KR101156940B1

KR101156940B1 - 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법 및 이를 이용한 육계 사료의 제조방법

Info

Publication number: KR101156940B1
Application number: KR1020110094998A
Authority: KR
Inventors: 전진영; 문병헌; 안병기; 임순업; 박준현
Original assignee: 대상 주식회사
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2011-09-21
Publication date: 2012-06-20

Abstract

본 발명은 본 발명은 발효취를 최소화하여 가축의 섭취 기호도를 높인 클로렐라-발효물을 함유한 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 (a) 액상 클로렐라 및 고체 배지를 혼합하여 얻어진 혼합 배지 중에 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 배양 혼합물을 제공하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 35 내지 40 ℃에서 72 내지 90 시간 동안 공배양하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 배양물을 건조하는 단계를 포함하는, 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 사료 첨가제를 이용한 무-항생제 육계 사료의 제조방법을 제공한다.

Description

클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법 및 이를 이용한 육계 사료의 제조방법{Process for preparing feed additives comprising fermented chlorella and process for preparing feed for breeding chicken using the same}

본 발명은 발효취를 최소화하여 가축의 섭취 기호도를 높인 클로렐라-발효물을 함유한 사료 첨가제의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 사료 첨가제를 이용한 육계(育鷄) 사료, 특히 무-항생제 육계 사료의 제조방법에 관한 것이다.

클로렐라는 미세 담수 녹조류로 그리스어로 '녹색'을 의미하는 클로로스(chloros)와 라틴어의 '작은 것'을 의미하는 엘라(ella)를 조합해 만든 단어로 단백질을 포함한 여러 영양소를 포함하고 있다. 또한 증식 속도가 다른 식물에 비해 매우 빠르고, 엽록소 및 클로렐라 성장촉진인자(Chorella Growth Factor, CGF)라는 특수한 생리작용인자 및 인체에 유익한 비타민, 미네랄 등을 골고루 함유하고 있는 것으로 알려져 있어, 건강기능식품뿐만 아니라 다양한 식품첨가물로도 널리 이용하고 있다. 실제로 클로렐라의 구성성분은 단백질 50% 이상, 지방 10～20%, 클로로필 20% 이상으로 엽록소, 섬유소, 비타민, 미네랄 등이 풍부하다. 클로렐라 내의 구성성분은 체내 흡수 시에 장 기능 개선 효과, 동맥경화 예방, 체내 중금속 배출, 항산화 효과, 부족한 영양화 소화기관 문제 해결 및 스트레스에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 클로렐라는 고가의 물질로 인식되어 있어 사료첨가제로서의 연구가 상대적으로 활발히 진행되지 못하고 있다. 따라서, 가격 경쟁력이 있는 사료 첨가제를 개발하는 것은 국내의 가축 산업 및 가축의 건강 증진에 크게 기여할 것이다.

한편, 클로렐라는 세포벽이 매우 단단한 구조를 가지고 있어, 이를 섭취할 경우 그 세포벽 내부에 함유되어 있는 물질들이 체내로 좀처럼 흡수되지 않는다. 따라서 클로렐라의 세포벽 내부물질의 소화 흡수율을 높이기 위하여 다양한 방법으로 세포 내용물을 추출하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 클로렐라를 미세하게 파쇄하거나 세포벽 분해효소(β-1,3-glucanase, cellulase, xylanase, pectinase) 및 단백질 분해효소(papain, kojizyme, alkalase, esperase, nutrase, flacourzyme)를 첨가하여 반응시킨 후 추출하는 방법과 열수로 세포 내용물을 분리하는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 물리적 파쇄방법은 세포벽과 세포막이 충분하게 파쇄되지 않는 단점이 있고 세포벽 분해효소나 단백질 분해효소를 이용하여 반응시키는 방법은 생산비용이 너무 높고, 열수 추출방법은 열수와 함께 고도의 분리장치를 사용해야 하므로 생산 공정이 까다롭고 많은 설비가 소요되는 문제점이 있다.

이러한 클로렐라의 문제를 해결하기 위한 방법으로서, 클로렐라를 발효물 형태로 제조하는 것이 보고된 바 있다. 미국특허 제7,914,832호는 클로렐라 발효 식품의 제조방법으로서, 클로렐라 특유의 냄새를 감소시킨 제조방법을 개시한 바 있다. 상기 제조방법은 정선된 클로렐라 분말[(i) 대장균군 시험(coliform bacteria count)에서 음성을 나타내고, (ii) 페오포르비드(pheophorbide)가 18 mg% 이하이고, (iii) 일반세균수(viable general bacteria count)가 8000 cfu/ml]를 효모(baker's yeast) 및 유산균 존재하에서 발효시키는 것을 포함하거나; 혹은 클로렐라 분말을 가열 멸균(heat treatment)하여 전처리한 후, 효모(baker's yeast) 및 유산균 존재하에서 발효시키는 것을 포함한다. 그러나, 저온 세척 및 원심분리 공정의 반복적 수행을 통한 정선된 클로렐라 분말을 얻는 공정은 제조비용이 높아 가축용 사료 첨가제의 제조에 적합하지 않고, 또한 가열 멸균 처리 공정 또한 제조비용을 상승시키는 원인이 된다. 또한, 미국특허 제7,914,832호에 따른 제조방법은 클로렐라 분말 제조공정을 필수적으로 수행하여야 하므로, 분말화 과정에서 제조비용이 또한 상승되게 된다. 더욱이, 유산균 및 효모를 사용하여 발효를 수행하게 되므로, 발효 시간이 길어져 제조 원가가 상승하는 요인이 되며, 다른 오염균에 쉽게 오염될 수 있는 문제가 있다.

기타, 대한민국 특허공고 제72-46호는 클로렐라를 주원료로 하고 여기에 클로렐라 및 공지 배지로 제조한 유산균 중간 발효제를 첨가 28℃～35℃에서 발효시켜 설폰 아미드류를 0.01～0.05% 혼가시키는 것을 포함하는 발효사료의 제조방법을 개시한 바 있다.

따라서, 클로렐라가 갖는 발효취를 최소화하면서 클로렐라의 세포벽 내부물질의 소화 흡수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 처리 공정에 소요되는 비용을 최소화할 수 있는 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법을 개발하는 것이 당업계에 요구되고 있다.

본 발명자들은 클로렐라 특유의 발효취를 최소화하여 가축의 섭취 기호도를 높임과 동시에 클로렐라의 세포벽 내부물질의 소화 흡수율을 높일 수 있을 뿐만 아니라, 생산비용을 최소화할 수 있는 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 클로렐라 배양액으로부터 얻어진 액상 클로렐라를 고체 배지와 혼합하여 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 특정 조건에서 공배양(co-culturing)하여 사료 첨가제를 제조할 경우, 클로렐라의 발효취를 최소화할 수 있어 가축의 섭취 기호도를 높일 수 있으며, 클로렐라 정선, 열 처리, 분무건조 등의 공정을 수행할 필요가 없어 제조비용을 크게 낮출 수 있음을 발견하였다. 특히, 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 공배양함으로써, 클로렐라의 세포벽 내부물질의 소화 흡수율을 현저하게 높일 수 있어 무-항생제(antibiotics-free) 육계 사료의 제조가 가능하다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 액상 클로렐라를 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 특정 조건에서 공배양하는 것을 포함하는 사료 첨가제의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 사료 첨가제를 이용한 무-항생제 육계 사료의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, (a) 액상 클로렐라 및 고체 배지를 혼합하여 얻어진 혼합 배지(mixed medium) 중에 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 배양 혼합물을 제공하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 35 내지 40 ℃에서 72 내지 90 시간 동안 공배양(co-culturing)하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 배양물을 건조하는 단계를 포함하는, 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 액상 클로렐라는 클로렐라 배양원액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 배양원액의 농축액 즉, 농축액 100 g 당 습중량(wet weight) 기준으로 40～60 g의 클로렐라 고형물이 함유되도록 클로렐라 배양원액을 농축하여 얻어진 농축액일 수 있다. 상기 혼합 배지 중 액상 클로렐라의 함량은 30 내지 50 중량%의 범위일 수 있다. 상기 단계(b)는 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 35 ℃에서 72 시간 동안 공배양함으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 또한, 단계(c)의 상기 건조는 잔류 수분함량이 12 중량% 이하가 되도록 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 제조방법으로 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제를 제조하는 단계; 및 상기 사료 첨가제를 육계용 사료와 혼합하는 단계를 포함하는, 무-항생제(antibiotics-free) 육계 사료의 제조방법이 제공된다. 상기 혼합은 육계용 사료 1 톤에 대하여 0.1 ～ 5 kg의 비율로 사료 첨가제를 혼합함으로써 바람직하게 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법은 액상 클로렐라를 고체 배지와 혼합하여 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 특정 조건에서 공배양하는 것을 포함함으로써, 클로렐라 특유의 발효취를 최소화할 수 있어 가축의 섭취 기호도를 높일 수 있다. 또한, 클로렐라 정선, 열 처리, 분무건조 등의 공정을 수행할 필요가 없어 제조비용을 크게 낮출 수 있다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제는 육계용 사료에 있어서 항생제를 대체할 수 있는 높은 활성을 가지며, 따라서 상기 사료 첨가제는 무-항생제 육계 사료의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 (a) 액상 클로렐라 및 고체 배지를 혼합하여 얻어진 혼합 배지(mixed medium) 중에 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 배양 혼합물을 제공하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 35 내지 40 ℃에서 72 내지 90 시간 동안 공배양(co-culturing)하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 배양물을 건조하는 단계를 포함하는, 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법은 액상 클로렐라 및 고체 배지를 혼합하여 얻어진 혼합 배지 중에 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 배양 혼합물을 제공하는 단계[단계(a)]를 포함한다.

상기 클로렐라는 예를 들어, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa ), 클로렐라 레귤라리스(Chlorella regularis), 클로렐라 사코로필라(Chlorella saccharophila), 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 프로토테코이드(Chlorella prototecoide) 등을 제한없이 포함하며, 당업자가 입수가능한 모든 것을 포함한다.

상기 액상 클로렐라는 클로렐라 배양원액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 배양원액의 농축액 즉, 농축액 100 g 당 습중량(wet weight) 기준으로 40～60 g의 클로렐라 고형물이 함유되도록 클로렐라 배양원액을 농축하여 얻어진 농축액일 수 있다. 상기 클로렐라 배양원액은 클로렐라를 통상의 배양방법(예를 들어, 대한민국 특허등록 제10-0193748호)에 의해 배양함으로써 얻을 수 있으며, 통상 배양이 종료된 상태의 클로렐라 배양원액에는 약 2,000～3,000만(갯수/리터)개의 클로렐라가 존재한다. 상기 클로렐라의 배양은 무균 탱크에서 무균적, 유기종속적(예를 들어, 당원으로서 무수포도당을 사용하여)으로 수행될 수 있으며, 공기를 0.3～1.0vvm, 교반을 200～500rpm, pH는 6.5～7.5로 조절하여 유가식으로 배양할 수 있다.

본 발명의 제조방법은 클로렐라 배양원액 혹은 이의 농축액을 그대로 사용함으로써, 클로렐라 정선, 열 처리, 분무건조 등의 공정을 수행할 필요가 없어 제조비용을 크게 낮출 수 있다. 더욱이, 배양후 생산된 살아있는 상태의 '생 클로렐라'를 이어지는 공배양 공정에 직접 사용함으로써, 클로렐라가 가지고 있는 영양소의 파괴를 최소화할 수 있으며, 클로렐라 가지고 있는 고유의 기능성(건강기능식품법 고시 기능성)인 면역 증강 효과를 극대화할 수 있다.

상기 고체 배지는 사료 첨가제로서 사용될 수 있는 배지라면 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 고체 배지는 곡물을 주로 포함하는 배지일 수 있으며, 예를 들어 옥수수 분말, 대두박, 당밀, 탈지강, 및 무기물류(예를 들어, 탄산칼슘, 황산암모늄 등)를 포함하는 배지일 수 있으며, 각각의 함량은 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 바람직하게는 압출기 등을 이용하여 고온(약 125℃)에서 압출하여 얻어진 고체 배지가 전분의 호화도를 높이고 잡균의 증식을 억제할 수 있으므로, 바람직하게 사용될 수 있다. 상기 혼합 배지 중 액상 클로렐라의 함량은 30 내지 50 중량%의 범위일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 약 40 중량%일 수 있다.

상기 혼합 배지 중에 접종되는 바실러스 속 균주, 유산균, 및 효모는 예를 들어 각각 약 1 X 10⁹cells의 농도로 배양한 배양액을 500～5,000 ml, 더욱 바람직하게는 1,000～2,000 ml의 범위로 접종될 수 있으나, 크게 제한되는 것은 아니다. 필요에 따라, 약 1 X 10⁸cells의 농도로 배양한 배양액을 5000～50,000 ml를 사용할 수도 있다. 상기 바실러스 속 균주, 유산균, 및 효모는 공지된 균주를 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들어, 바실러스 속 균주로는 바실러스 서브틸리스 CT-10(Bacillus subtilis CT-10, KFCC11381p), 등을 사용할 수 있고, 유산균으로는 락토바실러스 엑시도필러스 (Lactobacillus acidophillus , ATCC314) 등을 사용할 수 있으며, 효모로는 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae, ATCC26108) 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법은 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 35 내지 40 ℃에서 72 내지 90 시간 동안 공배양하는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 제조방법은 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 동시에 사용하여 공배양을 수행함으로써, 발효 시간이 길어져 제조 원가가 상승하는 요인을 막을 수 있으며, 유산균과 효모균의 균체 증식시간이 길기 때문에 발생되는 다른 오염균의 증식을 바실러스 속 균주와 함께 배양함으로써 저해할 수 있는 장점이 있다. 특히, 단백질 분해력이 높은 바실러스 속 균주를 유산균 및 효모와 함께 공배양함으로써, 세포내용물의 이용성을 저해하는 클로렐라 균체의 불용성 물질을 효과적으로 분해하여 클로렐라의 세포벽 내부물질의 소화 흡수율을 현저하게 높일 수 있다.

본 발명자들은 공배양을 통한 발효균주의 증식이 바실러스속 균주, 유산균, 효모의 순으로 증식될 경우, 클로렐라의 발효취를 최소화할 수 있다는 것을 발견하였으며, 이러한 증식을 달성하기 위해서는 특정 배양 조건을 채용한다는 것을 발견하였다. 즉, 배양 혼합물을 35 내지 40 ℃에서 72 내지 90 시간 동안 공배양할 경우, 바실러스속 균주, 유산균, 효모의 순으로 증식이 달성되며, 클로렐라의 발효취를 최소화할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 단계(b)는 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 약 35 ℃에서 약 72 시간 동안 공배양함으로써 바람직하게 수행될 수 있다. 상기 공배양은 통상의 발효기, 예를 들어 리본(Ribbon)이 장착된 드럼식 발효기를 사용하여 약 5～10 rpm으로 교반하면서 수행될 수 있다.

본 발명의 제조방법은 단계(b)에서 얻어진 배양물을 건조하는 단계[즉, 단계(c)]를 포함한다.

상기 건조는 잔류 수분함량이 12 중량% 이하, 바람직하게는 4 내지 12 중량%가 되도록 수행하는 것이 바람직하다. 잔류 수분함량이 12 중량%를 초과할 경우에는 사료 첨가제로서 사료와의 혼합 과정에서 응집 현상이 발생하여 혼합 공정을 수행하는 것이 어려워질 수 있고, 또한 케이킹(caking) 현상이 발생할 수 있어 유통 및 보관 과정 중에 2차 오염의 가능성이 발생할 수 있다. 상기 건조 공정은 통상의 건조방법을 사용하여 수행될 수 있으며, 저온풍 건조방법을 사용하는 것이 제조비용을 최소화할 수 있으며, 클로렐라의 영양소 및 면역증강 물질의 파괴를 최소화할 수 있으므로 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명자들은 상기와 같이 제조된 사료 첨가제를 사료, 특히 육계용 사료와 혼합하여 사용할 경우, 항생제를 첨가하지 않고도 효과적으로 육계가 가능하다는 것을 발견하였다. 특히, 단백질 분해력이 높은 바실러스 속 균주를 유산균 및 효모와 함께 공배양함으로써, 세포내용물의 이용성을 저해하는 클로렐라 균체의 불용성 물질을 효과적으로 분해하여 클로렐라의 세포벽 내부물질의 소화 흡수율을 현저하게 높일 수 있으므로, 항생제를 첨가하지 않고도 효과적으로 육계가 가능하다.

따라서, 본 발명은 또한 상기 제조방법으로 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제를 제조하는 단계; 및 상기 사료 첨가제를 육계용 사료와 혼합하는 단계를 포함하는, 무-항생제(antibiotics-free) 육계 사료의 제조방법을 제공한다. 상기 혼합은 특별히 제한되는 것은 아니나, 육계용 사료 1 톤에 대하여 0.1 ～ 5 kg의 비율로 사료 첨가제를 혼합함으로써 바람직하게 수행될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명이 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

하기 실시예에서, 농축액 100 g 당 습중량 기준으로 50 g의 클로렐라 고형물이 함유되도록 클로렐라 배양원액을 농축하여 얻어진 농축액을 액상 클로렐라로 사용하였다. 또한, 고체 배지는 옥수수 분말 30 중량%, 대두박 30 중량%, 당밀 5 중량%, 탈지강 30 중량%, 및 무기물류(탄산칼슘, 황산암모늄) 5%의 혼합물을 단일 스크류가 장작된 압출기(extruder having single screw)를 이용하여 약 125℃에서 압출하여 제조한 것을 사용하였다. 또한, 공배양은 리본(Ribbon)이 장착된 드럼식 발효기를 사용하여 약 10 rpm으로 교반하면서 배양하였다. 또한, 잔류 수분함량은 수분측정기를 이용하여 측정하였다.

실시예 1. 액상 클로렐라의 함량에 따른 영향 평가

액상 클로렐라 및 고체 배지를 혼합하여 액상 클로렐라의 함량이 각각 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 및 60 중량%를 함유하는 혼합 배지를 준비하였다. 각각의 혼합 배지 1,000 kg에 바실러스 서브틸리스 CT-10(Bacillus subtilis CT-10, KFCC11381p) 약 1 X 10⁹ cells를 함유하는 배양액 1,000ml, 락토바실러스 엑시도필러스 (Lactobacillus acidophillus , ATCC314) 약 1 X 10⁹ cells를 함유하는 배양액 1,000ml, 및 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae, ATCC26108) 약 1 X 10⁹ cells를 함유하는 배양액 1,000ml을 접종하고, 약 37℃에서 72 시간 동안 공배양한 후, 각각의 혼합 배지에서 증식된 각 균주의 수를 측정하였다. 얻어진 배양물을 잔류 수분함량이 12% 가 되도록 저온풍 건조하였으며, 각각의 건조 시간을 측정하였다. 얻어진 건조물의 발효취(우수: 7인 이상[좋다], 보통: 5인 이상[좋다], 불량: 5인 이하 [좋다]) 및 색상(양호: 7인 이상, 불량: 7인 이하)을 측정하였다. 상기 평가 결과는 하기 표 1과 같다.

구분		혼합 배지 중 액상 클로렐라 함량 (중량%)
항목	미생물 종류	20	30	40	50	60
미생물 검사 (cfu/g)	B. subtilis	5.9 x 10⁶	2.5 x 10⁷	3.8 x 10⁸	4.2 x 10⁸	3.8 x 10⁷
	L. acidophillus	4.7 x 10⁴	4.6 x 10⁵	1.2 x 10⁶	7.2 x 10⁶	5.2 x 10⁵
	S. cerevisiae	2.7 x 10⁴	3.9 x 10⁴	8.4 x 10⁴	5.3 x 10⁶	7.8 x 10⁶
관능 검사	발효취¹	불량	보통	우수	우수	불량
	색상²	불량	양호	양호	양호	불량
	건조 소요시간(hr)	16	20	28	52	86

¹ 발효취 관능 : 성인남자 10명의 관능 평가(우수: [좋다]7인이상, 보통: [좋다]5인이상, 불량:[좋다]5인이하)

² 색상 관능: 성인남자 10명의 관능평가(양호: 7인이상, 불량: 7인이하)

상기 표 1의 결과로부터, 혼합 배지 중에 액상 클로렐라의 함량이 30 내지 50 중량%의 범위에서 발효취가 줄어들고, 색상이 양호함을 알 수 있으며, 40 중량%의 액상 클로렐라를 함유하는 것이 발효취 감소 및 색상 측면에서 가장 바람직함을 알 수 있다. 건조 소요시간은 액상 클로렐라의 함량이 증가할수록 증가하였으며, 특히 액상 클로렐라의 함량이 40 중량%를 초과할 경우에는 건조 소요시간이 더욱 가파르게 증가함을 알 수 있다. 따라서 생산 비용 측면, 발효취 감소, 및 색상의 측면을 감안할 때, 혼합 배지 중 액상 클로렐라의 함량은 40 중량% 내외가 바람직하다.

실시예 2. 공배양 조건 평가

액상 클로렐라 및 고체 배지의 혼합배지(액상 클로렐라의 함량: 40 중량%) 1,000 kg에 바실러스 서브틸리스 CT-10(Bacillus subtilis CT-10, KFCC11381p) 약 1 X 10⁹ cells를 함유하는 배양액 1,000ml, 락토바실러스 엑시도필러스 (Lactobacillus acidophillus , ATCC314) 약 1 X 10⁹ cells를 함유하는 배양액 1,000ml, 및 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae, ATCC26108) 약 1 X 10⁹ cells를 함유하는 배양액 1,000ml을 접종하고, 30℃, 35℃, 또는 40℃의 조건에서, 각각 36, 54, 72, 및 90 시간 동안 공배양한 후, 증식된 각 균주의 수를 측정하였다. 얻어진 배양물을 28 시간 동안 건조한 후 잔류 수분함량을 측정하고, 발효취를 실시예 1과 동일한 방법으로 평가하였다. 상기 평가 결과는 하기 표 2와 같다.

항목		미생물 수 (cfu/g)			발효취	수분 함량 (%)
배양 온도 (℃)	배양 시간 (hr)	B. subtilis	L. acidophillus	S. cerevisiae	발효취	수분 함량 (%)
30	36	5.9 x 10⁴	6.5 x 10⁵	3.8 x 10³	불량	31
	54	4.7 x 10⁵	4.6 x 10⁶	1.2 x 10⁴	불량	25
	72	2.7 x 10⁶	1.9 x 10⁷	8.4 x 10⁶	불량	17
	90	5.9 x 10⁷	8.5 x 10⁷	3.8 x 10⁸	불량	13
35	36	5.9 x 10⁵	1.5 x 10⁴	1.8 x 10³	보통	27
	54	5.9 x 10⁶	4.5 x 10⁵	9.3 x 10³	보통	20
	72	3.9 x 10⁸	2.5 x 10⁶	8.5 x 10⁴	우수	11
	90	8.9 x 10⁸	9.5 x 10⁶	9.8 x 10⁵	우수	8
40	36	1.4 x 10⁵	3.5 x 10³	5.8 x 10²	보통	26
	54	4.5 x 10⁶	7.5 x 10³	8.8 x 10³	보통	18
	72	7.9 x 10⁷	3.5 x 10⁴	7.8 x 10³	우수	9
	90	2.3 x 10⁸	4.5 x 10⁴	8.1 x 10³	우수	7

상기 표 2의 결과로부터, 발효취 감소 효과는 공배양에서 증식된 미생물의 상대적인 수에 의존함을 알 수 있으며, 바실러스속 균주 > 유산균 > 효모의 순으로 증식되는 것이 우수한 발효취 감소를 달성할 수 있음을 알 수 있고, 따라서 공배양의 배양 온도는 35 내지 40 ℃의 범위가 바람직함을 알 수 있다. 또한, 공배양은 적어도 72 시간 이상 즉, 72 내지 90 시간 동안 수행하여야 12% 이하의 잔류 수분함량을 갖는 건조물이 얻어질 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 건조 공정에 따른 제조비용 및 발효취 감소의 측면을 감안할 때, 공배양은 35 내지 40 ℃에서 72 내지 90 시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 약 35℃에서 72 시간 동안 수행하는 것이 가장 바람직하다.

실시예 3. 무-항생제 육계사료의 제조 및 평가

상기 실시예 2에서 35℃에서 72 시간 동안 공배양을 수행하여 얻어진 건조물을 사료 첨가제로 사용하여, 육계 성장에 미치는 영향을 평가하였다. 즉, 기본 사료로서, 조단백질 20%를 함유하는 ME(대사에너지) 3,350 kcal의 사료(미국 사양표준인, NRC)를 사용하여, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 5개의 처리군으로 나누어, 각 처리군 당 100 마리의 육계(체중: 45±0.3 g)를 5복씩(100마리의 육계를 5회 반복하여 총 500마리에 대하여) 32일 동안 급여하였다. 항생제로는 육계 사료에 통상적으로 사용되는 클로르테트라사이클린(chlortetracycline)을 100 ppm의 비율로 첨가하였다(대조군-2). 시험군-1은 배양원액의 농축액 즉, 농축액 100 g 당 습중량 기준으로 50 g의 클로렐라 고형물이 함유되도록, 클로렐라 배양원액을 농축하여 얻어진 농축액을 기본 사료 1톤당 10 리터를 혼합하여 사용하였다. 시험군-2는 클로렐라 배양원액을 분무건조하여 얻어진 건조물을 기본 사료 1톤당 10 kg을 혼합하여 사용하였다. 시험군-3은 상기 실시예 2에서 35℃에서 72 시간 동안 공배양을 수행하여 얻어진 건조물을 기본 사료 1톤당 5 kg을 혼합하여 사용하였다.

처리군	사료 조성
대조군-1	기본사료
대조군-2	기본사료 + 항생제
시험군-1	기본사료 + 클로렐라 배양원액의 농축액 (10리터/1ton)
시험군-2	기본사료 + 클로렐라 배양원액의 분무건조물 (10kg/1ton)
시험군-3	기본사료 + 클로렐라 발효물 (5kg/1ton)

상기와 같이 처리군의 육계를 32일 동안 급이한 후, 32일째의 체중(종료체중, g), 증체량(g), 32일 동안의 사료섭취량(g), 및 사료요구율(%)을 측정하였다. 사료 요구율은 [(증체량×100)/사료섭취량]으로 측정하였다. 각 처리군의 종료체중(g), 증체량(g), 사료섭취량(g), 및 사료요구율(%)의 평균값을 하기 표 4에 나타낸다.

처리군	개시체중	종료체중	증체량	사료섭취량	사료요구율
대조군-1	45	1,635	1,590	2,658	1.70
대조군-2	45	1,655	1,610	2,657	1.66
시험군-1	45	1,654	1,609	2,656	1.66
시험군-2	45	1,653	1,608	2,658	1.63
시험군-3	45	1,670	1,625	2,656	1.60

상기 표 4의 결과로부터, 항생제를 함유하지 않은 대조군-1의 경우 증체량이 유의성 있게 낮았으며, 이는 세균 감염에 의해 육계의 건강이 악화되었음을 보여준다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제를 사용한 육계가 가장 높은 증체량을 나타내었으며, 증체량이 높음에도 불구하고 사료요구율이 유의성 있게 낮음을 알 수 있다. 특히, 클로렐라 분무건조물에 비하여 1/2 수준으로 첨가하더라도 더욱 우수한 증체량 및 사료요구율을 나타내었다. 이는 바실러스 속 균주로부터 분비되는 단백질 분해효소에 의해 클로렐라의 삼중 세포막 구조가 분해됨으로써, 아미노산, 단백질, 당류, 비타민, 클로렐라 성장촉진인자(Chorella Growth Factor, CGF) 등의 클로렐라 세포내용물질의 이용성이 높아지는데 기인하는 것으로 추정된다.

Claims

(a) 액상 클로렐라 및 고체 배지를 혼합하여 얻어진 혼합 배지로서 액상 클로렐라의 함량이 30 내지 50 중량%인 혼합 배지 중에 바실러스 속 균주, 유산균 및 효모를 접종하여 배양 혼합물을 제공하는 단계; (b) 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 35 내지 40 ℃에서 72 내지 90 시간 동안 공배양하는 단계; 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 배양물을 건조하는 단계를 포함하는, 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 액상 클로렐라가 클로렐라 배양원액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 액상 클로렐라가, 농축액 100 g 당 습중량(wet weight) 기준으로 40～60 g의 클로렐라 고형물이 함유되도록, 클로렐라 배양원액을 농축하여 얻어진 농축액인 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 단계(b)가 단계(a)에서 얻어진 배양 혼합물을 35 ℃에서 72 시간 동안 공배양함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 단계(c)의 상기 건조가 잔류 수분함량이 12 중량% 이하가 되도록 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항, 제5항, 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 클로렐라-발효물을 함유하는 사료 첨가제를 제조하는 단계; 및 상기 사료 첨가제를 육계용 사료와 혼합하는 단계를 포함하는, 무-항생제(antibiotics-free) 육계 사료의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 혼합이 육계용 사료 1 톤에 대하여 0.1 ～ 5 kg의 비율로 사료 첨가제를 혼합함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 무-항생제 육계 사료의 제조방법.