CN103627656A - 一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法 - Google Patents
一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，生产方法为混菌固态发酵培养法。固态发酵培养基是以酶解豆粕与米糠为主料，添加适量的无机盐，分装后灭菌，接种与固态培养基总重量的10%的等体积丁酸梭菌TK2种子液和总重量5%的等体积凝结芽孢杆菌TQ33种子液，搅拌均匀后进行发酵。37℃发酵48h后，经50℃烘干、粉碎、过筛得到的丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33复合益生菌制剂中，混菌发酵中，丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌的互利共栖协同作用，更有效的分解豆粕中的抗营养因子，使发酵豆粕中的营养物质更加丰富、均衡，提供一种富含复合益生菌的高蛋白饲料。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法。
背景技术
丁酸梭菌是一种厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，是人和动物肠道的正常菌群，也存在于土壤、奶酪和天然酸奶中；周身鞭毛，具运动性；芽孢偏心或次端生（内生），呈圆形或椭圆形，无孢外壁和附属丝。丁酸梭菌具有抵抗外界相对恶劣环境的理化性质，能耐高温、耐储存且稳定性良好，在体内丁酸梭菌能耐受胃液、胆汁酸和消化液的作用；丁酸梭菌只对新生霉素、万古霉素和四环素等少数抗生素敏感，对其他多种抗生素具有很强的耐药性，具有良好的应用前景。
丁酸梭菌具有防止病原菌及腐败菌在肠道内的异常增殖和促进肠道有益菌群增殖、发育的双重作用，从而纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的产生；能增强宿主的免疫功能，促进动物的生长，改善动物的生产性能；可降解饲料，提高饲料营养、适口性等；在肠道内产生多种酶类、氨基酸、B族维生素和维生素K等，为宿主补充营养物质兼具其他保健功能；能分解有害物质，改善环境；其重要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞再生、修复的主要营养物质。
凝结芽孢杆菌是一种呈杆状，两端钝圆，兼性厌氧的革兰氏阳性菌，过氧化氢酶阳性，芽孢端生，无鞭毛；最适生长温度为45-50℃，最适pH值为6.6-7.0。凝结芽孢杆菌是被美国食品和药品管理局（FDA）以及美国饲料监察协会（AAFCO）规定允许饲喂的微生物种类，也是中、日、韩等多国公认的芽孢益生菌。
凝结芽孢杆菌发酵饲料也能提高其营养物质、适口性、饲料转化率，同时产生苯乳酸等抑菌物质，提高饲料的储存性及稳定性；可替代抗生素作为动物生长促进剂，增强免疫，改善动物产品质量；产生胞外多糖，去除肠道内的活性氧，预防疾病；能产生芽孢，耐高温、耐磨损及肠道内各种消化液的作用，调节肠道微生态平衡，补充机体营养物质等多种保健功能。
名称为一种凝结芽孢杆菌及其发酵液和发酵方法及发酵液作为生物农药的应用的发明专利，申请号为201110313933.2，发明涉及一种凝结芽孢杆菌及该菌发酵获得的发酵液作为农药的应用，名称为TQ33，分类名称Bacillus coagulans，保藏编号为：CGMCC No.5233，方法所用发酵培养基为g/L：蛋白胨10.0、淀粉10.0、溶剂为水，pH7.2-7.4；发酵条件为：35-39℃摇瓶150-170r/min培养15-25h,按照发酵条件发酵后获得发酵液。本发明从凝结芽孢杆菌TQ33发酵液中分离出一种抑制植物病原真菌的活性物质，其结构鉴定为苯乳酸，并且温室盆栽实验进一步验证了苯乳酸对植物病原菌的抑制作用，这是首次从凝结芽孢杆菌中分离出苯乳酸这种抑制植物病原菌活性物质，为凝结芽孢杆菌应用于生物农药，抑制植物病原菌生长等方面提供了实验依据。
名称为一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，申请号为201110126498.2。发明涉及一种丁酸梭菌及丁酸梭菌饲料添加剂的生产方法，名称为TK2，分类名称Clostridiumbutyricum，保藏编号为：CGMCCNo.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，提供了一种生产方法为固态发酵培养法。本发明中丁酸梭菌TK2菌株经过液体种子培养将冻藏菌种活化，再经优化后的固态发酵培养基培养，并对其活菌浓度及芽孢浓度测定，用本方法生产的丁酸梭菌活菌数为4.35×109cfu/g，芽孢转化率85%，基于本菌种开发了新型的低成本的丁酸梭菌活菌制剂生产方法。在丁酸梭菌单菌发酵后，培养基中含有特有的酸臭味。
目前，已有报道丁酸梭菌制剂的制备是通过固态发酵的方法获得，都是以丁酸梭菌的单菌发酵为主，然而丁酸梭菌是严格厌氧菌且对营养物质要求较高，丁酸梭菌单据发酵增加其对厌氧设备的需求，且发酵初期启动困难、易染菌。单菌发酵中，可增加丁酸梭菌的接种量以利于发酵的启动，而接种量的增大又会引发固态发酵培养基含水量高、通气和干燥困难等一系列问题。通过混菌固态发酵制备丁酸梭菌复合益生菌制剂却少见报道。在混菌固态发酵中，菌株间的互利共栖协同作用，能提高产率和菌体浓度；多菌株的产酶、产酸和产营养物质能力、对基质的分解能力等要显著优于单菌发酵。混菌固态发酵还具有获得纯种发酵无法获得的产物，生长速度快，对底物利用率高，可多级转化，发酵后的微生物群体稳定，省工节能，简化工艺及发酵设备和易控制等诸多优点，且不易染菌。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足之处，提供一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法。混菌发酵中两种菌株相互促进生长，凝结芽孢杆菌能为丁酸梭菌的生长提供严格的厌氧环境及丰富的营养物质，丁酸梭菌则为凝结芽孢杆菌提供维生素等生长因子；提供一种富含益生菌的高蛋白饲料；制得的复合益生菌制剂含有高数量的丁酸梭菌及凝结芽孢杆菌活菌数，兼具两种益生菌的所有益处，能更好的促进动物生长，增强机体免疫，改善禽、畜、渔、蛋、奶等产品的质量，打破国际贸易的“绿色壁垒”；此外，凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸具显著的抑菌作用，能提高复合益生菌制剂的稳定性及储存性。
另外，丁酸梭菌产生的丁酸、乙酸等短链脂肪酸和凝结芽孢杆菌能够产生的乳酸等有机小分子酸在产生部位直接被吸收，还能调节肠道pH，刺激肠道蠕动，改善肠道微环境，抑制病原菌的增殖而调节肠道微生态平衡，以治疗相关疾病。其中，丁酸在预防与治疗相关肠炎、肠癌中起积极作用，因其是结肠上皮细胞能量代谢和正常生长主要的营养物质，能量供应的不充分是导致结肠炎的主要原因之一；丁酸及其盐类还具有促进癌细胞凋亡和在体外抑制癌细胞的增殖，从而在体内能抵抗相关的癌症。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，具体步骤如下：
灭菌后的固态发酵培养基按其重量的10%-15%接种丁酸梭菌种子液和按其重量的2%-5%接种凝结芽孢杆菌种子液；
不透气材料封口于发酵容器，37±1℃条件下培养46-50h。发酵完毕后，在不高于60℃下烘干，粉碎，过筛，即成为丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌复合益生菌制剂产品。
固态发酵培养基的重量百分比为：酶解豆粕30-35、米糠5-10、MgSO4·7H2O0.06-0.12、MnSO4·7H2O0.06-0.12、加水至100%，每100mL三角瓶装量为50-80g（发酵容器装量系数0.5-0.8），pH自然。
所述酶解豆粕的制备方法为：豆粕加水重量比为1:2，中性蛋白酶用量1000u每克豆粕，酶解3h。所用中性蛋白酶ZDB-G-20购自天津诺奥科技发展有限公司。
所述丁酸梭菌为CGMCC No.4729；
所述凝结芽孢杆菌CGMCC No.5233
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明解决了传统丁酸梭菌制剂制备过程中的资源浪费及废水处理的问题。传统的丁酸梭菌制剂是通过液态发酵培养后固液分离获得菌体，加以辅料，冷冻干燥或低热干燥制得的，而丁酸梭菌产生的挥发性短链脂肪酸、消化酶、维生素和天然促生长因子等均存在于废水中，造成资源浪费且废水处理困难。
2、本发明采用混菌固态发酵法制备复合益生菌制剂，与原液态发酵相比，固态发酵能耗小、培养基来源广泛、设备相对简单、产物浓度高，具有投资少、操作简单、物质损耗小、能耗低、发酵管理简单的优势。
3、本发明中的丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌非厌氧发酵。由于丁酸梭菌的生长、增殖需要严格的厌氧环境及丰富的营养，丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌发酵过程中，利用凝结芽孢杆菌消耗周围空间的氧气，及其生命活动中对固态培养基的降解，为丁酸梭菌的生长提供严格的厌氧环境及丰富的营养物质，降低了对厌氧设备及培养基营养成分的需求；丁酸梭菌产生的维生素能补充凝结芽孢杆菌生长所需的生长因子。
4、本发明是丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌发酵，微生物的相关酶的作用能有效的分解豆粕中的胰蛋白酶抑制剂、植酸、大豆凝血素、脲酶等多种抗营养因子，为动物提供一种富含丁酸梭菌、凝结芽孢杆菌复合益生菌的高蛋白饲料。
5、本发明解决了丁酸梭菌单菌发酵培养基中特有的酸臭味，因凝结芽孢杆菌能产生大量的乳酸等，使混菌固态发酵后的培养基具有一定的芳香气味，且酸度适宜。
6、本发明中，丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌发酵后的饲料可直接用于饲喂，便可降低能耗；也可以干粉形式作为产品，产品性能稳定，因凝结芽孢杆菌产生苯乳酸而具更为良好的储存性。
附图说明
图1：混菌厌氧发酵中凝结芽孢杆菌TQ33接种量对丁酸梭菌TK2生长的影响
图2：混菌厌氧发酵中凝结芽孢杆菌TQ33接种量对凝结芽孢杆菌TQ33生长的影响
图3：混菌非厌氧发酵中凝结芽孢杆菌TQ33接种量对丁酸梭菌TK2生长的影响
图4：混菌非厌氧发酵中凝结芽孢杆菌TQ33接种量对凝结芽孢杆菌TQ33生长的影响
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
一种丁酸梭菌TK2，分类名称Clostridium butyricum，保藏编号为：CGMCC No.4729，保藏日期：2011年4月2日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
一种凝结芽孢杆菌TQ33，分类名称Bacillus coagulans，保藏编号为：CGMCC No.5233，保藏日期：2011年9月9日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
丁酸梭菌TK2液体活化及种子培养基为（g/L）：葡萄糖5-10、胰蛋白胨5-15、酵母膏2-6、K2HPO43-7、MgSO4·7H2O0.1-0.5、MnSO4·H2O0.1-0.5、溶剂为水，pH7.2-7.4，培养温度为37±1℃，厌氧培养18-22h。凝结芽孢杆菌TQ33种子培养基为（g/L）：酵母膏5-15，葡萄糖40-60，蛋白胨5-15，MgSO4·7H2O0.1-0.5，pH6.8-7.2，培养温度为37±1℃，160-200r/min摇床培养18-22h。
1、丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33种子的培养
实施例1
丁酸梭菌活化及种子液培养基的配置（g/L）：葡萄糖8、胰蛋白胨10、酵母膏4、K2HPO45、MgSO4·7H2O0.2、MnSO4·H2O0.2、溶剂为水，pH7.4。活化培养基用试管分装，每支试管装量10mL；种子培养基用50mL平底烧瓶分装，每瓶装量为40mL，121℃灭菌20min。
将甘油管冻藏的菌种接到活化培养基中，37℃静置厌氧培养18h；活化后的丁酸梭菌TK2接种到种子培养基，接种量为5%，37℃厌氧培养24h。
实施例2
凝结芽孢杆菌TQ33种子培养基的配置（g/L）：酵母膏10，葡萄糖60，蛋白胨10，MgSO4·7H2O0.5，溶剂为水，pH7.2，每250mL三角瓶分装50mL种子培养基，115℃灭菌20min。
将试管斜面保存的凝结芽孢杆菌TQ33接种到种子培养基中，接种量为1～3环，37℃、180r/min震荡培养20h。
2、固态发酵培养基的配置
实施例3
酶解豆粕的制备：豆粕加水重量比为1:2，中性蛋白酶用量1000u每克豆粕，酶解3h。所用中性蛋白酶ZDB-G-20购自天津诺奥科技发展有限公司。
固态发酵培养基的配置：酶解豆粕33.1、米糠6.6、MgSO4·7H2O0.12、MnSO4·7H2O0.12、加水至100%，每100mL三角瓶装量为70g，pH自然。先用水溶解无机盐，再边搅拌边依次加入酶解豆粕、米糠，最终使其混合均匀，分装后灭菌，121℃灭菌20min。
3、凝结芽孢杆菌TQ33的不同接种量对混菌固态厌氧发酵的影响
实施例4
按照固态培养基总重量的10%，等体积的接入丁酸梭菌TK2种子液7mL；按固态培养基总重量的2%，等体积接入凝结芽孢杆菌TQ33种子液1.4mL。用玻璃棒搅拌均匀并使其集中堆放在三角瓶瓶底，纱布塞加牛皮纸封口，放入厌氧培养箱中，利用厌氧设备抽放气三次，用N2置换三角瓶中的空气，37℃条件下培养48h，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数进行检测；发酵后的固态培养基于50℃烘干，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数再次进行检测。
实验结果：厌氧发酵后的固态培养基中丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为3.77×108CFU/g和2.83×108CFU/g，芽孢率为75.07%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为2.75×109CFU/g和5.45×108CFU/g，芽孢率为19.82%。50℃烘干后丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为1.56×109CFU/g和1.43×109CFU/g，芽孢率为91.67%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为1.63×109CFU/g和1.41×109CFU/g，芽孢率为86.50%。
实施例5
按照固态培养基总重量的10%，等体积的接入丁酸梭菌TK2种子液7mL；按固态培养基总重量的5%，等体积接入凝结芽孢杆菌TQ33种子液3.5mL。用玻璃棒搅拌均匀并使其集中堆放在三角瓶瓶底，纱布塞加牛皮纸封口，放入厌氧培养箱中，利用厌氧设备抽放气三次，用N2置换三角瓶中的空气，37℃条件下培养48h，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数进行检测。
实验结果：厌氧发酵后的固态培养基中丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为1.63×108CFU/g和1.12×108CFU/g，芽孢率为68.71%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为3.15×109CFU/g和4.72×108CFU/g，芽孢率为14.98%。
实施例6
按照固态培养基总重量的10%，等体积的接入丁酸梭菌TK2种子液7mL；按固态培养基总重量的8%，等体积接入凝结芽孢杆菌TQ33种子液5.6mL。用玻璃棒搅拌均匀并使其集中堆放在三角瓶瓶底，纱布塞加牛皮纸封口，放入厌氧培养箱中，利用厌氧设备抽放气三次，用N2置换三角瓶中的空气，37℃条件下培养48h，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数进行检测。
实验结果：厌氧发酵后的固态培养基中丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为8.40×107CFU/g和5.12×107CFU/g，芽孢率为60.95%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为3.31×109CFU/g和3.25×108CFU/g，芽孢率为9.82%。
4、凝结芽孢杆菌TQ33的不同接种量对混菌固态非厌氧发酵的影响
实施例7
按照固态培养基总重量的10%，等体积的接入丁酸梭菌TK2种子液7mL；按固态培养基总重量的2%，等体积接入凝结芽孢杆菌TQ33种子液1.4mL。用玻璃棒搅拌均匀并使其集中堆放在三角瓶瓶底，纱布塞加一次性防滑聚乙烯手套双层（不透气材料）封口，无需抽换气体，37℃条件下培养48h，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数进行检测；发酵后的固态培养基于50℃烘干，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数再次进行检测。
实验结果：非厌氧发酵后的固态培养基中丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为2.70×108CFU/g和1.92×108CFU/g，芽孢率为71.11%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为1.48×109CFU/g和3.85×108CFU/g，芽孢率为26.01%。50℃烘干后丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为1.09×109CFU/g和1.02×109CFU/g，芽孢率为93.58%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为2.38×109CFU/g和2.09×109CFU/g，芽孢率为87.82%。
实施例8
按照固态培养基总重量的10%，等体积的接入丁酸梭菌TK2种子液7mL；按固态培养基总重量的5%，等体积接入凝结芽孢杆菌TQ33种子液3.5mL。用玻璃棒搅拌均匀并使其集中堆放在三角瓶瓶底，纱布塞加一次性防滑聚乙烯手套双层（不透气材料）封口，无需抽换气体，37℃条件下培养48h，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数进行检测。
实验结果：非厌氧发酵后的固态培养基中丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为1.18×108CFU/g和8.05×107CFU/g，芽孢率为68.22%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为1.67×109CFU/g和2.49×108CFU/g，芽孢率为14.91%。
实施例9
按照固态培养基总重量的10%，等体积的接入丁酸梭菌TK2种子液7mL；按固态培养基总重量的8%，等体积接入凝结芽孢杆菌TQ33种子液5.6mL。用玻璃棒搅拌均匀并使其集中堆放在三角瓶瓶底，纱布塞加一次性防滑聚乙烯手套双层（不透气材料）封口，无需抽换气体，37℃条件下培养48h，对丁酸梭菌TK2及凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数进行检测。
实验结果：非厌氧发酵后的固态培养基中丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为5.66×107CFU/g和3.17×107CFU/g，芽孢率为56.00%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为2.69×109CFU/g和3.30×108CFU/g，芽孢率为12.27%。
检测与对比：
一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，其特征在于：丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33混菌固态发酵中，凝结芽孢杆菌TQ33的接种量对其发酵效果具有一定的影响。当丁酸梭菌TK2的接种量为10%，及凝结芽孢杆菌TQ33的接种量为2%的时候，丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数最高，同时凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数也适宜。
一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33厌氧混菌固态发酵后的培养基经50℃烘干、粉碎、过筛得到的丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33复合益生菌制剂中，丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为1.56×109CFU/g和1.43×109CFU/g，芽孢率为91.67%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为1.63×109CFU/g和1.41×109CFU/g，芽孢率为86.50%。
一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33非厌氧混菌固态发酵后的培养基经50℃烘干、粉碎、过筛得到的丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33复合益生菌制剂中，丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为1.09×109CFU/g和1.02×109CFU/g，芽孢率为93.58%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为2.38×109CFU/g和2.09×109CFU/g，芽孢率为87.82%。
丁酸梭菌TK2与凝结芽孢杆菌TQ33非厌氧混菌发酵所得的复合益生菌制剂虽不及混菌厌氧发酵的效果好，但数量级基本一致，且发酵过程中不需要厌氧环境，极大程度的降低了生产成本；相比于国内丁酸梭菌的固态研究而言，活菌数及芽孢数基本相当，最重要的是本发明可不需要厌氧培养，复合益生菌制剂中含有丁酸梭菌TK2和凝结芽孢杆菌TQ33复合芽孢益生菌，能改善禽畜渔等产品的质量，打破国际贸易的“绿色壁垒”，且凝结芽孢杆菌TQ33产生的苯乳酸具有优良的防腐（抑菌）功能，保证该复合制剂具有良好的稳定性及储存性。
Claims (6)
1.一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵饲料，由以下方法制得，灭菌后的固态发酵培养基按其重量的10%-15%接种丁酸梭菌种子液和按其重量的2%-5%接种凝结芽孢杆菌种子液；不透气材料封口于发酵容器，37±1℃条件下培养46-50h。发酵完毕后，在不高于60℃下烘干，粉碎，过筛，即成为丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌复合益生菌制剂产品。
2.一种丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，具体步骤如下：
灭菌后的固态发酵培养基按其重量的10%-15%接种丁酸梭菌种子液和按其重量的2%-5%接种凝结芽孢杆菌种子液；不透气材料封口于发酵容器，37±1℃条件下培养46-50h。发酵完毕后，在不高于60℃下烘干，粉碎，过筛，即成为丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌复合益生菌制剂产品。
3.根据权利要求2所述丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，其特征在于所述固态发酵培养基的重量百分比为：酶解豆粕30-35、米糠5-10、MgSO4·7H2O0.06-0.12、MnSO4·7H2O0.06-0.12、加水至100%。
4.根据权利要求2所述丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，其特征在于所述丁酸梭菌为CGMCC No.4729。
5.根据权利要求2所述丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵方法，其特征在于所述和凝结芽孢杆菌CGMCC No.5233 。
6.根据权利要求2-5所述丁酸梭菌与凝结芽孢杆菌混菌固态发酵饲料，所述混菌固态发酵饲料中丁酸梭菌TK2的活菌数及芽孢数为1.09×109CFU/g和1.02×109CFU/g，芽孢率为93.58%；凝结芽孢杆菌TQ33的活菌数及芽孢数为2.38×109CFU/g和2.09×109CFU/g，芽孢率为87.82%。
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