CN108277188B - 一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂及其应用，所述复合微生物发酵剂包括复合菌体和载体；其中，所述复合菌体和载体的重量比为(1‑3):(5‑10)；所述复合菌体包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红曲霉的组合；本发明通过科学筛选活性菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到一种适用于制备断奶仔猪用发酵饲料的新型微生物发酵剂，将其适量添加到饲料原料中，调整发酵工艺流程，最终制备得到质量安全稳定且营养均衡的新型生物发酵饲料，成品质量安全稳定营养均衡，可显著提高断奶仔猪的生长性能，降低饲养成本，提高经济效益。

Description

一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，主要涉及一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂及其应用。
背景技术
我国的养猪业历史悠久，在世界养猪业生产中具有举足轻重的地位，猪肉仍是世界最普及的肉食品，中国是世界上人口最多的国家，也是产肉大国，为满足市场需求，利用猪的杂食性，猪饲料的要求相对不高，我国的饲料业是近几年兴盛的产业，随着动物营养、饲料科学水平的发展与提高，饲料业得到不断深入的发展，现在市场上的猪饲料产品品种繁多，养猪科学技术发展迅速，猪的营养均衡及生长发育状况与猪饲料有直接的关联，生猪养殖是我国畜禽类养殖的重要组成部分，而仔猪质量的好坏、生长的快慢直接关系到猪的出栏时间和出肉量。
随着养猪业的集约化、规模化发展，哺乳仔猪的腹泻发病率越来越高，尤其是仔猪黄白痢，发病率和死亡率都很高，给养殖业造成了很大的经济损失。抗生素一直是预防和治疗仔猪黄白痢最主要的途径，抗生素在一定程度上抑制了肠道内的病原菌的生长，但同时也抑制了正常菌群发挥作用，长期使用也易引起消化道疾病。近年来，由于抗生素的滥用导致的一系列严重威胁人类健康的问题引起了人们的广泛关注，因此无抗养殖是大势所趋。
CN103283961A涉及一种富含小肽、γ-氨基丁酸(GABA)、还原糖、植物乳杆菌和抗菌肽的益生型发酵豆粕的制备方法，该发明利用米曲霉、红曲霉、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌等菌种，以两阶段固态发酵法，得到益生型发酵豆粕中的小肽、游离氨基酸、还原糖、GABA和植物乳杆菌活菌数含量高，小肽达8.01-18％，游离氨基酸80-300mg/g，还原糖达20-80mg/g，GABA达0.317-0.5mg/g，植物乳杆菌活菌数达2-6.5×1010cfu/g，抗菌肽抑菌效价达2.0×103-7.0×104IU/g，益生型发酵豆粕的收率为82.03-90％。CN106819481A公开了一种用于仔猪教槽的全价发酵饲料，该全价发酵饲料由发酵基料经复合活菌制剂发酵而成；所述发酵基料由以下重量百分比的原料制成：发酵豆粕4-6％，膨化大豆8-12％，豆粕10-14％，血浆蛋白1-3％，豆油2-4％，玉米30-36％，膨化玉米18-22％，乳清粉8-12％，预混料4-6％；所述复合活菌制剂由植物乳杆菌、戊糖片球菌PP、枯草芽孢杆菌、布拉氏酵母菌、啤酒酵母菌、产朊假丝酵母和丁酸梭菌组成，该发明的全价发酵饲料能够显著提高饲料诱食性，使乳仔猪开口期提前；能够显著改善适口性，促进采食，提高采食量，并能够显著提高饲料消化吸收利用率；还能够优化肠道菌群，防治乳仔猪腹泻，有效降低腹泻率。但上述现有技术所述发酵饲料的制备工艺繁琐，对生产设备要求高，要求大量不同的发酵菌种，不利于推广应用。
综上所述，研发一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂并用于制备质量稳定营养均匀的生物发酵饲料，从而提高断奶仔猪的生长性能并预防腹泻，具有广阔的市场前景和应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足和市场需求，本发明提供了一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂及其应用，通过研究断奶仔猪的自身特点和生长需求，科学筛选发酵菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到一种断奶仔猪用微生物发酵剂，将其适量添加到饲料原料中，调整发酵工艺流程，最终制备得到质量安全稳定且营养均衡的断奶仔猪用生物发酵饲料，成品质量安全稳定营养均衡，可显著提高断奶仔猪的生长性能，降低饲养成本，提高经济效益。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂，所述发酵剂包括复合菌体和载体；
其中，所述复合菌体和载体的质量比为(1-3):(5-10)，例如可以是1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、2:5、2:7、1:4、2:9、3:5、1:2、3:7、3:8、1:3或3:10。
所述复合菌体包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红曲霉的组合。
发明人在长期生产实践过程中，充分研究断奶仔猪生长的营养需求和肠道菌群的菌种结构，对多种发酵菌种进行科学筛选，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到第一方面所述的断奶仔猪用新型复合微生物发酵剂，该发酵剂发酵得到的饲料营养均衡，能显著提高断奶仔猪的生长性能并减少腹泻。
优选地，所述载体包括稻壳粉和/或石粉。
优选地，所述枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BFC1601，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.13131，保藏日期为2016年10月21日。
所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)BFC1602，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.13132，保藏日期为2016年10月21日。
所述红曲霉，命名为红曲霉(Monascus sp)BFC170401，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.15088，保藏日期为2017年12月26日。
优选地，所述复合菌体中植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红曲霉为(2-4):(1-3):(3-7)，以菌落形成单位计，例如可以是2:1:3、2:3:7、4:1:3、4:1:7、2:3:3或4:3:7。
优选地，所述发酵剂中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红曲霉的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
本发明中，发酵剂的制备方法包括如下步骤：将植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红曲霉分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，将植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红曲霉按比例混合，得到复合菌体，将复合菌体混合物与石粉按按比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红曲霉的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的发酵剂用于制备断奶仔猪用饲料和/或饲料辅料。
第三方面，本发明提供一种采用第一方面所述的发酵剂发酵得到的断奶仔猪用饲料。
优选地，所述饲料按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米14-18％、菜籽粕5-8％、花生粕3-6％、味精蛋白2-7％、玉米麸质饲料4-8％、玉米胚芽粕22-26％、米糠15-23％、小麦麸5-11％、糖蜜2-5％、石粉1-5％，余量为水。
优选地，所述玉米的重量百分比为14-18％，例如可以是14％、15％、16％、17％或18％。
优选地，所述菜籽粕的重量百分比为5-8％，例如可以是5％、6％、7％或8％。
优选地，所述花生粕的重量百分比为3-6％，例如可以是3％、4％、5％或6％。
优选地，所述味精蛋白的重量百分比为2-7％，例如可以是2％、3％、4％、5％、6％或7％。
优选地，所述麸质饲料的重量百分比为4-8％，例如可以是4％、5％、6％、7％或8％。
优选地，所述玉米胚芽粕的重量百分比为22-26％，例如可以是22％、23％、24％、25％或26％。
优选地，所述米糠的重量百分比为15-23％，例如可以是15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％或23％。
优选地，所述小麦麸的重量百分比为5-11％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％或11％。
优选地，所述糖蜜的重量百分比为2-5％，例如可以是2％、3％、4％或5％。
优选地，所述石粉的重量百分比为1-5％，例如可以是1％、2％、3％、4％或5％。
优选地，所述复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.1-0.3％，例如可以是0.1％、0.2％或0.3％，优选为0.1％。
第四方面，本发明提供一种制备如第三方面所述饲料的方法，包括如下步骤：
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，活化后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合得到原料粉末；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌成菌料混合物，进行发酵。
优选地，步骤(1)所述活化的温度为34-36℃，例如可以是33℃、34℃或35℃，优选为35℃。
优选地，步骤(1)所述活化的时间为0.5-1h，例如可以是0.5h、0.8h或1h。
优选地，步骤(2)所述过筛的孔径为1.5-2.5mm，例如可以是1.5mm、2.0mm或2.5mm，优选为2mm。
优选地，步骤(2)所述混合的时间为1-3min，例如可以是1min、2min、或3min。
优选地，步骤(3)所述搅拌的时间为0.5-3min，例如可以是0.5min、1min、2min或3min。
优选地，步骤(3)所述纯净水、糖蜜、种子液的比例为25:2:5。
优选地，步骤(4)所述搅拌的时间为3-5min，例如可以是3min、4min或5min。
优选地，步骤(4)所述发酵的温度为25-30℃，例如可以是25℃、28℃或30℃。
优选地，步骤(4)所述发酵的时间为3-7天，例如可以是3天、4天、5天、6天或7天。
作为优选技术方法，一种制备如第三方面所述饲料的方法，具体包括如下步骤：
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，34-36℃活化0.5-1h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合1-3min得到原料粉末，过筛的孔径为1.5-2.5mm；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌0.5-3min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌3-5min成菌料混合物，25-30℃发酵3-7天。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的断奶仔猪用微生物发酵剂通过科学筛选发酵菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到断奶仔猪用微生物发酵剂，该发酵剂发酵得到的饲料营养均衡，可显著提高断奶仔猪生长性能，并对断奶仔猪肠道健康具有改善作用，可明显降低断奶仔猪腹泻率和改善肠道pH；提高了断奶仔猪新陈代谢机能，并提高肠道挥发性脂肪酸水平，进而改善肠道的菌群状况和营养状况，降低饲养成本，提高经济效益。
(2)本发明提供的发酵饲料的原料廉价易得，生产设备投入成本低，生产工艺简单，便于产业化。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
制备发酵剂
将植物乳杆菌BFC1602(CGMCC No.13132)、枯草芽孢杆菌BFC1601(CGMCCNo.13131)和红曲霉BFC1704(CGMCC No.15088)分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH 6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，按植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红曲霉为2:1:3的比例混合，得到复合菌体，将复合菌体混合物与稻壳粉按1:5比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红曲霉的活菌数≥5.0×1010CFU/g；
制备生物发酵饲料
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，35℃活化0.5h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合1min得到原料粉末，过筛的孔径为2mm；
按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米16％、菜籽粕6％、花生粕5％、味精蛋白4％、玉米麸质饲料6％、玉米胚芽粕24％、米糠19％、小麦麸8％、糖蜜4％、石粉3％，余量为水；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌0.5min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌3min成菌料混合物，25℃发酵3天，得到生物发酵饲料，成品营养成分见表1；
表1生物发酵饲料营养成分
项目 含量(％)
水分，％ 25.0
粗灰分，％ ≤7.0
粗蛋白，％ ≥18.0
酸溶蛋白，％ ≥7.5
粗脂肪，％ 3.1
粗纤维，％ ≤5.0
总磷，％ 0.60
钙，％ 1.0
pH 3.8-4.6
实施例2
制备发酵剂
将植物乳杆菌BFC1602(CGMCC No.13132)、枯草芽孢杆菌BFC1601(CGMCCNo.13131)和红曲霉BFC1704(CGMCC No.15088)分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH 6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，按植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红曲霉为4:3:7的比例混合，得到复合菌体，将复合菌体混合物与稻壳粉按3:10比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红曲霉的活菌数≥5.0×1010CFU/g；
制备生物发酵饲料
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，36℃活化1h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合3min得到原料粉末，过筛的孔径为2.5mm；
按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米14％、菜籽粕5％、花生粕3％、味精蛋白2％、玉米麸质饲料4％、玉米胚芽粕22％、米糠15％、小麦麸5％、糖蜜2％、石粉1％，余量为水；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5比例混合，搅拌3min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌5min成菌料混合物，30℃发酵7天，得到生物发酵饲料，营养成分与实施例1相似。
实施例3
制备发酵剂
将植物乳杆菌BFC1602(CGMCC No.13132)、枯草芽孢杆菌BFC1601(CGMCCNo.13131)和红曲霉BFC1704(CGMCC No.15088)分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或pH 6.8的磷酸缓冲液重悬菌体，按植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红曲霉为2:3:3的比例混合，复合菌体混合物与石粉按2:7比例混合低温干燥制得发酵剂，其中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109CFU/g，红曲霉的活菌数≥5.0×1010CFU/g；
制备生物发酵饲料
(1)称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，34℃活化0.8h后作为种子液备用；
(2)按配方量称取原料，粉碎过筛后混合2min得到原料粉末，过筛的孔径为1.5mm；
按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米18％、菜籽粕8％、花生粕6％、味精蛋白7％、玉米麸质饲料8％、玉米胚芽粕26％、米糠23％、小麦麸11％、糖蜜5％、石粉5％，余量为水；
(3)将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5比例混合，搅拌2min后作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中搅拌4min成菌料混合物，28℃发酵5天，得到生物发酵饲料，营养成分与实施例1相似。
实施例4
与实施例1相比，除了采用植物乳杆菌CGMCC No.5297(已公开在CN104877986A中)、枯草芽孢杆菌CGMCC No.6088(已公开在CN104195061A中)和红曲霉CGMCC No.4618(已公开在CN102199544A中)进行发酵外，其他条件与实施例1相同。
对比例1
与实施例1相比，除发酵剂中不含有植物乳杆菌外，其他条件与实施例1相同。
对比例2
与实施例1相比，除发酵剂中不含有枯草芽孢杆菌外，其他条件与实施例1相同。
对比例3
与实施例1相比，除发酵剂中不含有红曲霉外，其他条件与实施例1相同。
对比例4
与实施例1相比，除发酵剂中三种菌种的比例改为1:1:1外，其他条件与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，除复合菌体和载体的质量比改为1:1外，其他条件与实施例1相同。
对比例5
与实施例1相比，除复合菌体添加量为原料总量的0.05％外，其他条件与实施例1相同。
对比例6
与实施例1相比，除复合菌体添加量为原料总量的0.5％外，其他条件与实施例1相同。
对比例7
与实施例1相比，除了采用膨润土载体外，其他条件与实施例1相同。
断奶仔猪饲喂评价
试验方案设计：选取480头28d断奶的初始体重相近(9.5kg)健康杜×长×大三元杂交猪，公母各半，分12个处理组，即一个对照组和11个试验组，其中试验组即实施例1-4和对比例1-7的11个小组，每组4个重复，每个重复10头猪，试验期为29天。试验时间分为两个阶段，预试期和正试期，预饲养为期3天。其中对照组正常饲喂基础日粮，试验组饲喂包含实施例和对比例得到的生物发酵饲料的试验粮(配方见表2)，试验在生物饲料开发国家工程研究中心生猪养殖示范基地进行。
表2基础日粮和试验日粮配方
Figure BDA0001628605460000131
饲养管理：饲养管理按照示范基地现行方案执行。试验猪饲养于保育舍内，每个保育床为1个重复，每天喂料3次(早中晚各一次，投放饲料充足，确保采食后有剩余)并称重计算采食量，自动饮水器自由饮水，保证通风换气，室内温度保持在28℃，免疫程序按养殖场内常规进行。在预饲期间，每日统计饲料消耗和健康状况，掌握仔猪采食量变化，同时观察猪的行为和健康状况。分别于试验开始第1天、14天以及试验结束的29天称重，并按公式饲料消耗量。
样品采集：在试验结束前一天以保育床为单位对仔猪进行微生物粪样采集，采集保育床下四角粪便，混合均匀后装入10mL灭菌离心管，立即放入冰盒保存；试验结束时，从每个重复中各取1头体况正常的仔猪，进行前腔静脉采血10mL。静置，3000r/min离心，10min，将离出血清放入新离心管中，并标上序号，于-20℃冷冻保存。于正试期的最后一天，各重复随机挑1头断奶仔猪，无菌厌氧收集直肠内容物，将其放入50mL无菌螺口管中，并迅速放入-20℃冰箱保存。取2g左右粪便转入离心管内，加入2倍超纯水混合均匀，以10,000r/min、4℃离心15min，取上清液分装于2个EP管中，作为挥发性脂肪酸样品；在试验最后一天以保育床为单位对仔猪进行屠宰，剖腹取肠段(分别为十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)，两头结扎，立即带回实验室检测。于超净工作台上称取1g肠内容物于无菌试管中，加入灭菌生理盐水9mL，用涡旋振荡器振荡30s，此为10-1，依次进行10-3-10-7稀释。
测定指标：
(1)平均日増重：试验猪初始体重和结束时终末体重，分别于试验开始和结束，早上空腹称重，计算平均日增重公式：平均日増重(g)＝(试验猪结束体重－试验猪初始体重)/试验天数，结果见表3所示；
表3生物发酵饲料对断奶仔猪平均日增重的影响
组别 平均日增重(g/d) 组别 平均日增重(g/d)
对照组 160.2±3.3<sup>b</sup> 对比例2 168.0±3.3<sup>b</sup>
实施例1 182.7±5.0<sup>a</sup> 对比例3 163.1±3.1<sup>b</sup>
实施例2 181.7±4.0<sup>a</sup> 对比例4 170.2±3.0<sup>b</sup>
实施例3 182.5±3.0<sup>a</sup> 对比例5 172.2±2.0<sup>b</sup>
实施例4 180.0±1.0<sup>a</sup> 对比例6 173.0±3.4<sup>b</sup>
对比例1 165.2±1.3<sup>b</sup> 对比例7 175.1±3.3<sup>b</sup>
注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)；下表同。
(2)平均日采食量：每天记录各栏猪饲料投放量和回收剩余量，计算每栏每天采食量，并记录猪的死淘数和发病等情况。计算日采食量公式：平均日采食(kg)＝(试验投料量－试验剩余料量)/(试验天数×头数)，结果见表4所示；
表4生物发酵饲料对断奶仔猪平均日采食量的影响
Figure BDA0001628605460000151
注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)；下表同。
(3)料肉比：各栏总的饲料消耗量与总的增重为基础，计算料肉比公式：料肉比＝每栏总采食量/每栏总增重×每栏猪数量×试验天数，结果见表5所示；
表5生物发酵饲料对断奶仔猪料重比的影响
Figure BDA0001628605460000152
Figure BDA0001628605460000161
由表3-表5分析结果表明，与对照组相比，实施例1-4的平均日增重、平均日采食量显著提高(P<0.05)，料重比降低，其中，实施例1的平均日增重和平均日采食量提高最多，分别达到182.7±5.0a和587.5±10.4a，而料重比降低最显著，低至3.22±0.25，实施例4采用其他保藏编号的发酵菌株，也有明显效果，但略差于本发明提供的特定菌株。而对比例1-3中发酵菌株缺少任何一种，或对比例4-7中不采用本发明提供的菌种配比、复合菌体添加量及特定载体，其效果均不理想。仔猪肠道微生物区系随宿主日龄增加形成了一个相对稳定的微生态系统，对宿主的生长起着重要作用。
(4)将粪便在无菌条件下取出1g到灭菌离心管中，加入等量的生理盐水，混匀后进行梯度稀释，取稀释液100μL分别在MRS和麦康凯以及SS平板上涂板，置于37℃，乳酸菌培养48h，大肠杆菌培养24h，进行菌落计数，每组做10个平行，结果见表6、表7和表8所示；
表6生物发酵饲料对断奶仔猪乳酸菌的影响
Figure BDA0001628605460000162
Figure BDA0001628605460000171
表7生物发酵饲料对断奶仔猪大肠杆菌的影响
组别 大肠杆菌E.Coli 组别 大肠杆菌E.Coli
对照组 6.74±0.15<sup>a</sup> 对比例2 6.62±0.25<sup>a</sup>
实施例1 6.05±0.20<sup>b</sup> 对比例3 6.53±0.23<sup>a</sup>
实施例2 6.12±0.10<sup>b</sup> 对比例4 6.45±0.10<sup>a</sup>
实施例3 6.30±0.22<sup>b</sup> 对比例5 6.43±0.14<sup>a</sup>
实施例4 6.38±0.25<sup>b</sup> 对比例6 6.40±0.85<sup>a</sup>
对比例1 6.54±0.15<sup>a</sup> 对比例7 6.40±0.15<sup>a</sup>
表8生物发酵饲料对断奶仔猪沙门氏菌的影响
Figure BDA0001628605460000172
由表6-表8分析结果表明，发酵饲料对仔猪粪便中乳酸菌和大肠杆菌具有显著性影响，其中实施例1-4的仔猪粪便中乳酸菌的数量显著高于对照组(P<0.05)，大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05)，沙门氏菌数量也低于对照组，但差异不显著，其中，实施例1的效果最显著，实施例4采用其他保藏编号的发酵菌株，也有明显效果，但略差于本发明提供的特定菌株。而对比例1-3中发酵菌株缺少任何一种，或对比例4-7中不采用本发明提供的菌种配比、复合菌体添加量及特定载体，其效果均不理想。因此高效生物发酵饲料组较不发酵组能明显降低胃肠道的有害细菌数量，提高了日粮的适口性，增加了采食量。
(5)腹泻率＝腹泻头次数/(仔猪头数×试验天数)×100％，结果见表9所示；
表9生物发酵饲料对断奶仔猪腹泻率的影响
组别 腹泻率 组别 腹泻率
对照组 15.47±0.59<sup>a</sup> 对比例2 9.70±0.23<sup>b</sup>
实施例1 4.80±0.25<sup>b</sup> 对比例3 10.60±0.05<sup>b</sup>
实施例2 4.83±0.20<sup>b</sup> 对比例4 8.10±0.05<sup>b</sup>
实施例3 4.87±0.35<sup>b</sup> 对比例5 7.20±0.22<sup>b</sup>
实施例4 4.85±0.41<sup>b</sup> 对比例6 8.30±0.55<sup>b</sup>
对比例1 8.80±0.15<sup>b</sup> 对比例7 6.50±0.21<sup>b</sup>
由表9分析结果表明，与对照組相比，实施例1-4的仔猪腹泻率显著降低(P<0.05)，其中，实施例1的效果最显著，腹泻率低至4.80±0.25b，实施例4采用其他保藏编号的发酵菌株，也有明显效果，但略差于本发明提供的特定菌株。而对比例1-3中发酵菌株缺少任何一种，或对比例4-7中不采用本发明提供的菌种配比、复合菌体添加量及特定载体，其效果均不理想，表明高效生物发酵饲料中的益生菌通过在黏膜表面定植，与其发生相互作用，可以有效刺激免疫反应，把病原菌从肠道上排斥出去。大量研究证实，当有益菌进入猪体内后，可以影响猪的免疫功能，增强自身免疫力，增加肠道黏膜对外界的抵抗力。
(6)仔猪肠道pH的测定：取仔猪各肠段内容物0.5g放入装有4.5mL灭菌蒸馏水的试管中，在微量振荡器上震荡20min，用PHS-3C酸度计进行pH的测定，结果见表10-表14所示；
表10生物发酵饲料对断奶仔猪胃pH的影响
组别 胃 组别 胃
对照组 4.31±0.68<sup>a</sup> 对比例2 4.29±0.30<sup>b</sup>
实施例1 3.69±0.42<sup>b</sup> 对比例3 4.01±0.12<sup>b</sup>
实施例2 3.70±0.40<sup>b</sup> 对比例4 3.99±0.02<sup>b</sup>
实施例3 3.75±0.22<sup>b</sup> 对比例5 3.90±0.41<sup>b</sup>
实施例4 3.79±0.31<sup>b</sup> 对比例6 3.92±0.22<sup>b</sup>
对比例1 4.19±0.42<sup>b</sup> 对比例7 3.89±0.35<sup>b</sup>
表11生物发酵饲料对断奶仔猪空肠pH的影响
组别 空肠 组别 空肠
对照组 6.62±0.74 对比例2 6.45±0.72
实施例1 6.25±0.76 对比例3 6.56±0.16
实施例2 6.28±0.73 对比例4 6.45±0.56
实施例3 6.24±0.56 对比例5 6.45±0.81
实施例4 6.29±0.19 对比例6 6.35±0.36
对比例1 6.55±0.76 对比例7 6.30±0.43
表12生物发酵饲料对断奶仔猪回肠pH的影响
Figure BDA0001628605460000191
Figure BDA0001628605460000201
表13生物发酵饲料对断奶仔猪结肠pH的影响
组别 结肠 组别 结肠
对照组 6.70±0.61<sup>a</sup> 对比例2 6.68±0.07<sup>b</sup>
实施例1 6.28±0.77<sup>b</sup> 对比例3 6.64±0.37<sup>b</sup>
实施例2 6.29±0.67<sup>b</sup> 对比例4 6.48±0.57<sup>b</sup>
实施例3 6.31±0.71<sup>b</sup> 对比例5 6.59±0.41<sup>b</sup>
实施例4 6.33±0.50<sup>b</sup> 对比例6 6.47±0.50<sup>b</sup>
对比例1 6.62±0.77<sup>b</sup> 对比例7 6.35±0.70<sup>b</sup>
表14生物发酵饲料对断奶仔猪盲肠pH的影响
组别 盲肠 组别 盲肠
对照组 6.33±0.65 对比例2 6.31±0.14
实施例1 6.27±0.74 对比例3 6.30±0.02
实施例2 6.29±0.71 对比例4 6.30±0.74
实施例3 6.28±0.24 对比例5 6.31±0.04
实施例4 6.29±0.79 对比例6 6.30±0.20
对比例1 6.32±0.70 对比例7 6.30±0.54
猪胃肠道的酸度是影响其消化性能的重要因素，适宜的酸度是仔猪实现正常消化功能的关键。由表10-表14分析结果表明，实施例1的断奶仔猪胃、回肠和结肠食糜pH值均明显低于对照组(P<0.05)，分别降低了16.8％、8.6％和6.7％，空肠和盲肠中食糜pH也有降低的趋势，实施例4采用其他保藏编号的发酵菌株，也有明显效果，但略差于本发明提供的特定菌株。而对比例1-3中发酵菌株缺少任何一种，或对比例4-7中不采用本发明提供的菌种配比、复合菌体添加量及特定载体，其效果均不理想。
(7)采用全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶(ALP)、谷草转氨酶(AST)活性以及葡萄糖(GLU)、尿素氮(UN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLB)含量，结果见表15-表21所示；
表15生物发酵饲料对断奶仔猪碱性磷酸酶的影响
Figure BDA0001628605460000211
表16生物发酵饲料对断奶仔猪谷草转氨酶的影响
Figure BDA0001628605460000212
Figure BDA0001628605460000221
表17生物发酵饲料对断奶仔猪尿素氮的影响
Figure BDA0001628605460000222
表18生物发酵饲料对断奶仔猪葡萄糖的影响
Figure BDA0001628605460000223
Figure BDA0001628605460000231
表19生物发酵饲料对断奶仔猪总蛋白的影响
组别 总蛋白TP/(g/L) 组别 总蛋白TP/(g/L)
对照组 53.08±2.37<sup>b</sup> 对比例2 58.05±3.20<sup>a</sup>
实施例1 62.25±3.00<sup>a</sup> 对比例3 57.23±4.00<sup>a</sup>
实施例2 61.24±2.10<sup>a</sup> 对比例4 58.26±3.02<sup>a</sup>
实施例3 62.05±3.03<sup>a</sup> 对比例5 58.75±3.30<sup>a</sup>
实施例4 60.00±5.40<sup>a</sup> 对比例6 57.00±1.00<sup>a</sup>
对比例1 56.20±3.00<sup>a</sup> 对比例7 59.25±5.01<sup>a</sup>
表20生物发酵饲料对断奶仔猪白蛋白的影响
组别 白蛋白ALB/(g/L) 组别 白蛋白ALB/(g/L)
对照组 30.09±1.31<sup>b</sup> 对比例2 31.20±2.31<sup>b</sup>
实施例1 36.14±1.22<sup>a</sup> 对比例3 32.00±3.30<sup>b</sup>
实施例2 34.66±1.32<sup>a</sup> 对比例4 32.01±4.01<sup>b</sup>
实施例3 35.24±4.20<sup>a</sup> 对比例5 32.03±1.31<sup>b</sup>
实施例4 34.17±3.00<sup>a</sup> 对比例6 32.05±2.01<sup>b</sup>
对比例1 31.19±1.01<sup>b</sup> 对比例7 33.06±5.31<sup>b</sup>
表21生物发酵饲料对断奶仔猪球蛋白的影响
Figure BDA0001628605460000232
Figure BDA0001628605460000241
葡萄糖是机体代谢的能量物质，即是机体内重要性能量单糖，是支撑动物机体生命活动的重要、快速应变供能的最有效的营养素。在一定范围内，葡萄糖在机体内的含量越高，代表机体利用葡萄糖合成代谢的能力越强。血清中碱性磷酸酶的活性可反映猪机体对蛋白质和脂类的代谢效率，同时可反映猪的生长速度和生长性能。谷草转氨酶是反映肝脏功能的重要标志。尿素氮含量能够准确反映动物机体对蛋白质代谢的吸收情况和饲粮中挥发性脂肪酸的平衡状况。血清中尿素氮的含量越低，表明机体对尿素氮沉积量越多，即能够有效将尿素氮转化合成机体蛋白，促进猪机体生长。血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白水平反映了机体对蛋白质吸收状况及体液免疫的关系。
表15-表21分析结果表明，与对照組相比，实施例1-4的碱性磷酸酶和谷草转氨酶显著提高(P<0.05)，尿素氮降低(P<0.05)，葡萄糖水平提高，总蛋白、白蛋白和球蛋白水平显著提高(P<0.05)；其中，实施例1的效果最好，实施例4采用其他保藏编号的发酵菌株，也有明显效果，但略差于本发明提供的特定菌株。而对比例1-3中发酵菌株缺少任何一种，或对比例4-7中不采用本发明提供的菌种配比、复合菌体添加量及特定载体，其效果均不理想。断奶仔猪消化道内含有大量微生物，能够发酵肠道中的碳水化合物，产生多种挥发性脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸，这些小分子的挥发性脂肪酸对肠道健康具有保护作用，挥发性脂肪酸可作为能源利用，抑制有害菌的生长，促进肠上皮细胞的增殖及黏膜的生长。
(8)取离心粪便上清液1.5mL，加入0.2mL 8.2％偏磷酸，混合均匀，水浴30min，10,000r/min、4℃离心10min，取上清液，采用气相色谱仪测定粪便中乙酸、丙酸和丁酸含量。
数据处理：采用SPSS18.0进行单因子方差分析。结果以平均值±标准差表示，以P<0.05为判断显著性的标准，结果见表22-表24所示；
表22生物发酵饲料对断奶仔猪肠道乙酸的影响
组别 乙酸 组别 乙酸
对照组 25.91±3.02<sup>b</sup> 对比例2 26.50±4.02<sup>b</sup>
实施例1 30.88±2.59<sup>a</sup> 对比例3 26.31±5.02<sup>b</sup>
实施例2 28.90±3.58<sup>a</sup> 对比例4 27.21±6.02<sup>b</sup>
实施例3 29.72±1.69<sup>a</sup> 对比例5 27.50±4.02<sup>b</sup>
实施例4 28.03±2.50<sup>a</sup> 对比例6 27.42±5.02<sup>b</sup>
对比例1 26.01±4.02<sup>b</sup> 对比例7 27.91±3.02<sup>b</sup>
表23生物发酵饲料对断奶仔猪丙酸的影响
组别 丙酸 组别 丙酸
对照组 8.82±0.73<sup>b</sup> 对比例2 8.93±0.53<sup>b</sup>
实施例1 12.63±0.65<sup>a</sup> 对比例3 8.97±0.71<sup>b</sup>
实施例2 12.01±0.64<sup>a</sup> 对比例4 8.99±0.63<sup>b</sup>
实施例3 11.53±0.55<sup>a</sup> 对比例5 9.22±0.13<sup>b</sup>
实施例4 10.72±0.30<sup>a</sup> 对比例6 9.72±0.74<sup>b</sup>
对比例1 8.92±0.63<sup>b</sup> 对比例7 9.81±0.53<sup>b</sup>
表24生物发酵饲料对断奶仔猪丁酸的影响
组别 丁酸 组别 丁酸
对照组 3.90±0.31<sup>b</sup> 对比例2 4.91±0.15<sup>b</sup>
实施例1 6.99±0.28<sup>a</sup> 对比例3 4.93±0.51<sup>b</sup>
实施例2 6.77±0.18<sup>a</sup> 对比例4 5.95±0.33<sup>b</sup>
实施例3 6.86±0.23<sup>a</sup> 对比例5 5.94±0.40<sup>b</sup>
实施例4 6.65±0.54<sup>a</sup> 对比例6 5.90±0.02<sup>b</sup>
对比例1 4.90±0.35<sup>b</sup> 对比例7 6.00±0.11<sup>b</sup>
由表22-24分析结果表明，实施例1-4的仔猪肠道乙酸、丙酸和丁酸显著提高(P<0.05)，其中，实施例1的效果最好，实施例4采用其他保藏编号的发酵菌株，也有明显效果，但略差于本发明提供的特定菌株。而对比例1-3中发酵菌株缺少任何一种，或对比例4-7中不采用本发明提供的菌种配比、复合菌体添加量及特定载体，其效果均不理想。
综上所述，本发明针对断奶仔猪的自身特性及生长需求，通过科学筛选活性菌种，并将菌种与特定载体相混合，优化菌种配比和载体添加量，得到一种断奶仔猪用新型微生物发酵剂，将其适量添加到饲料原料中，调整发酵工艺流程，最终制备得到质量安全稳定且营养均衡的新型生物发酵饲料，三个菌种缺一不可，互相搭配，在特定比例配合下，同特定载体协同增效，成品可显著提高断奶仔猪的生长性能，降低饲养成本，提高经济效益。生物发酵饲料可显著提高仔猪生长性能，并对仔猪肠道健康具有改善作用；饲喂生物发酵饲料可明显降低断奶仔猪腹泻率和改善肠道pH；提高了仔猪新陈代谢机能，并提高肠道挥发性脂肪酸水平，进而改善肠道的菌群状况和营养状况，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.一种断奶仔猪用复合微生物发酵剂，其特征在于，所述复合微生物发酵剂由复合菌体和载体组成；
其中，所述复合菌体和载体的重量比为(1-3):(5-10)；
所述复合菌体由植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌和红曲霉组成；
所述枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）BFC1601，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.13131，保藏日期为2016年10月21日；
所述植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌（Lactobacillus Plantarum）BFC1602，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.13132，保藏日期为2016年10月21日；
所述红曲霉，命名为红曲霉Monascus sp. BFC170401，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏编号为CGMCC No.15088，保藏日期为2017年12月26日；
所述载体由稻壳粉和/或石粉组成；
所述复合菌体中植物乳杆菌：枯草芽孢杆菌：红曲霉为(2):(1-3):(3-7)，以菌落形成单位计。
2.根据权利要求1所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂中植物乳杆菌的活菌数≥3.0×1010 CFU/g，枯草芽孢杆菌的活菌数≥2.0×109 CFU/g，红曲霉的活菌数≥5.0×1010CFU/g。
3.一种如权利要求1-2中任一项所述发酵剂在制备断奶仔猪用饲料和/或饲料辅料中的应用。
4.一种断奶仔猪用饲料，其特征在于，采用如权利要求1-2中任一项所述的发酵剂发酵得到；
所述饲料按重量百分比主要由如下原料制备得到：
玉米14-18%、菜籽粕5-8%、花生粕3-6%、味精蛋白2-7%、玉米麸质饲料4-8%、玉米胚芽粕22-26%、米糠15-23%、小麦麸5-11%、糖蜜2-5%和石粉1-5%，余量为水；
所述复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.1-0.3%。
5.根据权利要求4所述的饲料，其特征在于，所述复合微生物发酵剂的添加量为原料总量的0.1%。
6.一种制备如权利要求4或5所述饲料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）称取发酵剂按1:50的比例溶解于纯净水中，活化后作为种子液备用；
（2）按配方量称取原料，粉碎过筛后混合得到原料粉末；
（3）将纯净水、糖蜜、种子液按25:2:5的比例混合，搅拌后作为菌液备用；
（4）将步骤（3）得到的菌液喷入步骤（2）得到的原料粉末中搅拌成菌料混合物，进行发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化的的温度为34-36℃；
步骤（1）所述活化的时间为0.5-1h；
步骤（2）所述过筛的孔径为1.5-2.5mm；
步骤（2）所述混合的时间为1-3min；
步骤（3）所述搅拌的时间为0.5-3min；
步骤（4）所述搅拌的时间为3-5min；
步骤（4）所述发酵的温度为25-30℃；
步骤（4）所述发酵的时间为3-7天。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化的的温度为35℃；
步骤（2）所述过筛的孔径为2mm。
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