CN111363698B - 一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的菌剂与应用 - Google Patents

一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的菌剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的菌剂与应用。一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，包括如下有效成分：枯草芽孢杆菌，产朊假丝酵母，乳酸菌，复合酶制剂，葡萄糖，蛋白胨；本发明首次将枯草芽孢杆菌Bsbc01与产朊假丝酵母共同作用制备菌剂，产朊假丝酵母具有所需营养物质简单、生长繁殖快等优点，可以快速消耗饲料空隙中存在的氧气，限制霉菌的生长繁殖，同时产朊假丝酵母具有蛋白和维生素B族含量高等特点可以增加饲料的营养价值。

Description

一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的菌剂与应用
技术领域
本发明属于微生物发酵饲料技术领域，具体涉及一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的菌剂与应用。
背景技术
随着畜牧养殖行业的快速发展，饲料尤其是蛋白类饲料原料的短缺成为了限制畜牧养殖行业的进一步发展的关键因素，而上世纪50年代，科学研究发现在动物日粮中添加少量抗生素等物质可有效提高动物的饲料利用率，促进动物的生产性能，这一发现对畜牧行业的进一步快速发展做出了巨大的贡献，但是随着时间的增长，尤其是耐药细菌和超级细菌等问题的出现，人们发现在动物饲料日粮中添加抗生素的危害也是异常显著，欧盟自2006年1月起已经全面禁止在饲料日粮中添加抗生素，我国也将在2020年底全面禁止抗生素在饲料日粮中的添加，饲料短缺的问题将长期制约我国畜牧业的发展，而微生物发酵饲料作为一种安全和健康的养殖模式越来越受到广大畜牧行业养殖人员的关注。
微生物发酵饲料是指在人为控制条件下，以微生物为饲料发酵的菌剂，将发酵饲料原料中抗营养因子进行分解或转化，生成多种有机酸、维生素等营养物质，在发酵过程中还可产生淡淡的香味，增加了动物的适口性，还可以提高动物的抵抗力。
微生物发酵饲料虽然优点众多，但是也存在一定问题，尤其是现在发酵饲料生产厂家大多是小型饲料加工工厂，缺少缺少专业的微生物人员和发酵设备，对微生物知识和发酵工艺了解较少，且生产条件和卫生管理水平较差，反而使微生物发酵饲料存在极大的安全隐患，尤其是霉菌污染和霉菌毒素的危害，降低饲料的利用价值的同时对养殖动物本身造成巨大的伤害。
目前市场上常规微生物发酵菌剂都能达到常规的饲料发酵目的，但是在使用过程中由于养殖环境污染较多和微生物发酵饲料保质期短等问题造成微生物发酵饲料霉变，霉菌毒素指标超标等问题成为微生物发酵饲料广泛推广的限制因素，因此寻找可以抑制霉菌的生长和降解霉菌毒素的微生物成为关键因素。
中国专利文献CN109929784A(申请号201910323006.5)公开了一株枯草芽孢杆菌及其培养方法与应用。一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bsbc01，于2019年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC No.17239。本发明首次公开了一种具有从青藏高原养殖区筛选获得的枯草芽孢杆菌，该菌较现有已知枯草芽孢杆菌具有显著的低氧耐受特性，作为动物饲料添加剂较现有枯草芽孢杆菌具有更好的应用效果。
中国专利文献CN109845881A(申请号201910110295.0)公开了一种微生物发酵饲料及其制备方法。采用堆积发酵生产的饲料质量不稳定，发酵产物难以掌控，容易受杂菌感染。本申请提供一种微生物发酵饲料，所述饲料按原料重量份计包括如下组分：果渣20～40份，玉米秸秆15～35份，中草药秸秆10～25份，豆粕1～25份，玉米粉5～25份，液体菌种2～15份；所述液体菌种包括产朊假丝酵母1～5份，枯草芽孢杆菌0.5～5份，同型乳酸菌1～5份，酿酒酵母0～5份。上述经过微生物发酵的饲料虽然能够促进动物的吸收，但由于含有大量半分解成分，仍然非常容易滋生霉菌等有害微生物。
发明内容
本发明提供了一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的菌剂与应用，通过添加微生物发酵剂产品后微生物发酵饲料富含大量活性益生菌，具有明显的发酵香味，同时能减少霉菌总量，降低霉菌毒素含量，有效延长微生物发酵饲料的保质期。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，每克包括如下有效成分：
枯草芽孢杆菌1～2×1011cfu，产朊假丝酵母不低于1～2×1010cfu，乳酸菌不低于5～8×1010cfu，复合酶制剂100U～200U，葡萄糖0.15g～0.2g，蛋白胨不低于0.35g～0.5g；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bsbc01，来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC NO.17239；
所述复合酶制剂由中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和NSP复合酶组成。
根据本发明优选的，所述中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶与NSP复合酶的酶活比为(1.5～2.5):(2.5～3.5):(1.5～2.5):1:(1.5～2.5)。
根据本发明优选的，所述乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸链球菌三种乳酸菌的混合；进一步优选的，所述植物乳杆菌：干酪乳杆菌：乳酸链球菌活菌数为(1.5～2.5):(1.5～2.5):1。
根据本发明优选的，所述产朊假丝酵母购自国家菌种保藏中心，菌种编号CGMCC2569；植物乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC1.12974；乳酸链球菌购自中国农业微生物菌种保藏中心，菌种编号：ACCC 11092；干酪乳杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心，菌种编号：ACCC 03948。
上述产朊假丝酵母不需要生长因子就可以生长，并且繁殖速度快，其菌体本身蛋白质和维生素B族含量高，可以更好的提高发酵饲料的营养价值；微生物菌剂中含有葡萄糖不低于0.15g/g；蛋白胨不低于0.35g/g，可以为菌种提供发酵初始阶段可快速利用的碳源和氮源。
上述降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌经活化培养、种子培养、扩大培养后，冷冻干燥，制得枯草芽孢杆菌干粉；
(2)将产朊假丝酵母菌经活化培养、种子培养、扩大培养后，经冷冻干燥，制得产朊假丝酵母菌干粉；
(3)将乳酸菌经活化培养、种子培养、扩大培养后，经冷冻干燥，制得乳酸菌干粉；
(4)将步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌干粉、步骤(2)制得的产朊假丝酵母菌干粉、步骤(3)制得的乳酸菌干粉按比例与复合酶制剂、葡萄糖和蛋白胨混合，即得。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述活化培养为在LB固体培养基平板上35～38℃活化培养20～28h；所述种子培养为在LB液体培养基中，35～38℃、180～220rpm振荡培养16～20h；所述扩大培养为按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，35～38℃培养20～28h；
所述液体培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH7.0～7.2。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，所述活化培养为在LB固体培养基平板上28～32℃活化培养20～28h；所述种子培养为在YPD培养基中，28～32℃、180～220rpm振荡培养45～50h；所述扩大培养为按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，35～38℃培养45～50h；
所述液体培养基每升组分如下：
葡萄糖60g、豆粕粉80g、酵母粉3g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾1g，水定容至1L。
所述YPD培养基组分如下，均为重量百分比：
1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，余量水。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，乳酸菌由植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸链球菌构成，活菌比例为2:1:2，分别对植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸链球菌进行活化培养、种子培养、扩大培养及冷冻干燥。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中，所述活化培养为在LB固体培养基平板上35～38℃活化培养20～28h；所述种子培养为在MRS液体培养基中，35～38℃、180～220rpm振荡培养45～50h；所述扩大培养为按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，35～38℃培养45～50h；
所述液体培养基每升组分如下：
糖蜜30g、蛋白胨2g、豆粕粉3g、磷酸氢二钾1g，水定容至1L。
所述MRS培养基每升组分如下：
蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g，水定容至1L。
根据本发明优选的，所述步骤(1)～(3)中，冷冻干燥步骤如下：
将经菌液固液分离，取菌体，按菌体重量5～10％的比例加入保护剂，在冷冻真空干燥-60℃～-70℃条件下冷冻干燥10～14h，即得。
进一步优选的，所述保护剂为由脱脂奶粉、可溶性淀粉和麦芽糊精按质量比5:3:2的比例混合。
上述降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂在制备发酵饲料中的应用。
根据本发明优选的，上述应用，包括以下步骤：
(i)将上述微生物菌剂按照饲料总重量的0.4～1％的比例加入并混合，然后加入饲料总重量25～40％的水，升温至35～39℃，搅拌30min以上，制得含活化后菌剂的饲料；
(ii)向步骤(i)制得的含活化后菌剂的饲料中加入饲料总重量25～40％的水，混合均匀，在30℃～40℃恒温条件下密闭发酵72h以上，制得发酵饲料。
根据本发明优选的，所述步骤(i)中混合为搅拌5～30min。
本发明与现有技术相比，具有以下创新和有效功效；
1、本发明首次将枯草芽孢杆菌Bsbc01与产朊假丝酵母共同作用制备菌剂，产朊假丝酵母具有所需营养物质简单、生长繁殖快等优点，可以快速消耗饲料空隙中存在的氧气，限制霉菌的生长繁殖，同时产朊假丝酵母具有蛋白和维生素B族含量高等特点可以增加饲料的营养价值。
2、在高原养殖区筛选枯草芽孢杆菌，所得菌株枯草芽孢杆菌Bsbc01有明显低氧耐受性，可以有效利用饲料中残留的氧气成分限制霉菌的生长繁殖且产生抗真菌活性物质杀灭霉菌，此外其还能有效降解霉菌毒素，本申请所述的微生物菌剂制得的发酵饲料，总有益菌含量≥5×1010cfu/g，pH≤4.5，总酸≥10％，且黄曲霉毒素B1、呕吐毒素和玉米赤霉烯酮三种毒素含量降解率≥90％。
附图说明
图1是实验例2中实施例1～3及对比例1～2所述产品制备的发酵饲料经保质期加速试验30天后生物饲料霉菌平板检测结果照片；
图2是实验例3中实施例1所述产品处理后玉米赤霉烯酮毒素液相检测结果照片；
图3是实验例3中实施例2所述产品处理后玉米赤霉烯酮毒素液相检测结果照片；
图4是实验例3中实施例3所述产品处理后玉米赤霉烯酮毒素液相检测结果照片；
图5是实验例3中对比例1所述产品处理后玉米赤霉烯酮毒素液相检测结果照片；
图6是实验例3中对比例2所述产品处理后玉米赤霉烯酮毒素液相检测结果照片。
具体实施方式
下面结合以下具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
产朊假丝酵母和植物乳杆菌购自国家菌种保藏中心，乳酸链球菌和干酪乳杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心；
枯草芽孢杆菌Bsbc01来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏编号为CGMCC NO.17239；
制剂来源
中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和NSP复合酶均为市售普通产品，购自青岛根源生物技术集团有限公司；保护剂为脱脂奶粉、可溶性淀粉和麦芽糊精按质量比5:3:2的比例混合，购自河南旗诺食品配料有限公司；
实施例1
一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌Bsbc01经LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌种；然后，将活化菌种接种于LB液体培养基中37℃、200rpm振荡培养18h，制得种子液；然后，将种子液按体积百分比6％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养24h，制得枯草芽孢杆菌菌液；然后，按5％比例加入保护剂，在112℃进风温度下喷雾干燥，制得枯草芽孢杆菌干粉；
所述扩大培养为所述液体培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米粉2％，豆饼粉3％，麸皮2％，柠檬酸钠0.5％，KH2PO4 0.03％，K2HPO4 0.01％，CaCl2 0.01％，余量水，pH7.0～7.2；
(2)将产朊假丝酵母菌经LB固体培养基平板上30℃活化培养24h，制得活化菌种；然后，将活化菌种接种于YPD培养基中，30℃、200rpm振荡培养48h，制得种子液；然后，将种子液按体积百分比6％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养48h，制得产朊假丝酵母菌菌液；然后，按10％比例加入保护剂，在冷冻真空干燥-65℃条件下冷冻干燥12h，制得产朊假丝酵母菌干粉；
所述液体培养基每升组分如下：
葡萄糖60g、豆粕粉80g、酵母粉3g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾1g，水定容至1L。
所述YPD培养基组分如下，均为重量百分比：
1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，余量水。
(3)将植物乳杆菌经LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌种；然后，将活化菌种接种于MRS液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养48h，制得种子液；然后，将种子液按体积百分比6％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养48h，制得植物乳杆菌菌液；然后，按10％比例加入保护剂，在冷冻真空干燥-65℃条件下冷冻干燥12h，制得植物乳杆菌干粉；
将植干酪乳杆菌经LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌种；然后，将活化菌种接种于MRS液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养48h，制得种子液；然后，将种子液按体积百分比6％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养48h，制得干酪乳杆菌菌液；然后，按10％比例加入保护剂，在冷冻真空干燥-65℃条件下冷冻干燥12h，制得干酪乳杆菌干粉；
将乳酸链球菌经LB固体培养基平板上37℃活化培养24h，制得活化菌种；然后，将活化菌种接种于MRS液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养48h，制得种子液；然后，将种子液按体积百分比6％的接种量接种到液体培养基中，37℃培养48h，制得乳酸链球菌菌液；然后，按10％比例加入保护剂，在冷冻真空干燥-65℃条件下冷冻干燥12h，制得乳酸链球菌干粉；
所述液体培养基每升组分如下：
糖蜜30g、蛋白胨2g、豆粕粉3g、磷酸氢二钾1g，水定容至1L。
所述MRS培养基每升组分如下：
蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g，水定容至1L。
(4)将(3)制得的植物乳杆菌干粉、干酪乳杆菌干粉和乳酸链球菌干粉按活菌比例2:2:1进行混合，制得乳酸菌干粉；
将中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和NSP复合酶按酶活比1.5:3.5:1.5:1:2.5的比例混合，制得复合酶制剂；
将乳酸菌干粉、复合酶制剂、葡萄糖、蛋白胨、步骤(1)制得的枯草芽孢杆菌干粉、步骤(2)制得的产朊假丝酵母菌干粉，混合均匀，制得降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂；
上述降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，每克包括如下有效成分：
枯草芽孢杆菌Bsbc01 1×1011cfu，产朊假丝酵母1×1010cfu，乳酸菌5×1010cfu，复合酶制剂100U，葡萄糖0.15g，蛋白胨0.35g。
实施例2
如实施例1所述的降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，不同之处在于，每克包括如下有效成分：
枯草芽孢杆菌Bsbc01 2×1011cfu，产朊假丝酵母2×1010cfu，乳酸菌5×1010cfu，复合酶制剂500U，葡萄糖0.2g，蛋白胨0.4g；
所述复合酶制剂由中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和NSP复合酶组成；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶与NSP复合酶的酶活比为2:3:2:1:2。
所述乳酸菌为植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸链球菌三种乳酸菌按活菌数＝1.5:2.5:1的比例混合。
实施例3
如实施例1所述的降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，不同之处在于，每克包括如下有效成分：
枯草芽孢杆菌Bsbc01 1×1011cfu，产朊假丝酵母1×1010cfu，乳酸菌5×1010cfu，复合酶制剂100U，葡萄糖0.15g，蛋白胨0.35g；
所述复合酶制剂由中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和NSP复合酶组成；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶与NSP复合酶的酶活比为2.5:2.5:2.5:1:1.5。
所述乳酸菌为植物乳杆菌。
对比例1
如实施例1所述的降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，不同之处在于，每克包括如下有效成分：
枯草芽孢杆菌(中国专利申请201810054908.9中记载的枯草芽孢杆菌ANSB01G，霉立解产品中分离菌株，霉立解购自河南亿万中元生物技术有限公司)2×1011cfu，产朊假丝酵母2×1010cfu，乳酸菌5×1010cfu，复合酶制剂500U，葡萄糖0.2g，蛋白胨0.4g；
所述复合酶制剂由中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和NSP复合酶组成；中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶与NSP复合酶的酶活比为2:3:2:1:2。
对比例2
如实施例1所述的降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，不同之处在于，每克包括如下有效成分：
枯草芽孢杆菌Bsbc01 1×1011cfu，产朊假丝酵母2×1010cfu，乳酸菌5×1010cfu，葡萄糖0.2g，蛋白胨0.4g。
实验例1
①发酵饲料组成成分：
豆粕：玉米：麸皮＝1:1:1
②发酵饲料制备：
将实施例1、实施例2、实施例3、对比例1和对比例2所述的降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂分别与饲料按以下步骤处理：
(i)将微生物菌剂按照饲料总重量的0.4％的比例加入并搅拌5min，然后加入饲料总重量25％的水，升温至37℃，搅拌30min以上，制得含活化后菌剂的饲料；
(ii)向步骤(i)制得的含活化后菌剂的饲料中加入饲料总重量25％的水，混合均匀，在35℃恒温条件下密闭发酵72h，制得发酵饲料。
③指标测定：
将发酵好的微生物发酵饲料低温烘干后混合均匀测定相关指标，结果如表1所示：
表1
饲料原料 实施例1 实施例2 实施例3 对比例1 对比例2
粗蛋白 24.33％ 27.61％ 30.18％ 27.95％ 25.85％ 25.85％
小肽(占粗蛋白) 7.31％ 36.11％ 35.01％ 32.33％ 29.11％ 10.17％
pH值 6.8 4.11 4.01 4.56 4.95 5.18
总酸 0.30％ 12.66％ 13.05％ 9.06％ 5.36％ 5.08％
维生素B族mg/kg 13.72 18.63 20.33 18.05 15.03 12.55
活菌总数cfu/g ＜1×10<sup>3</sup> 7.5×10<sup>10</sup> 11.5×10<sup>10</sup> 6.7×10<sup>8</sup> 5.3×10<sup>7</sup> 3.5×10<sup>7</sup>
霉菌总数cfu/g 8.5×10<sup>4</sup> ＜1×10<sup>3</sup> ＜1×10<sup>3</sup> ＜1×10<sup>3</sup> 1.5×10<sup>6</sup> ＜1×10<sup>3</sup>
由表1中可以看出：
①因为枯草芽孢杆菌Bsbc01在低氧环境下可以产生抑制真菌的抗菌物质，添加枯草芽孢杆菌Bsbc01可以有效抑制霉菌总数，减少霉菌污染，因此，通过实施例1和对比例1的数据可以看出，虽然均为具有抗菌作用的枯草芽孢杆菌，但二者对霉菌的抑制效果差异显著，可能与菌株本身的特性及整个生长环境的影响有关。
②乳酸菌的添加可以将发酵饲料pH值降低，有利于发酵饲料的长期保存，同时产生有机酸促进动物肠道健康，由实施例1和实施例3的数据对比可以看出，不同乳酸菌的添加不仅会对pH产生影响，而且会显著影响其他菌的数量，因而乳酸菌与其他微生物具有相互影响的作用。
③复合酶添加可以对饲料原料进行酶解，提高饲料的营养价值，促进动物消化吸收的效率，通过实施例1与对比例2的数据对比可以看出，加入复合酶后，其不仅有利于将大分子物质分解为小分子物质，而且其对pH值、总酸、维生素B族含量、活菌总数均具有显著影响，但对霉菌总数影响不大，因此可以看出，复合酶的加入可以营造有利于本申请中希望保留的有益微生物的生长及分泌相关有益成分，而非对所有微生物均具有正向促生作用。
实施例2
发酵饲料保质期加速实验
①将实验例1中制得的发酵饲料开口保存30天；
②采用孟加拉红倾注的培养方法分别测定放置30天后发酵饲料中霉菌总数含量，具体步骤如下：
取25g实验样品，加入225ml无菌水，通过梯度稀释，将稀释的菌液放置到无菌平板中，加入孟加拉红培养基，30℃培养5天后观察霉菌数量。
通过开口放置实验，可以加速霉菌生长，实验结果如图1所示，通过图1可以看出，加入枯草芽孢杆菌Bsbc01的发酵饲料实施例1、实施例2和实施例3都对饲料中有明显的抑制作用，对比例2中因缺少复合酶所以菌含量偏低，pH值较高，所以虽然含有枯草芽孢杆菌Bsbc01，但是也有部分霉菌生长。
实施例3
对霉变饲料处理实验
①霉变饲料存在问题：玉米赤霉烯酮含量严重超标。
②将发酵饲料烘干后分别用实施例1、实施例2、实施例3、对比例1和对比例2所述的降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂对霉变饲料按实验例1中②的方法重新发酵；
③通过高效液相测定发酵前后饲料中玉米赤霉烯酮毒素含量，玉米赤霉烯酮毒素出峰时间为8.8min，实验结果如图2～6所示。
通过出峰面积计算玉米赤霉烯酮含量，采用实施例1微生物菌剂组的含量48.5ppb，如图2所示；采用实施例2微生物菌剂组的含量50.1ppb，如图3所示；采用实施例3微生物菌剂组的含量51.7ppb，如图4所示；采用对比例1微生物菌剂组的含量3556.7ppb，如图5所示；采用对比例2微生物菌剂组的含量3701.5ppb，如图6所示；由此可以看出，实施例1、实施例2和实施例3因添加枯草芽孢杆菌Bsbc01玉米赤霉烯酮含量明显降低，并且2.0min出峰时间处物质含量明显增加，说明玉米赤霉烯酮被降解成另外一种物质，而不是简单物理吸附减少。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (14)

1.一种降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂，其特征在于，每克包括如下有效成分：
枯草芽孢杆菌1～2×1011cfu，产朊假丝酵母不低于1～2×1010cfu，乳酸菌不低于5～8×1010cfu，复合酶制剂100U～200U，葡萄糖0.15g～0.2g，蛋白胨不低于0.35g～0.5g；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bsbc01，来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为CGMCC NO.17239；
所述乳酸菌为植物乳杆菌，或者为植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸链球菌三种乳酸菌的混合；
所述复合酶制剂由中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和NSP复合酶组成。
2.如权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述中性蛋白酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶与NSP复合酶的酶活比为（1.5～2.5）:（2.5～3.5）:（1.5～2.5）:1:（1.5～2.5）。
3.如权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌：干酪乳杆菌：乳酸链球菌活菌数为（1.5～2.5）: （1.5～2.5）:1。
4.如权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述产朊假丝酵母购自国家菌种保藏中心，菌种编号CGMCC 2569；植物乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC 1.12974；乳酸链球菌购自中国农业微生物菌种保藏中心，菌种编号：ACCC 11092；干酪乳杆菌购自中国农业微生物菌种保藏中心，菌种编号：ACCC 03948。
5.权利要求1所述降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将枯草芽孢杆菌经活化培养、种子培养、扩大培养后，冷冻干燥，制得枯草芽孢杆菌干粉；
（2）将产朊假丝酵母菌经活化培养、种子培养、扩大培养后，经冷冻干燥，制得产朊假丝酵母菌干粉；
（3）将乳酸菌经活化培养、种子培养、扩大培养后，经冷冻干燥，制得乳酸菌干粉；
（4）将步骤（1）制得的枯草芽孢杆菌干粉、步骤（2）制得的产朊假丝酵母菌干粉、步骤（3）制得的乳酸菌干粉按比例与复合酶制剂、葡萄糖和蛋白胨混合，即得。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述活化培养为在LB固体培养基平板上35～38℃活化培养20～28h；所述种子培养为在LB液体培养基中，35～38℃、180～220rpm振荡培养16～20h；所述扩大培养为按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，35～38℃培养20～28h；
所述液体培养基组分如下，均为重量百分比：
玉米粉2%，豆饼粉3%，麸皮2%，柠檬酸钠0.5%，KH2PO4 0.03%，K2HPO4 0.01%，CaCl20.01%，余量水，pH7.0～7.2。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，所述活化培养为在LB固体培养基平板上28～32℃活化培养20～28h；所述种子培养为在YPD培养基中，28～32℃、180～220rpm振荡培养45～50h；所述扩大培养为按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，35～38℃培养45～50h；
所述液体培养基每升组分如下：
葡萄糖60g、豆粕粉80g、酵母粉3g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾1g，水定容至1L；
所述YPD培养基组分如下，均为重量百分比：
1% 酵母膏 ，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，余量水。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，乳酸菌由植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸链球菌构成，活菌比例为2:2:1，分别对植物乳杆菌、干酪乳杆菌和乳酸链球菌进行活化培养、种子培养、扩大培养及冷冻干燥。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述活化培养为在LB固体培养基平板上35～38℃活化培养20～28h；所述种子培养为在MRS液体培养基中，35～38℃、180～220rpm振荡培养45～50h；所述扩大培养为按体积百分比5～8％的接种量接种到液体培养基中，35～38℃培养45～50h；
所述液体培养基每升组分如下：
糖蜜30g、蛋白胨2g、豆粕粉3g、磷酸氢二钾1g，水定容至1L；
所述MRS培养基每升组分如下：
蛋白胨 10.0 g、牛肉浸取物 10.0 g、酵母提取液 5.0 g、葡萄糖 5.0 g、乙酸钠 5.0g、柠檬酸二胺 2.0 g、吐温 80 1.0 g、磷酸氢二钾 2.0 g、七水硫酸镁 0.2 g、七水硫酸锰0.05 g、碳酸钙 20.0 g，水定容至1L。
10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）～（3）中，冷冻干燥步骤如下：
将经菌液固液分离，取菌体，按菌体重量5～10%的比例加入保护剂，在冷冻真空干燥-60℃～-70℃条件下冷冻干燥10～14h，即得。
11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述保护剂为由脱脂奶粉、可溶性淀粉和麦芽糊精按质量比5:3:2的比例混合。
12.权利要求1所述降低发酵饲料霉变及霉菌毒素危害的微生物菌剂在制备发酵饲料中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（i）将上述微生物菌剂按照饲料总重量的0.4～1%的比例加入并混合，然后加入饲料总重量25～40%的水，升温至35～39℃，搅拌30min以上，制得含活化后菌剂的饲料；
（ii）向步骤（i）制得的含活化后菌剂的饲料中加入饲料总重量25～40%的水，混合均匀，在30℃～40℃恒温条件下密闭发酵72h以上，制得发酵饲料。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述步骤（i）中混合为搅拌5～30min。
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