CN107853478B - 一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂 - Google Patents

一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其中草药原料配比为陈皮25～35份、牛膝20～30份、麦芽20～30份、川芎18～26份、柴胡10～20份、黄芪12～20份、鱼腥草8～15份、甘草5～10份，通过好氧菌群（黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌）和厌氧菌群（嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌）二步发酵工艺，复配纤维素酶制得。本申请通过中草药原料间的协同作用及益生菌间的协同发酵作用，显著提升了产品功效，将生物酶制剂、中草药功能活性成分、益生菌于一体，试验结果表明具有显著的降低甲烷排放效果，易于工业化生产，推广应用前景广阔。

Description

一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂
技术领域
本发明涉及一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，尤其是一种利用微生物协同发酵复方中草药制备能显著降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，属于生物技术领域。
背景技术
牛养殖业是经济高效的畜牧产业,是现代化农业的重要组成部分之一。如今世界各国都非常重视奶业及肉牛养殖业的发展，特比是奶牛养殖产业发展，发达国家的奶业产值一般占畜牧业总产值的1/3左右。奶业已经成为发达国家农业的支柱产业,他们把奶业的发展程度看作为现代化农业尤其是畜牧业发达水平的重要标志。牛奶产量和人均占有量已经被视为国家经济发达程度与综合国力强弱的主要指标之一。目前我国的奶牛养殖业一直呈现持续增长态势，2013年我国奶牛存栏量达到1500万头,但是,在奶业快速发展的同时,规模化奶牛场的环境污染问题也引起了人们的重视。奶牛场的污染物主要包括固体废渣(主要包括奶牛粪便、废弃饲料、垫料、死畜等)；养殖污水(包括尿液、挤奶间地面清洗用水、冲洗畜舍的废水、挤奶设备的清洁用水、饲槽冲洗水、职工生活用水等)；恶臭物质(包括甲烷、二氧化碳、氨气、硫化氢、氧化亚氮、甲醇等)。其中产生的甲烷和氮是近年来备受关注的排放物。
美国食品和农业组织最新研究结果表明，世界上大约14%的温室气体来自农业，而农业排放物中的很大一部分来自甲烷（CH4）。CH4是一种重要的生物源温室气体，源自生物的排放占大气CH4排放总量的70%左右。目前，全球大气中CH4平均浓度为1.7210-6μL/L，而且每年以1.1%的比率增长。CH4被认为是仅次于CO2引起全球变暖的重要气体，CH4在空气中的含量虽然低于CO2，但吸收值远高于CO2，单位体积CH4造成的温室效应是CO2的30倍，CH4对全球气候变暖的影响占到所有影响气候变暖因素作用的15%-20%，其增温潜势是CO2的62倍。反刍动物（奶牛等）是CH4的主要排放源之一，其瘤胃发酵产生的CH4以暖气形式排出体外，排放量占世界排放总量的15%-25%，据统计全球反刍动物每年约产生CH48107t，占全球人类活动CH4排放量的28%，而且每年还以1%的速度递增，同时，反刍动物在能量代谢过程中，因为CH4形式损失的能量占饲料总能GE的2%-15%，进而造成反刍动物对饲料能量利用率不高，生产成本增加。
我国地域辽阔,中草药资源十分丰富,因此在发展中草药添加剂方面具有巨大的潜力，如专利201210148043.5公开了一种降低育肥牛甲烷排放的饲料添加剂，主要利用的中草药原料有红三叶、杨树叶、碱蓬、五倍子、蒲公英、马齿苋等；专利201410527869.1公开了一种降低奶牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其中草药原料主要有当归、马齿苋、淫羊藿、路通草等。但当前中药饲料添加剂的研究水平较低，制作工艺简单粗糙，产品科技含量较低，质量不够稳定，诸如此类问题严重制约着中药饲料添加的推广应用。微生物发酵中药是对传统中药加工技术的改革和创新，具有诸多特点和优势，如专利201510036906.3公开了米曲霉作为肉牛肠道粪便甲烷抑制剂的应用。将此技术引入中药饲料添加剂的研究，可使其科技含量大幅提升，效果更加显著，质量更加稳定，效益更加明显，可以显著提高机体免疫力，增强牛抵抗疾病的水平，对于解决当前牛养殖的多种问题有着重要的应用价值。利用微生物发酵技术来加工中草药，可使其主要活性物质多糖、皂甙、黄酮、酚酸、维生素、氨基酸等活性物质的含量显著提高，提高牛抗应激能力，提高营养消化吸收率，降低甲烷排放，这对于环境污染严重的牛养殖业显得尤为重要。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本申请提供一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，集成生物酶技术、混菌微生物发酵技术、中草药配伍应用技术等，研制开发出降低牛养殖过程中的甲烷排放量，提高养殖经济效益，保护养殖环境。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其特征在于所述中草药原料及质量配伍比例为：陈皮25～35份、牛膝20～30份、麦芽20～30份、川芎18～26份、柴胡10～20份、黄芪12～20份、鱼腥草8～15份、甘草5～10份。
最优的，中草药原料及质量配伍比例为：陈皮28份、牛膝26份、麦芽24份、川芎22.5份、柴胡17份、黄芪14.2份、鱼腥草11份、甘草8份。
上述中草药进行如下预处理：将去除杂质后的中草药准确配伍，粉碎过80-150目筛，备用。
本申请还提供一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂的制备方法，其特征在于采用混菌好氧发酵和混菌厌氧发酵二步发酵工艺，其中好氧发酵菌群包括黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌；厌氧发酵菌群包括嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌中的一种或几种的混合物。
上述好氧发酵菌群中黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌的用量比为1.5:2:1。
上述酵母菌可以是产朊假丝酵母、啤酒酵母、酿酒酵母、糖蜜酵母中一种或几种的混合菌；优选的，酵母菌的最佳菌种为产朊假丝酵母与糖蜜酵母的混合菌，其用量比为1:1。
优选的，所述厌氧发酵菌群最优菌群为嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌接种比例1:1:3的混合菌群。
上述黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的种子液制备方法为：将斜面或甘油管保藏菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
本申请还提供一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂具体的制备方法，包括如下步骤：
（1）配料：按照复方中草药80份、葡萄糖3份、玉米粉5份、麸皮5份、硫酸铵0.1份、尿素2份、磷酸二氢钾0.05份、硫酸镁0.03份的比例混合均匀，调整物料的含水量40%～50%，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
（2）好氧发酵：将活化好的黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌种子液按1.5:2:1的比例接种至培养基，总接种量为固体培养基的3～5wt%，拌匀后进行固体好氧发酵，定期搅拌，通风培养24～30h；
（3）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种厌氧发酵菌种，接种量为固体培养基的1.5～2wt%，厌氧发酵12～16h；
（4）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（5）加酶：按中草药质量比3～5%的比例加入纤维素酶，混合均匀；
（6）粉碎：将加酶后的物料用粉碎机60目过筛粉碎即得含酶中草药发酵饲料添加剂。
本发明提供一种降低奶牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，应用于牛生产中，可显著降低牛甲烷的排放量，同时能够显著提高影响消化率，提高机体免疫力，从而提高奶牛对饲料的能量利用水平和经济效益，有利于推进牛养殖绿色、健康可持续发展。
本发明提供一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，所述含酶发酵型中草药饲料添加剂产品在牛日粮中使用的质量比例为0.1～0.5%。
本发明提供一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）不同的中草药性味各异，功效存在着巨大的差异，不同的中草药组合后存在着复杂的相互作用关系，且中草药之间的配比比较密切，不同配比也将使君臣佐使关系发生实质性的变化，从而使复合中草药的关系发生实质性的改变。本申请遵循“活血行气、健胃消食、清热消毒、扶正补虚”的治则，以行血药牛膝和川芎为君药，以健脾理气药麦芽、陈皮为臣药，以清热解毒、杀菌消炎药柴胡、鱼腥草为佐药，以补益药黄芪、甘草为使药，通过中草药间的协同作用提升降低牛养殖过程中甲烷的排放。此外，试验结果表明，改变中草药的配伍比例会显著降低产品的降低甲烷排放效果，如将川芎的配伍比例增加到30份，在加工工艺相同的条件下，降低甲烷排放的作用效果下降29.57%；
（2）本申请利用好氧菌（黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌）和厌氧菌（嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌）共同发酵复方中草药制备具有降低甲烷排放的饲料添加剂，充分利用微生物菌种间的协同作用，打破细胞壁结构对中草药活性成分的束缚作用，并通过微生物间的协同代谢作用，使中草药活性成分发生结构转化，进一步提高其功效。其中：黑曲霉同化淀粉和纤维素的能力强，可将复方中草药的结构性碳水化合物降解为酵母可利用的单糖、双糖等单糖类物质，使酵母、芽孢杆菌、乳酸菌等得以良好的生长；酵母菌的存在可以通过快速繁殖增加产品的菌体蛋白，同时，酵母菌的快速繁殖使物料pH值下降，抑制包括沙门氏菌等致病菌的生长；枯草芽孢杆菌在高温发酵过程中具有较强的产蛋白酶能力，可以将大分子蛋白物质降解为养殖动物更易消化吸收的小分子量蛋白质、肽及氨基酸；嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌等厌氧菌的添加，能分解复方中草药中碳类物质形成带有酸香味的有机小分子化合物，使发酵中草药饲料添加剂产生酸香味，同时使发酵饲料提那家机中含有大量的益生菌，进入动物肠道后，对促进双歧杆菌等肠道益生菌的生产，抑制病害菌生长，恢复肠道菌群平衡，增强肠道免疫功能和生理功能具有重要作用；
（3）采用分段发酵，发酵菌株对温度、pH、通氧等要求不同，不同的反应控制条件，提高了菌体的生长速率，缩短了发酵时间，提升了生产效率，在本技术方案下，最长发酵时间为48h；
（4）发酵工艺条件温和，生产成本低，采用固体发酵，生产工艺简单，能耗低、无环境污染、投资小、易于规模化生产。
具体实施方式
实施例1
一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，具体工艺步骤包括：
（1）中草药配伍: 将去除杂质后的中草药按陈皮28份、牛膝26份、麦芽24份、川芎22.5份、柴胡17份、黄芪14.2份、鱼腥草11份、甘草8份准确配伍中草药原料；
（2）中草药预处理：将配伍后的中草药混合，粉碎过80-150目筛，备用；
（3）配料：按照复方中草药80份、葡萄糖3份、玉米粉5份、麸皮5份、硫酸铵0.1份、尿素2份、磷酸二氢钾0.05份、硫酸镁0.03份的比例混合均匀，调整物料的含水量40%～50%，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
（4）种子液制备：
黑曲霉的种子液的制备：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
酵母菌种子液制备：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
枯草芽孢杆菌种子液制备：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的种子液制备：将斜面或甘油管保藏菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
（5）好氧发酵：将活化好的黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌种子液按1.5:2:1的比例接种至培养基，总接种量为固体培养基的4wt%，拌匀后进行固体好氧发酵，定期搅拌，通风培养27h；所述酵母菌为产朊假丝酵母与糖蜜酵母的混合菌，用量比为1:1
（6）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种厌氧发酵菌种，接种量为固体培养基的1.8wt%，厌氧发酵14h；所述厌氧发酵菌群为嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌接种比例1:1:3的混合菌群；
（7）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（8）加酶：按中草药质量比4%的比例加入纤维素酶，混合均匀；
（9）粉碎：将加酶后的物料用粉碎机60目过筛粉碎即得含酶中草药发酵饲料添加剂。
实施例2
一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，具体工艺步骤包括：
（1）中草药配伍: 将去除杂质后的中草药按陈皮35份、牛膝30份、麦芽30份、川芎26份、柴胡20份、黄芪20份、鱼腥草15份、甘草10份准确配伍中草药原料；
（2）中草药预处理：将配伍后的中草药混合，粉碎过80-150目筛，备用；
（3）配料：按照复方中草药80份、葡萄糖3份、玉米粉5份、麸皮5份、硫酸铵0.1份、尿素2份、磷酸二氢钾0.05份、硫酸镁0.03份的比例混合均匀，调整物料的含水量40%～50%，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
（4）种子液制备：
黑曲霉的种子液的制备：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
酵母菌种子液制备：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
枯草芽孢杆菌种子液制备：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的种子液制备：将斜面或甘油管保藏菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
（5）好氧发酵：将活化好的黑曲霉、啤酒酵母、枯草芽孢杆菌种子液按1.5:2:1的比例接种至培养基，总接种量为固体培养基的4wt%，拌匀后进行固体好氧发酵，定期搅拌，通风培养27h；
（6）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种厌氧发酵菌种，接种量为固体培养基的1.8wt%，厌氧发酵14h；所述厌氧发酵菌群为嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌接种比例1:3的混合菌群
（7）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（8）加酶：按中草药质量比4%的比例加入纤维素酶，混合均匀；
（9）粉碎：将加酶后的物料用粉碎机60目过筛粉碎即得含酶中草药发酵饲料添加剂。
实施例3
一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，具体工艺步骤包括：
（1）中草药配伍: 将去除杂质后的中草药按陈皮25份、牛膝20份、麦芽20份、川芎18份、柴胡10份、黄芪12份、鱼腥草8份、甘草5份准确配伍中草药原料；
（2）中草药预处理：将配伍后的中草药混合，粉碎过80-150目筛，备用；
（3）配料：按照复方中草药80份、葡萄糖3份、玉米粉5份、麸皮5份、硫酸铵0.1份、尿素2份、磷酸二氢钾0.05份、硫酸镁0.03份的比例混合均匀，调整物料的含水量40%～50%，干湿标准以用手紧握刚好能滴出水为宜；
（4）种子液制备：
黑曲霉的种子液的制备：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
酵母菌种子液制备：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
枯草芽孢杆菌种子液制备：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的种子液制备：将斜面或甘油管保藏菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
（5）好氧发酵：将活化好的黑曲霉、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌种子液按1.5:2:1的比例接种至培养基，总接种量为固体培养基的4wt%，拌匀后进行固体好氧发酵，定期搅拌，通风培养27h；
（6）厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种厌氧发酵菌种，接种量为固体培养基的1.8wt%，厌氧发酵14h；所述厌氧发酵菌群为两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌接种比例1:3的混合菌群
（7）干燥：发酵结束后低温通风干燥；
（8）加酶：按中草药质量比4%的比例加入纤维素酶，混合均匀；
（9）粉碎：将加酶后的物料用粉碎机60目过筛粉碎即得含酶中草药发酵饲料添加剂。
实施例4 采用下述试验验证本发明的效果：
试验组采用添加了降低牛甲烷排放的饲料添加剂的精料（将降低牛甲烷排放的饲料添加剂（实施例1产品）以质量比0.3%的比例添加到奶牛精料中）喂养奶牛，对照组分为3组，其中1组为不添加降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂的精饲料饲喂，2组为添加了不完全降低牛甲烷排放的饲料添加剂的精料（将降低牛甲烷排放的饲料添加剂（实施例1产品，不含纤维素酶）以质量比0.3%的比例添加到奶牛精料中）喂养，3组为添加0.3%纤维素酶的精饲料饲喂。试验周期为30天；试验结果如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其特征在于，所述中草药原料及质量配伍比例为：陈皮25～35份、牛膝20～30份、麦芽20～30份、川芎18～26份、柴胡10～20份、黄芪12～20份、鱼腥草8～15份、甘草5～10份；上述中草药进行如下预处理：将去除杂质后的中草药准确配伍，粉碎过80-150目筛，备用；
所述含酶中草药发酵饲料添加剂通过如下步骤制备：
(1)配料：按照复方中草药80份、葡萄糖3份、玉米粉5份、麸皮5份、硫酸铵0.1份、尿素2份、磷酸二氢钾0.05份、硫酸镁0.03份的比例混合均匀，调整物料的含水量40％～50％，干湿标准为用手紧握刚好能滴出水；
(2)好氧发酵：将活化好的黑曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌种子液按1.5:2:1的比例接种至培养基，总接种量为固体培养基的3～5wt％，拌匀后进行固体好氧发酵，定期搅拌，通风培养24～30h；
(3)厌氧发酵：好氧发酵后停止通风，2h后接种厌氧发酵菌种，接种量为固体培养基的1.5～2wt％，厌氧发酵12～16h；所述厌氧发酵菌种为嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌接种比例1:1:3的混合菌种；
(4)干燥：发酵结束后低温通风干燥；
(5)加酶：按中草药质量比3～5％的比例加入纤维素酶，混合均匀；
(6)粉碎：将加酶后的物料用粉碎机60目过筛粉碎即得含酶中草药发酵饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其特征在于所述中草药原料及质量配伍比例为：陈皮28份、牛膝26份、麦芽24份、川芎22.5份、柴胡17份、黄芪14.2份、鱼腥草11份、甘草8份。
3.根据权利要求1所述的一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其特征在于所述酵母菌是产朊假丝酵母、啤酒酵母、酿酒酵母、糖蜜酵母中一种或几种的混合菌。
4.根据权利要求3所述的一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其特征在于所述酵母菌为产朊假丝酵母与糖蜜酵母的混合菌，其用量比为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其特征在于发酵菌种的种子液制备方法为：
(1)所述黑曲霉的种子液的制备方法为：在无菌条件下，采用土豆培养基在35～40℃条件下培养24h，制得黑曲霉种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
(2)所述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YPD斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mL PDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
(3)所述枯草芽孢杆菌种子液制备方法为：在无菌条件下，采用LB培养基在28～32℃条件下培养24h，制得液体芽孢杆菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；
(4)所述嗜热链球菌、两歧双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的种子液制备方法为：将斜面或甘油管保藏菌种接种至MRS培养基中，37℃静置培养20～30h得到一级种子液；然后将一级种子液接种到10L的玻璃瓶种子发酵罐中，37℃发酵20～30h得到二级种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种降低牛甲烷排放的含酶中草药发酵饲料添加剂，其特征在于所述含酶中草药发酵饲料添加剂产品在牛日粮中使用的质量比例为0.1～0.5％。
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