代数的增加，不断增加后一代筛选时的温度，降低pH，提高胆汁酸钠浓度，使最后筛选组温度为60℃、pH为3.0、胆汁酸钠浓度为0.6％。
进一步地，步骤(S3)中是在连续10次筛选中淘汰未能提高存活率3％以上的凝结芽孢杆菌。在本发明中，连续进行178代的培养后，发现存活率不再提高，因此将本发明的具有强抗逆性的凝结芽孢杆菌新菌株命名为HALO178。
进一步地，步骤(S4)中所述产乳酸能力的测定方法为，将各菌株于MRS液体培养基中培养至10～12h后每间隔15-30min测定发酵液pH值变化，连续pH测定值变化小于0.01时，用对羟基联苯比色法测定乳酸含量。
进一步地，步骤(S5)中中所述16S rDNA序列的PCR扩增引物为，27F：AGAGTTTGATCCTGGC TCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。
本发明凝结芽孢杆菌菌株HALO178经过高密度液态发酵后，其发酵密度达到50×108CFU/mL，制得的菌粉芽孢率高达98％～99％，芽孢含量高达2.0×1011～2.4×1011CFU/g，80℃水浴处理30min后存活率高达95％～98％，200℃干热处理2min后存活率高达85％～90％，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理2h后存活率高达70％～75％，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率高达88％～93％，挑取平板单菌落进行摇瓶培养20h后其产生的乳酸含量高达5.0～5.5g/L。和其他芽孢杆菌复配后，作为饲料添加剂，能够明显改善动物肠胃内的生态环境，协调菌群平衡，促进动物吸收营养物质，抑制不利影响的菌，保持健康。
本发明还提供了包括上述复合益生菌的饲料添加剂，其特征在于，包括以下质量份的组分：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1～5份、枯草芽孢杆菌菌粉1～5份、地衣芽孢杆菌菌粉1～5份、丁酸梭菌菌粉5～10份、1～10份生长因子、50-150份罗汉果粉。
进一步地，所述饲料添加剂包括以下质量份的组分：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1～2份、枯草芽孢杆菌菌粉1～3份、地衣芽孢杆菌菌粉2～4份、丁酸梭菌菌粉5～10份、5～9份生长因子、66-90份罗汉果粉。
所述生长因子包括动物所需要的微量元素、氨基酸、维生素中的至少一种；优选地，生长因子包括微量元素和氨基酸，微量元素和氨基酸的质量比是1-3:1-3。
所述微量元素的来源选自将硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸铜，氯化钴，硫酸锰中的至少一种；所述氨基酸选自L-半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸中至少一种；所述维生素选自维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B5、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K中的至少一种。
所述罗汉果粉是经过提取后的罗汉果渣，经过胶体磨乳化、硫化床干燥、超微粉碎得到罗汉果渣的粉末。所述罗汉果渣中，膳食纤维含量≥50wt％，含水量≤15wt％。
罗汉果渣是罗汉果产业中提取罗汉果甜苷的剩余物质，富含大量的膳食纤维，但一般作为废弃物丢掉，一方面造成资源的浪费，另一方面也提高了处理的成本。本发明的饲料添加剂中凝结芽孢杆菌菌株HALO178和其他芽孢杆菌以及罗汉果渣复配，发挥协同作用，能够有效抑制肠道病原菌的繁殖，提高动物产能，减少饲料中抗生素的使用。
本发明方法的有益效果如下：
(1)本发明提供含有凝结芽孢杆菌HALO178益生菌制剂的配方，克服了传统乳酸菌难以在常温下贮存的缺点，为下游饲料、动保企业提供了一种厌氧、兼性、好氧益生菌互相结合、互相协同、互相促进的益生菌制剂，加速了凝结芽孢杆菌HALO178的应用，减小了企业的研发成本，节约了社会资源；同时，添加该益生菌制剂时，可显著减少饲料中抗生素等药品的使用。相比传统需要全冷链运输和贮存的乳酸菌具有显著优势；使得本品可以在饲料造粒、饮水供给、发酵饲料、扩培活化等多种养殖应用场景中使用，拓展了含乳酸菌的微生物菌剂在养殖行业中的应用，提高保质期的同时降低了复合微生物菌剂行业的管理成本。
(2)本发明使用的凝结芽孢杆菌新菌株HALO178，其菌粉产品80℃水浴处理30min后存活率高达95％～98％，200℃干热处理2min后存活率高达85％～90％，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理2h后存活率高达70％～75％，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率高达88％～93％。
(3)本发明还针对性了选择了好氧菌、兼性厌氧菌、严格厌氧菌相结合的复合益生菌配伍，三类菌株在肠道中互相协同，为各自的生长繁殖提供了良好微生态的环境，菌株各自分泌丰富且互相补充的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶等酶系，使得动物能够更好的消化吸收食物，从而起到了替代酶制剂的作用；同时益生菌群的竞争作用起到了抑制肠道致病菌的效果，降低肠道疾病的发生率，从而起到了替代抗生素的作用；营养物质在肠道内的高效分解和吸收，使得动物粪便中的氨类物质减少，从而起到了改善棚舍异味的作用。
(4)本发明添加了微量元素和氨基酸作为生长因子，为益生菌的迅速生长繁殖提供了协助和保障；同时，本发明选择罗汉果粉作为效果保持剂，罗汉果粉中膳食纤维含量高，为益生菌定植提供了附着条件，膳食纤维还可以提升动物的肠动力，预防动物便秘；同时罗汉果粉中的罗汉果甜苷具有高甜度，对于改善饲料风味，提高饲料诱食性具有有益效果。
具体实施方式
下面结合具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法，所用的原料或设备均通过常规商业途径获得。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明所用到的凝结芽孢杆菌HALO178的制备，可以参考申请人在前的专利CN202110348228.X中记载的方法。
本发明所用丁酸梭菌菌粉、枯草芽孢杆菌菌粉、地衣芽孢杆菌杆菌菌粉采购自江苏远山生物技术有限公司。二氧化硅微粒采购自天津龙华诚信粉体技术有限公司，粒径10～13μm。
制备例1罗汉果渣的制备
将经过植物提取的罗汉果渣进行胶体磨乳化，胶体磨进料速度为100kg/h，回流乳化1次后得含水量约为60％，颗粒直径为5～20μm的罗汉果泥，将罗汉果泥经硫化床干燥，硫化床进风温度为90～110℃，出风温度为50～60℃，得罗汉果粗粉，将罗汉果粗粉粉碎即成罗汉果粉。所得罗汉果粉色泽金黄，气味甘甜，水分含量为4.2wt％，膳食纤维含量为wt％，蛋白质含量为2.6wt％，罗汉果甜苷含量为0.3wt％。
制备例2凝结芽孢杆菌HALO178的分离
凝结芽孢杆菌纯菌株分离，包括以下步骤：
(1)取样品湖南泡椒、四川老坛酸菜、广西酸笋、东北辣白菜各10g，分别在超净工作台内用无菌研钵充分研磨，得到各样品匀浆，用移液器吸取0.5mL均浆至装有4.5mL无菌生理盐水的试管中旋涡混匀60s得到4种样品的匀浆稀释液，将各匀浆稀释液于80℃水浴10min后降至常温后旋涡混匀10s，每种样品用移液器分别吸取200μL匀浆稀释液涂布于30块碳酸钙平板中，于生化培养箱中45℃培养25h，120块平板共计612个菌落产生透明溶钙圈，其中湖南邵阳泡椒样品所涂布平板中菌落占495个。
(2)在超净工作台内观察上述产生透明溶钙圈的菌落形态，单独挑取所有呈乳白色，边缘整齐无褶皱，光滑微凸起，使用放大镜观察表面为磨砂状，大小在1.5～3mm之间的菌落，至装有3mL无菌生理盐水的试管中旋涡混匀60s得到菌落稀释液，用无菌接种环分别沾取菌落稀释液后在碳酸钙平板上划线后45℃培养25h，得到115块菌落形态一致的碳酸钙平板和41块菌落形态不一致有杂菌的碳酸钙平板。
(3)将步骤(2)中培养得到的41块含有杂菌的平板连续重复步骤(2)所述过程，共得到156块菌落形态一致的碳酸钙平板。
(4)在超净工作台内用接种环分别挑取步骤(2)和步骤(3)中得到碳酸钙平板中的单菌落，接种于MRS试管斜面上，待长出明显菌落后，置于0℃下保藏，得到156株原始菌株。对得到的菌株进行生理生化分析，得到47株显微镜观察营养体形态呈杆状、芽孢端生，革兰氏染色为阳性，利用葡萄糖不产气，不产硫化氢，过氧化氢酶试验阴性的菌株。
(5)将步骤(4)中分得到的47株凝结芽孢杆菌菌株进行极限选择性压力筛选培养，每株菌株设立筛选组3块MRS平板和对照组3块MRS平板，筛选组培养温度60℃、MRS培养基pH用磷酸调至3.0、额外添加浓度为0.6％的胆汁酸钠；对照组培养温度45℃、MRS培养基pH为6.5、额外添加浓度为0.03％的胆汁酸钠。得到9株能够在筛选组条件下存活并且筛选组比对照组存活率大于20％的菌株，挑取筛选组平板上的单菌落，接种于MRS试管斜面上，待长出明显菌落后，置于0℃下保藏，将其记录为第1代强耐高温、低pH、胆盐菌株。
(6)将步骤(5)得到的9株第1代强耐高温、低pH、胆盐菌株重复上述步骤(5)所述过程，计算存活率并记录为第2代强抗逆性菌株。以此类推，以连续10次筛选未能提高存活率3％以上为标准，传至11代、13代、17代、25代、36代、55代、72代、120代时，分别淘汰1株凝结芽孢杆菌，其最高存活率为41％，传至178代时，最后1株凝结芽孢杆菌的存活率为65％且不再提高，对上述9株菌以其最终传代数进行命名。
(7)将步骤(6)所得的9株凝结芽孢杆菌在MRS液体培养基中进行摇瓶培养，使用60％甘油保藏至-80℃超低温冰箱得到菌种。将9株凝结芽孢杆菌菌种在MRS液体培养基中进行摇瓶培养至10～12h后每间隔15min测定发酵液pH值变化，连续pH测定值变化小于0.01时，用对羟基联苯比色法测定乳酸含量，发现178号菌株的产乳酸能力最强，培养至20h时，乳酸含量达到5.1g/L，且培养基中葡萄糖添加越多，发酵液中最终乳酸含量越高，并用MRS培养基进行摇瓶培养。
(8)将步骤(7)所得的178号菌株使用试剂盒提取基因组DNA后，对16S rDNA序列进行PCR扩增，引物对为(27F：AGAGTTTGATCCTGGC TCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT)，对扩增产物测序，178号菌株的16S rDNA测序结果如序列表SEQ ID NO:1所示。将该序列用BLAST与GenBank中已记录的Bacillus coagulans strain 5627(GenBank：MT510450.1)对比，同源性为99.45％，最终将该菌株命名为HALO178，并已于2021年1月20日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，登记入册编号CGMCC No.21689。
制备例3凝结芽孢杆菌HALO178菌粉的制备
(1)菌株复壮：在MRS培养基中加入0.6％的胆汁酸钠，并将pH调至3.0，取1mL的HALO178菌种进行平板涂布，于60℃下恒温培养28h。
(2)一级种子培养：准确称取酵母粉2.1g，胰蛋白胨3.6g，葡萄糖2.1g，牛肉浸膏4.5g，罗汉果粉0.75g，氯化钠2.5g后使用蒸馏水充分溶解后定容至300mL，使用磷酸调pH至5.0后装于1L锥形瓶中，121℃灭菌15min后冷却至室温，将步骤(1)所述MRS平板中的菌落在超净工作台中挑种至锥形瓶中，于45℃下30rpm摇床培养26h，所得菌液分光光度计测OD600＝10.2。
(3)二级种子培养：准确称取酵母粉300g，胰蛋白胨500g，葡萄糖300g，牛肉浸膏600g，罗汉果粉100g，氯化钠100g至于50L发酵罐中，使用蒸馏水定容至40L，使用磷酸调pH至5.0，121℃灭菌20min后降温至45℃，将步骤(2)所得一级种子发酵液接种至50L发酵罐中，发酵罐控制温度45℃，转速30rpm，通气量0.3m3/h，发酵至21h时分光光度计测发酵液OD600＝10.5。
(4)高密度液体发酵：准确称取罗汉果粉4.8kg，多聚果糖4.8kg，酵母粉3kg，胰蛋白胨5kg，牛肉浸膏2kg，无水氯化钙60g，氯化钠1kg，磷酸氢二钾500g，一水合硫酸锰200g，L-半胱氨酸盐酸盐160g，于500L发酵罐中，使用蒸馏水定容至400L，121℃灭菌20min后降温至45℃，将步骤(3)所述二级种子移入500L发酵罐中，发酵罐控制温度45℃，转速50rpm，通气量3m3/h，发酵至28h时，发酵液芽孢率达到99％，经MRS培养基检测，发酵液芽孢含量为50×108CFU/mL。
(5)将步骤(4)所得发酵液使用碟式离心机在转速9000rpm的转速下分离发酵液上清后，得到40L浓缩发酵液，将浓缩液进行喷雾干燥，喷雾进风温度为200℃，出风温度为80℃，收集菌粉过80目筛后去除无法过筛的杂质，得9.5kg菌粉。经MRS培养基检测，菌粉芽孢含量为2.1×1011CFU/g。
实施例1
凝结芽孢杆菌HALO178抗逆性和产乳酸性能验证，包括以下步骤：
空白组：准确称取1g制备例3所得芽孢含量为2.1×1011CFU/g的凝结芽孢杆菌HALO178菌粉于已灭菌的250mL锥形瓶中(装有99mL生理盐水和55g直径为3.5mm的玻璃珠)，于24℃、220rpm下摇床震荡25min，得稀释倍数为10×102的稀释液，再吸取1mL该稀释液于装有9mL已灭菌生理盐水的试管中，使用漩涡混合器混匀10s后得稀释倍数为10×103的稀释液，连续重复上一步，直至得到稀释倍数为10×108的稀释液，取该稀释液100μL均匀涂布于pH为6.5的MRS平板上，共涂布3块平行，于42℃下培养48±2h后计算结果。
试验组：
1)试验1：其他条件与空白组相同，区别在于样品加入锥形瓶后，于80℃下水浴处理30min后再进行后续操作。
2)试验2：其他条件与空白组相同，区别在于先将样品置于白瓷盘中，于200℃下干热处理2min后，再进行对照组的操作。
3)试验3：其他条件与空白组相同，区别在于生理盐水pH用盐酸调至2.0，样品加入后于37℃下水浴保温2h后再进行后续操作。
4)试验4：其他条件与空白组相同，区别在于生理盐水中加入0.3％的胆汁酸钠，样品加入后摇匀静置24h后再进行后续操作。
5)试验5：挑取空白组和对照组平板上单菌落后接种于中MRS液体培养基中，培养至20时用对羟基联苯比色法测定发酵液中乳酸含量。
将各试验中试验组与空白组的结果对比，以空白组的结果为100％。结果显示：试验1中，80℃水浴处理30min后存活率为97％；试验2中，200℃干热处理2min后存活率为89％；试验3中，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理2h后存活率为78％；试验4中，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率为91％；试验5中，挑取平板单菌落进行摇瓶培养20h后其产生的乳酸含量高达5.2g/L。
对比例1
其他条件与实施例1相同，区别在于将实施例1中所用菌株凝结芽孢杆菌HALO178替换为国外某公司生产的含量为2.0×1011CFU/g的凝结芽孢杆菌产品。
将各试验中试验组与对照组的结果对比，以空白组的结果为100％。结果显示：试验1中，80℃水浴处理30min后存活率为68％；试验2中，200℃干热处理2min后存活率为82％；试验3中，37℃下pH 2.0的盐酸生理盐水中处理2h后存活率为43％；试验4中，37℃下用0.3％的胆汁酸钠溶液处理24h后存活率为56％；试验5中，挑取平板单菌落进行摇瓶培养20h后其产生的乳酸含量为4.3g/L。与实施例1比较，说明本发明得到的凝结芽孢杆菌HALO178具有高抗逆性，可以耐受食品、饲料、饮料等加工过程中的高温工序，可以在酸性、高胆盐浓度下存活率高，更便于使用和储存；同时还证明本发明的凝结芽孢杆菌HALO178具有更高的乳酸产量。
实施例2
(1)复合益生菌粉制备：将制备例3所得活菌含量为2.1×1011CFU/g的凝结芽孢杆菌HALO178菌粉与活菌含量为1.0×1010CFU/g的丁酸梭菌菌粉，活菌含量为1.0×1011CFU/g的枯草芽孢杆菌菌粉，活菌含量为1.0×1011CFU/g的地衣芽孢杆菌杆菌菌粉混合均匀即成，其配方如下表1所示：
表1
Figure BDA0003057186690000141
(2)生长因子制备：将硫酸镁，硫酸亚铁，硫酸铜，氯化钴，硫酸锰中的一种或几种；所述氨基酸包含L-半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、缬氨酸中的一种或几种按重量份比计，每种0～2份，混合均匀即成，其配方如下表2所示：
表2
Figure BDA0003057186690000142
Figure BDA0003057186690000151
(3)再将步骤(1)所得复合益生菌粉，步骤(2)所得生长因子与实施例1所得罗汉果粉、二氧化硅混合均匀后，分装至铝箔包装袋中即成，其配方如下表3所示：
表3
Figure BDA0003057186690000152
配方1～6所得含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌制剂色泽金黄，粉末粒度均匀，流动性优，带有明显的罗汉果香甜气味和较淡的发酵益生菌香味。
实施例3
含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌制剂育肥猪饲喂实验，包括以下步骤：
选取统一为87日龄且初始体重差在1kg以内的育肥猪110只，每10只为一栏，依次编为对照组和实验组1～10，对照组，正常喂食该猪场无添加抗生素和其他益生菌制剂的日粮(河南天池实验动物饲料有限公司，LAD2008)，实验组在日粮中按1wt‰的比例添加实施例2表3中不同配方的饲料添加剂，记录日采食量、日增重、肠炎率、便秘率、棚舍异味，每隔1周记录一次数据，直至出栏后计算日均采食量、日均增重、料肉比并对比各项结果，并以10分为最优进行评分，饲喂实验结果如表4所示：
表4
Figure BDA0003057186690000161
从表4可以看出，本发明提供的包含HALO178菌株的饲料添加剂，养猪的各方面指标都提升，特别是猪的肠炎率和便秘率显著下降，降低了养殖场猪发病死亡的风险，减少了饲料中抗生物的使用，提高经济效益，同时养殖臭味较轻。当需要育肥猪提前出栏时可以选择配方10，虽然便秘率略微升高，料肉比提高，养殖成本增加，但在特殊情况下也具有应用价值。
序列表
<110> 长沙和光生物科技有限公司
<120> 一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌和饲料添加剂
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> Bacillus coagulans
<400> 1
ctctgttcgc ttcggcggct ggctccgtaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa 60
ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtnttcacc gcggcatgct 120
gatccgcgat tactagcgat tccggcttca tgcaggcggg ttgcagcctg caatccgaac 180
tgggaatggt tttctgggat tggcttaacc tcgcggtctc gcagcccttt gtaccatcca 240
ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct 300
tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaagg 360
tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa 420
ccatgcacca cctgtcactc tgtcccccga aggggaaggc cctgtctcca gggaggtcag 480
aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc 540
gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc 600
ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta aagggcggaa accctctaac acttagcact 660
catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg 720
cctcagcgtc agttacagac cagagagccg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct 780
acgcatttca ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gcctcccagt 840
ttccaatgac cgcttgcggt tgagccgcaa gatttcacat cagacttaag aagccgcctg 900
cgcgcgcttt acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg 960
ctggcacgta gttagccgtg gctttctggc cgggtaccgt caaggcgccg ccctgttcga 1020
acggcacttg ttcttccccg gcaacagagt tttacgaccc gaaggccttc ttcactcacg 1080
cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140
ggagtttggg ccgtgtctca gtcccaatgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca 1200
tcgttgcctt ggtgagccgt taccccacca actagctaat gcgccgcggg cccatctgta 1260
agtgacagcc gaagccgtct ttcctttttc ctccatgcgg aggaaaaaac tatccggtat 1320
tagccccggt ttcccggcgt tatcccgatc ttacaggcag gttgcccacg tgttactcac 1380
ccgtccgccg ctaacctttt aaaagcaagc tttaaaaggt ccgcacgact gcagtatagc 1440
actcgccag 1449

Claims (10)

1.一种含有凝结芽孢杆菌HALO178的复合益生菌，由以下组分组成：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉、丁酸梭菌粉、枯草芽孢杆菌粉、地衣芽孢杆菌粉；所述凝结芽孢杆菌HALO178是于2021年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21689。
2.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HALO178的16SrDNA的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述凝结芽孢杆菌HALO178菌粉，每克微生物菌剂的芽胞含量1.2×1011-2.5×1011CFU，且芽孢率为至少98%。
4.根据权利要求1所述的复合益生菌，其特征在于，所述复合益生菌，由以下质量份组分组成：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1~5份、枯草芽孢杆菌菌粉1~5份、地衣芽孢杆菌菌粉1~5份、丁酸梭菌菌粉5~10份。
5.根据权利要求4所述的复合益生菌，其特征在于，所述复合益生菌由以下质量份组分组成：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1~2份、枯草芽孢杆菌菌粉1~3份、地衣芽孢杆菌菌粉2~4份、丁酸梭菌菌粉5~10份。
6.根据权利要求2所述的复合益生菌，其特征在于，所述16S rDNA序列的PCR扩增引物为，27F：AGAGTTTGATCCTGGC TCAG；1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。
7.一种包括权利要求1-6任一项所述复合益生菌的饲料添加剂，其特征在于，由以下质量份组分组成：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1~5份、枯草芽孢杆菌菌粉1~5份、地衣芽孢杆菌菌粉1~5份、丁酸梭菌菌粉5~10份、1~10份生长因子、50-150份罗汉果粉。
8.根据权利要求7所述的饲料添加剂，其特征在于，由以下质量份组分组成：凝结芽孢杆菌HALO178菌粉1~2份、枯草芽孢杆菌菌粉1~3份、地衣芽孢杆菌菌粉2~4份、丁酸梭菌菌粉5~10份、5~9份生长因子、66-90份罗汉果粉。
9.根据权利要求7或8所述的饲料添加剂，其特征在于，所述生长因子包括动物所需要的微量元素、氨基酸、维生素中的至少一种；和/或
所述罗汉果粉是经过提取后的罗汉果渣，经过胶体磨乳化、硫化床干燥、超微粉碎得到罗汉果渣的粉末，所述罗汉果渣中，膳食纤维含量≥50wt%，含水量≤15wt%。
10.根据权利要求9所述的饲料添加剂，其特征在于，生长因子包括微量元素和氨基酸，微量元素和氨基酸的质量比是1-3:1-3。
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