CN106035988B - 一种畜禽用精氨酸活性肽粉的生产方法 - Google Patents
一种畜禽用精氨酸活性肽粉的生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种畜禽用精氨酸活性肽粉的生产方法。以精氨酸浓浆菌液湿粉、豆粕、玉米浆干粉为原料，以精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌为有益微生物菌群，四种微生物液体种子分别采用固体茄形扁瓶种子培养和发酵罐种子培养。固体与液体按比例均匀混合后，放置到发酵床上，经通入无菌空气进行有氧固体发酵，再经烘干、粉碎、过筛，得到畜禽用精氨酸活性肽粉。本发明具有发酵原料来源广泛、发酵工艺成熟、产品蛋白质含量高、精氨酸含量高、小肽转化率高、应用效果好等特点。本产品在猪、鸡、牛等畜禽养殖中应用，可以协调氨基酸代谢和促进蛋白质合成，可以提高动物机体免疫力、防病抗病能力、繁殖能力、生产性能和生长速度。
Description
技术领域
本发明涉及精氨酸发酵技术和微生物固体发酵技术，具体的说是一种畜禽用精氨酸活性肽粉的生产方法。
背景技术
我国是全球最大的畜牧业养殖国，也是全球最大的饲料生产国和消费国，据统计：2015年饲料生产总量22000万吨，占全球总量一半以上，其中，浓缩饲料2500万吨，添加剂和预混料650万吨。
近年来，人们膳食结构、消费观念随着生活水平的提高发生了巨大的改变，人们从吃的饱，吃的好，吃的精，到吃的安全，吃的健康。畜牧养殖行业和饲料生产行业，从数量型往质量型转变。不断的改革创新发展思路和发展模式，更加注重新饲料资源的开发利用，饲料的营养，饲料安全和食品的营养安全。促进我国饲料工业的可持续健康发展。
目前，在我国畜牧业养殖和饲料生产行业面临的问题是：缺蛋白、缺优质蛋白，缺品牌、缺品质安全的品牌，是我们为之努力的方向。
近年来，在研究和生产实践中，人们采用多种多样的方法来寻找新的蛋白质资源和改造提升现有的蛋白质资源。主要是从种子植物资源上，种植含蛋白质高的作物和植物，从繁殖率高的养殖动物里获取，从增殖快的微生物中获取，从藻类里获取等等。现有资源的提升，从用物理化学和微生物的方法来改造和获取。豆粕、麸皮、米糠为发酵原料，用微生物发酵法和酶解法生产氨基酸和小肽。众所周知，动物消化道吸收顺序是：小肽、氨基酸、蛋白质。蛋白质在消化道中最终产物大部分是小肽，少部分是氨基酸，在后期的发酵中，也会降解成肽类物质。小肽能够穿过动物的肠壁被吸收入循环系统，小肽比氨基酸更利于促进动物的消化吸收、生长发育和增强抗病抗力。
目前，精氨酸饲料添加剂在饲料中添加，国内外发展很不均衡，国外发展较快，美国已在高档的水产料和畜禽料中添加，日本是全球精氨酸生产量最多的国家，应用也是最为广泛的国家，医药、食品、保健品和饲料中都有添加。国内发展较慢，近年来，国内在医药、食品、保健品和饲料中也有添加。但总体看，国内的精氨酸饲料添加剂的应用处于雏形阶段，印遇龙院士研究表明：1、仔猪21天～28天补充0.4％精氨酸，28天～35天补充0.2％精氨酸，仔猪个体差异减小，平均日增重提高。2、仔猪21天断奶后，每天饲喂含精氨酸0.8％的饲料，可以有效的提高仔猪血清中精氨酸浓度，增强机体免疫力，提高抗菌、抗病毒能力，促进伤口的愈合等等。3、当仔猪补充1％精氨酸时，仔猪的十二指肠、空肠、回肠绒毛长度分别增加21％、28％、35％。精氨酸的生产厂家已经有五十多家，产量翻了100倍。
所以说，精氨酸饲料添加剂在畜牧养殖中应用有非常大的上升空间，目前，国内每年能有100万吨的需求量，产值可达百亿元以上，市场潜力巨大，市场前景非常广阔。
发明内容
本发明要解决的上述技术问题,提供一种畜禽用精氨酸活性肽粉的生产方法，以精氨酸浓浆菌液湿粉、豆粕、玉米浆干粉为原料，以精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌为有益微生物菌群，发酵原料中各种原料的重量比为；精氨酸浓浆菌液干粉20～30份、豆粕70～80份、玉米浆干粉10～20份；发酵原料与精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌种子液的重量比为，发酵原料100～120份:精氨酸产生菌20～30份、枯草芽孢杆菌5～10份、酿酒酵母菌5～10份、植物乳杆菌酵母菌5～10份；固体发酵在发酵床上进行，起始温度为20℃～30℃，发酵温度为30℃～60℃，发酵时间为100小时～120小时；发酵12小时，通风供氧风量为0.1～0.3V/V.min,发酵结束时有酵母酒香和乳酸味道产生。散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度60～80℃，出风温度30～40℃,流化时间8分钟～12分钟，含水量12.0％～15.0％，粉碎、过筛目数80目～100目，得到含水量≤10％的畜禽用精氨酸活性肽粉。
发酵结束时ph值为4.0～5.0，总酸为500～600°T；
发酵结束时产品粗蛋白50％～60％，其中含短链肽12.0％～20.0％以上(短链肽分子量为2000个道尔顿以下)、赖氨酸2.50％～3.50％、蛋氨酸0.50％～1.50％、苏氨酸1.50％～2.00％、色氨酸0.50％～1.00％、精氨酸3.00％～5.00％；谷氨酸5.50％～6.50％；
发酵原料中精氨酸浓浆菌液湿粉含水量20％～30％、豆粕含水量10％～15％、玉米浆干粉含水量10％～15％。
发酵原料中各种原料重量比为：精氨酸浓浆菌液干粉20份、豆粕70份、玉米浆干粉10份；
固体发酵过程中，发酵原料与微生物发酵菌群种子液的最佳重量比为，发酵原料100份:精氨酸产生菌20份、枯草芽孢杆菌5份、酿酒酵母菌5份、植物乳杆菌酵母菌5份；
四种微生物液体种子分别采用固体茄形扁瓶种子培养和液体发酵罐种子培养，所述精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌种子液中每毫升含活菌数为≥100个亿。酿酒酵母菌和植物种子液中每毫升含活菌数为≥50个亿；
发酵原料中精氨酸浓浆菌液湿粉含水量30％、豆粕含水量10％、玉米浆干粉含水量10％。
发酵结束时ph值为5.0，总酸为500°T；
发酵结束时产品粗蛋白52％，其中含短链肽12％以上(短链肽分子量为2000个道尔顿以下)、赖氨酸3.18％、蛋氨酸1.06％、苏氨酸1.26％、色氨酸0.63％、精氨酸3.26％；谷氨酸5.58；
固体发酵料在发酵床上通入无菌空气进行有氧发酵，起始含水量为36％，起始温度为25℃，发酵温度为50℃，发酵时间为100小时；供氧风量为0.3V/V.min,发酵结束时有酵母酒香和乳酸味道产生。物料散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度80℃，出风温度36℃,流化时间12分钟，含水量12.0％，粉碎、过筛目数100目，得到含水量≤10％的畜禽用精氨酸活性肽粉。
精氨酸产生菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0％～3.0％、谷氨酸1.0％～3.0％、玉米浆干粉2.0％～4.0％、硫酸铵0.05％～015％、硫酸镁0.05％～015％、磷酸氢二钾0.05％～015％，余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度30℃～32℃；时间24～48h。
枯草芽孢杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5％～1.0％、玉米浆干粉3.0％～3.5％、硫酸铵0.1％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.2％、磷酸氢二钾0.1％～0.2％，余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度30℃～32℃；时间48～64h。
酿酒酵母菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0％～3.5％、酵母粉2.0％～2.5％、玉米浆干粉2.0％～2.5％、硫酸铵0.1％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.2％、磷酸氢二钾0.1％～0.2％，余量为水,pH6.6～6.8；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度28℃～30℃；时间48～64h。
植物乳杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.0％、酵母粉1.0％～2.0％、玉米浆干粉1.0％～2.0％、硫酸铵0％～0.1％、硫酸镁0％～0.1％、磷酸氢二钾0％～0.1％，余量为水,pH6.4～6.6；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度33℃～35℃；时间48～64h(24小时后为静置培养)。
精氨酸产生菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、谷氨酸2.0％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.8；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度32℃；时间48h。
枯草芽孢杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度32℃；时间48h。
酿酒酵母菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉2.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.8；灭菌件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度28℃；时间48h。
植物乳杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉2.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.6；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10；罐压0.05MPa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度35℃；时间48h(24小时后为静置培养)。
本发明属规模化生产，液体发酵中，生产精氨酸采用5吨发酵罐1个，生产芽孢菌、酵母菌、乳酸菌采用1.0吨发酵罐3个；固体发酵中，采用履带式自动混料接菌、铺料、发酵、传输；烘干设备中采用负压流化床，计量、包装采用自动化程序化控制。
精氨酸产生菌主要是黄色短杆菌(Brevibacterium flavums)、谷氨酸棒杆菌(Corynebac-terium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和大肠杆菌(Escherichia coli)等，现在应用最为广泛的是黄色短杆菌(Brevibacterium flavums)、谷氨酸棒杆菌(Corynebac-terium glutamicum)和后经过人工诱变、克隆得到的表现为营养缺陷型的大肠杆菌型(Escherichia coli)基因工程菌，精氨酸发酵的特点是：1.以谷氨酸为发酵底物，营养需求为高碳和高氮，可成功代谢出L-精氨酸；2.发酵过程中采取流加氮和碳，以此来获得精氨酸含量较高的发酵液；3.随着基因重组技术的应用，研究者们将精氨酸基因克隆到繁殖速度快代谢能力强的大肠杆菌内，以此获得高产的精氨酸基因工程菌。此类工程菌已在河北精晶药业股份公司成功生产。L-精氨酸的发酵法生产，最有效的方法就是选育从遗传角度解除了L-精氨酸生物合成正常代谢控制机制的突变株。选择巧妙的路线改造菌株正常代谢途径，选育抗结构类似物突变株，增强主流代谢，是获得L-精氨酸生产菌的主要方法。
枯草芽孢杆菌是能够产生芽孢的好氧微生物。在分类学上属原核生物、真细菌，单个细胞，革兰氏阳性，无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏。芽孢形成后菌体不膨大，菌落表面粗糙，污白色或微黄色，在液体培养时，常形成皱醭。主要分布在海洋、江河、湖泊、活性污泥和土壤中。枯草芽孢杆菌繁殖速度快、容易培养，能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、多种氨基酸、多种维生素、抗菌肽和生物促长因子，具有生物好氧、调整菌群、抑制病菌、生物拮抗等功能，所以在提高动物机体免疫力、增强消化系统酶活性、防病治病和促进生长中起着重要作用。其芽孢抗逆性强、耐高温、耐酸碱、耐挤压，产品适用范围广泛，并且它能作为模式菌株在生物芯片上进行有效的DNA扩增和蛋白质、氨基酸分离。国内外许多学者研究表明，枯草芽孢杆菌在医药保健、水产养殖、禽畜养殖和生态环保等方面有较高的研究价值和应用价值。
酿酒酵母也是面包酵母，是与人类关系最广泛的一种酵母。传统上用于制作面包及酿酒，现代分子生物学和细胞生物学中用作真核生物的模式生物菌。酿酒酵母的细胞形态为球形或者卵球形细胞大小为。繁殖的方式为出芽生殖，其碳源氮源利用广泛，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露醇、琥珀酸、柠檬酸、木糖、山梨醇、果糖、乙醇和甘油；酿酒酵母可以大量的合成酵母蛋白，可以代谢出各种酶系，降解纤维素和蛋白质。有肠道益生作用。
植物乳杆菌(Lactobacillus acidoPHilus)属于乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中。具有酸甜芳香味，能分泌乳酸、乙酸可以使PH值下降，调整肠道菌群平衡，产生肽类抗菌素，抑制肠道不良微生物的增殖，对致病微生物有拮抗作用。还可以改善适口性，促进生长，提高饲料转化率，降低抗生素和酸化剂的使用量，降低成本。特别是对胃肠功能失调和服用抗菌素而引起胃肠功能失调等症状有特效，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖，具有很好的营养保健作用。近年来，植物的应用很广泛。
精氨酸是一种碱性氨基酸，是动物体内必需氨基酸，精氨酸主要功能：1合成蛋白质：精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成，赖氨酸与精氨酸的比例偏向赖氨酸时，可以压抑病毒的复制；2伤口复原：精氨酸能有效的防止胸腺的退化，特别是当人体受伤后胸腺退化，要补充一定量精氨酸；3排除氨；精氨酸可以解除氨中毒，主要是利用尿素循环的途径，避免代谢紊乱，对于肌酐而言是唯一的氨来源；4调节免疫力：精氨酸在体内激活免疫细胞，可以提高免疫力；5分泌激素；精氨酸能激活体内的生长激素，补充精氨酸，可缓解肌肉疲劳，提高运动功能。
玉米浆干粉以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成，其水溶性蛋白质保存完好，保持了玉米浆液的所有特性，加热方式为蒸汽加热，产品无杂质。玉米浆干粉用途广泛用于抗生素工业，维生素，氨基酸等发酵工业，在生物发酵过程中作水溶性植物蛋白及水溶性维生素等营养元素补充剂。
采用精氨酸和玉米浆干粉为发酵原料，其主要思考是：蛋白质是由氨基酸组成，在氨基酸的大家族中，精氨酸具有举足轻重的位子，是合成鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，可以用作瓜氨酸及谷氨酰胺的合成，并且有诱人的使用效果，而玉米浆干粉有丰富氮源、有机磷和微量元素，其两种原料都有助于微生物的繁殖和生长，有助于氨基酸和小肽的合成。
该方法以精氨酸浓浆菌液湿粉(河北精晶药业生物科技股份有限公司或是以精氨酸浓浆菌液为原料生产制备的精氨酸浓浆菌液湿粉)、豆粕、玉米浆干粉(山东鹤伴山生物科技有限公司)为发酵原料，以精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌为微生物发酵菌群，四种微生物液体种子分别采用，固体茄形扁瓶种子培养和液体发酵罐种子培养。固体与液体按比例均匀混合后，放置到发酵床上，经通入无菌空气进行有氧固体发酵，控制温度为50℃～60℃，若是超过50℃，则进行翻倒降温。再经烘干、粉碎、过筛得到畜禽用精氨酸活性肽。
本发明优点是：液体发酵中种子罐为2吨罐1个(生产精氨酸)、0.5吨罐3个(芽孢菌、酵母菌、乳酸菌)；固体发酵中采用履带式自动混料接菌、铺料、发酵、传输；烘干设备中为负压流化床或振动式流化床，计量、包装采用自动化程序化控制。
本发明特点是：1)所选用精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌为有益微生物菌群，互补性好，生长速度快、容易培养、菌体及代谢产物营养丰富等。2)精氨酸是合成各种氨基酸的前体，并且有诱人的使用效果。3)而玉米浆干粉有丰富氮源、有机磷和微量元素，发酵过程中可以充分利用并将其降解，代谢为动物性蛋白。其两种原料都有助于微生物的繁殖和生长，有助于氨基酸和小肽的合成。4)得到的产品营养丰富，含有蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、不饱和脂肪酸、微量元素和肽类抗生素等生物活性物质。5)在畜牧养殖中应用,诱食性、适口性、消化吸收率、免疫力、抗病力好，可以明显提高养殖动物的繁殖和存活能力，增强皮肤肌肉色泽，可以促进生长和品质改善。还可以分解有机物、硫化氢、氨化物等污染物，改善养殖环境，净化水质，畜牧用精氨酸活性肽是一种绿色的功能性的饲料添加剂，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
本发明各实施例采用的精氨酸产生菌、植物乳杆菌由中国科学院沈阳应用生态研究所农业微生物技术组所提供。
本发明各实施例采用的酿酒酵母菌为：中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，CICC编号为1355；枯草芽孢杆菌为中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏的枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilissubsp.subtilis)，CICC编号为20822。
精氨酸浓浆菌液湿粉由河北精晶药业生物科技股份有限公司提供。
玉米浆干粉由山东鹤伴山生物科技有限公司提供。
原料制备步骤如下：
(1)精氨酸浓菌液湿粉的制备：将精氨酸产生菌菌种接种到精氨酸产生菌发酵罐种子培养基中，精氨酸产生菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、谷氨酸2.0％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,接种量为10％。经过48h培养，得到含精氨酸菌产生菌活菌数≥100亿/ml种子液。
精氨酸浓菌液湿粉的浓缩过程与反应条件，首先，将4吨精氨酸发酵液打入到5吨反应釜中，开启搅拌，按照0.1％～0.4％加入絮凝剂，用硫酸将精氨酸发酵液PH值调到5.0～6.5，在40℃～55℃温度下反应，反应时间为50～80分钟，而后，用3mpa的压力压入到压滤机中，压滤时间为20～50分钟，得到含水量为20％～30％的精氨酸浓菌液湿粉。
(2)玉米浆干粉的制备：
玉米浆干粉以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成，其水溶性蛋白质保存完好，保持了玉米浆液的所有特性，加热方式为蒸汽加热，产品无杂质。玉米浆干粉用途广泛用于抗生素工业，维生素，氨基酸等发酵工业，在生物发酵过程中作水溶性植物蛋白及水溶性维生素等营养元素补充剂。玉米浆干粉含水量10％～15％。
(3)发酵原料制备：按所需比例将发酵原料中的精氨酸浓菌液湿粉、豆粕、玉米浆干粉充分混合：发酵原料中各种原料的重量比为：精氨酸浓菌液湿粉20～30份、豆粕70～80份、玉米浆干粉10～20份；
发酵原料中精氨酸浓浆菌液湿粉含水量20％～30％、豆粕含水量10％～15％、玉米浆干粉含水量10％～15％。
(4)液体种子制备：四种微生物液体种子分别经过固体茄形扁瓶种子培养，再经过液体发酵罐种子培养得到的液体种子，具体制备见(6)(7)(8)(9)(10)。按所需比例将精氨酸产生菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母菌种子液、植物乳杆菌种子液，充分混合；液体种子中各种菌液的重量比为：精氨酸产生菌20～30份、枯草芽孢杆菌5～10份、酿酒酵母菌5～10份、植物乳杆菌酵母菌5～10份；
精氨酸产生菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液中每毫升含活菌数为≥100个亿。酿酒酵母菌种子液和植物乳杆菌种子液中每毫升含活菌数为≥50个亿；
(5)固体发酵阶段：发酵原料与液体种子按发酵原料100～120份:精氨酸产生菌20～30份、枯草芽孢杆菌5～10份、酿酒酵母菌5～10份、植物乳杆菌酵母菌5～10份比例均匀混合，放置到发酵床上，经通入无菌空气进行有氧固体发酵。
发酵起始温度为20～30℃，发酵温度为30～60℃，发酵时间为100～120小时；通风供氧风量为0.1～0.3V/V.min,温度降低到20℃～30℃，PH值为4.0～5.0，酸度值200℃～300℃，发酵料中有酒香味和乳酸味产生，发酵达到终点。
(6)烘干粉碎阶段：
物料散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度80℃，出风温度36℃,流化时间12分钟，含水量12.0％，粉碎、过筛目数100目，得到畜禽用精氨酸活性肽粉。
(7)精氨酸产生菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的精氨酸产生菌的斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到精氨酸产生菌单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：精氨酸产生菌单菌落种子在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到精氨酸产生菌固体种子；
3)发酵罐种子培养：将精氨酸产生菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐种子培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到精氨酸产生菌种子液；
精氨酸产生菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0％～3.0％、谷氨酸1.0％～3.0％、玉米浆干粉2.0％～4.0％、硫酸铵0.05％～015％、硫酸镁0.05％～015％、磷酸氢二钾0.05％～015％，余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度30℃～32℃；时间24～48h。精氨酸产生菌种子液中含精氨酸产生菌活菌数≥100亿/ml；
(8)枯草芽孢杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到枯草芽孢杆菌固体种子；
3)发酵罐种子培养：将枯草芽孢杆菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；
枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5％～1.0％、玉米浆干粉3.0％～3.5％、硫酸铵0.1％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.2％、磷酸氢二钾0.1％～0.2％，余量为水,pH6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度30℃～32℃；时间48～64h。枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数≥100亿/ml；
(9)酿酒酵母菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的酿酒酵母菌斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃、48小时培养，得到酿酒酵母单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：酿酒酵母单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基的的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃、48小时培养，得到酿酒酵母固体种子；
3)发酵罐种子培养：将酿酒酵母菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到得到酵母菌种子液；
酿酒酵母菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0％～3.5％、酵母粉2.0％～2.5％、玉米浆干粉2.0％～2.5％、硫酸铵0.1％～0.2％、硫酸镁0.1％～0.2％、磷酸氢二钾0.1％～0.2％，余量为水,pH6.6～6.8；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度28℃～30℃；时间48～64h。酿酒酵母菌种子液中含酿酒酵母活菌数≥50亿/ml。
(10)植物乳杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的植物乳杆菌斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中35℃、48小时培养，得到植物单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：植物乳杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中35℃、48小时培养，得到植物乳杆菌固体种子；
3)发酵罐种子培养：将植物乳杆菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到植物乳杆菌种子液；
植物乳杆菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.0％、酵母粉1.0％～2.0％、玉米浆干粉1.0％～2.0％、硫酸铵0％～0.1％、硫酸镁0％～0.1％、磷酸氢二钾0％～0.1％，余量为水,pH6.4～6.6；灭菌条件：温度115～121℃、压力0.08～0.10MPa、时间18～20min；培养条件：接种量10～20％；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:200vvm、转速100～200rpm、温度33℃～35℃；时间48～64h(24小时后为静置培养)。植物乳杆菌种子液中含植物活菌数≥50亿/ml。
(11)优选的步骤(1)中，精氨酸浓菌液湿粉的制备：将精氨酸产生菌菌种接种到精氨酸产生菌发酵罐种子培养基中，精氨酸产生菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、谷氨酸2.0％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，接种量为10％。经过温度32℃，48h培养，得到含精氨酸菌产生菌活菌数≥100亿/ml种子液。
精氨酸浓菌液湿粉的浓缩过程与反应条件，首先，将4吨精氨酸发酵液打入到5吨反应釜中，开启搅拌，按照0.2％加入絮凝剂，用硫酸将精氨酸发酵液PH值调到5.5，在45℃温度下反应，反应时间为60分钟，而后，用3mpa的压力压入到压滤机中，压滤时间为30分钟，得到含水量为30％的精氨酸浓浆菌液湿粉。
优选的步骤(2)中，玉米浆干粉的制备，玉米浆干粉以鲜玉米浆为原料经低温瞬间加热喷雾干燥而成，其水溶性蛋白质保存完好，保持了玉米浆液的所有特性，加热方式为蒸汽加热，产品无杂质。玉米浆干粉用途广泛用于抗生素工业，维生素，氨基酸等发酵工业，在生物发酵过程中作水溶性植物蛋白及水溶性维生素等营养元素补充剂。玉米浆干粉含水量10％。
优选的步骤(3)中，发酵原料制备：按所需比例将发酵原料中的精氨酸浓菌液湿粉、豆粕、玉米浆干粉充分混合：发酵原料中各种原料的重量比为：精氨酸浓菌液湿粉20份、豆粕70份、玉米浆干粉10份；
发酵原料中精氨酸浓浆菌液湿粉含水量30％、豆粕含水量10％、玉米浆干粉含水量10％。发酵原料中总含水量14.0％。
优选的步骤(4)液体种子制备：四种微生物液体种子分别经过固体扁瓶种子培养，再经过发酵罐种子培养得到的液体种子，具体制备见(6)(7)(8)(9)(10)。按所需比例将精氨酸产生菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、酿酒酵母菌种子液、植物乳杆菌种子液，充分混合；液体种子中各种菌液的重量比为：精氨酸产生菌20份、枯草芽孢杆菌5份、酿酒酵母菌5份、植物乳杆菌酵母菌5份；
精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌种子液中每毫升含活菌数为≥100个亿。酿酒酵母菌、植物种子液中每毫升含活菌数为≥50个亿；
优选的步骤(5)固体发酵阶段：发酵原料与液体种子按发酵原料100份:精氨酸产生菌20份、枯草芽孢杆菌5份、酿酒酵母菌10份、植物乳杆菌酵母菌5份比例均匀混合，放置到发酵床上，经通入无菌空气进行有氧固体发酵。
发酵起始温度为30℃，发酵温度为60℃，发酵时间为100小时；通风供氧风量为0.3V/V.min,温降低到30℃，发酵结束时ph值为5.0，总酸为500°T，乳酸为50g/100g；发酵料中有酒香味和乳酸味产生，发酵达到终点。
优选的步骤(6)烘干粉碎阶段：
散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度80℃，出风温度36℃,流化时间12分钟，含水量12.0％，粉碎、过筛目数100目，得到畜禽用精氨酸活性肽粉。
优选的步骤(7)精氨酸产生菌种子液的制备：枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基,以重量百分比计为：葡萄糖0.5％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度32℃；时间48h。
优选的步骤(7)中，精氨酸产生菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的精氨酸产生菌的斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到精氨酸产生菌单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：精氨酸产生菌单菌落种子在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到精氨酸产生菌固体种子；
3)发酵罐种子培养：将精氨酸产生菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到精氨酸产生菌种子液；
精氨酸产生菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、谷氨酸2.0％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.8；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度32℃；时间48h。精氨酸菌产生菌种子液中含精氨酸菌产生菌活菌数≥100亿/ml；
优选的步骤(8)中，枯草芽孢杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到枯草芽孢杆菌单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：枯草芽孢杆菌单菌落种子在盛有新配制的葡萄糖牛肉膏蛋白胨培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃、24小时培养，得到枯草芽孢杆菌固体种子；
3)发酵罐种子培养：将枯草芽孢杆菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到枯草芽孢杆菌种子液；
枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基：以重量百分比计为：葡萄糖0.5％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度32℃；时间48h。枯草芽孢杆菌种子液中含枯草芽孢杆菌活菌数≥100亿/ml；
优选的步骤(9)中，酿酒酵母菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的酿酒酵母菌斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中30℃、48小时培养，得到酿酒酵母单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：酿酒酵母单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨酵母膏培养基的的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中30℃、48小时培养，得到酿酒酵母固体种子；
3)发酵罐种子培养：将酿酒酵母菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到得到酵母菌种子液；
酿酒酵母菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉2.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.8；灭菌件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度28℃；时间48h。酿酒酵母菌种子液中含酿酒酵母活菌数≥50亿/ml。
优选的步骤(10)中，植物乳杆菌种子液的制备：
1)单菌落分离：将经活化的植物乳杆菌斜面菌种在盛有新配制的葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的培养皿上涂布，在恒温培养箱中35℃、48小时培养，得到植物单菌落种子；
2)固体茄形扁瓶种子培养：植物乳杆菌单菌落种子在盛有葡萄糖蛋白胨牛肉膏酵母膏培养基的200ml茄形扁瓶中接种，在恒温培养箱中35℃、48小时培养，得到植物乳杆菌固体种子；
3)发酵罐种子培养：将植物乳杆菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，经培养，得到植物乳杆菌种子液；
植物乳杆菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉2.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.6；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10；罐压0.05MPa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度35℃；时间48h(24小时后为静置培养)。植物乳杆菌种子液中含植物乳杆菌活菌数≥50亿/ml。
实施例1
精氨酸浓菌液湿粉的浓缩过程与反应条件的确认
将4吨精氨酸发酵液打入到5吨反应釜中，开启搅拌，按照0.1％～0.4％加入絮凝剂(都为爱森中国絮凝剂有限公司生产的)，用硫酸将精氨酸发酵液Ph值调到5.0～6.5，在40℃～55℃温度下反应，反应时间为50～80分钟，而后，用3mpa的压力压入到压滤机中，压滤时间为20～50分钟，得到含水量为20％～30％的精氨酸浓菌液湿粉。
精氨酸浓菌液湿粉的浓缩过程与条件试验
试验设计为5因素4水平，试验设计和试验结果如下表1：
表1.精氨酸浓浆菌液湿粉的浓缩与反应条件试验
| 因子/水平 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 絮凝剂加入浓度(％) | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
| PH值 | 5.0 | 5.5 | 6.0 | 6.5 |
| 温度(℃) | 40 | 45 | 50 | 55 |
| 反应时间(分钟) | 50 | 60 | 70 | 80 |
| 压滤时间(分钟) | 20 | 30 | 40 | 50 |
| 含水量(％) | 35 | 30 | 25 | 20 |
通过表1的试验结果可以看出，温度、反应时间、压滤时间和精氨酸浓浆菌液湿粉的含水量成反比。浓缩过程与反应条件是，将精氨酸发酵液按照0.2％加入絮凝剂，用硫酸将精氨酸发酵液PH值调到5.5，在45℃温度下反应，反应时间为60分钟，而后，用3MPa的压力压入到压滤机中，压滤时间为30分钟，得到含水量为30％的精氨酸浓浆菌液湿粉。
实施例2：
精氨酸产生菌发酵罐种子培养基配方及其发酵条件的确认
精氨酸产生菌，选用的是黄色短杆菌(Brevibacterium flavums)，主要特点是：1.以谷氨酸为发酵底物，营养需求为高碳和高氮，可成功代谢出L-精氨酸；2.发酵过程中流加氮碳，合成精氨酸和肽类物质，以此来获得精氨酸含量较高的发酵液。精氨酸产生菌菌还具有繁殖速度快、稳定性能好、应用范围广等特点。
单菌落纯化与优选、固体茄形扁瓶种子培养、发酵罐深层发酵种子培养具体操作步骤如下：
单菌落纯化:见原料制备步骤的(7)1)；
固体茄形扁瓶种子培养:见原料制备步骤的(7)2)；
发酵罐种子培养：将精氨酸产生菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，用200mL无菌水，将茄形扁瓶种子洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中。显微镜下检查菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检活菌数可达100亿/ml(采用血球计数法计算菌数)，得到种子液即可混合使用。
精氨酸产生菌发酵罐种子培养基和培养条件试验：
a、精氨酸产生菌发酵罐种子培养基配方试验，
设计为4因素3水平，试验设计和试验结果如下表2：
表2.精氨酸产生菌发酵罐种子培养基配方试验
b、精氨酸产生菌深层发酵培养条件试验：
试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表3：
表3.精氨酸产生菌发酵罐种子培养条件试验：
| 因子/水平 | 1 | 2 | 3 |
| 罐压(mpa) | 0.01 | 0.025 | 0.05 |
| 风量(vvm) | 100:100 | 100:150 | 100:200 |
| 转速(rpm) | 100 | 150 | 200 |
| 温度(℃) | 30 | 31 | 32 |
| 时间(h) | 24 | 36 | 48 |
| 菌数测定结果(cfu亿个/ml) | 10.2×10<sup>9</sup> | 10.5×10<sup>9</sup> | 10.9×10<sup>9</sup> |
通过表2、表3的试验结果确定的精氨酸产生菌种子罐的培养基和培养条件为：培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、谷氨酸2.0％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH为6.8；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度32℃；时间48h。
实施例3：
枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基配方及其发酵条件的确认
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是细菌微生物，(主要分解蛋白作用合成氨基酸和肽类物质)。单菌落纯化与优选、固体茄形扁瓶种子培养和发酵罐种子培养具体操作步骤如下：
枯草芽孢杆菌具有繁殖速度快、耐高温、耐酸碱、耐挤压、稳定性能好、应用范围广等特点。
单菌落纯化:见原料制备步骤的(8)1)；
固体茄形扁瓶种子培养:见原料制备步骤的(8)2)；
发酵罐深层发酵种子培养：将枯草芽孢杆菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，用200mL无菌水，将茄形扁瓶种子洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中。显微镜下检查菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检活菌数可达100亿/ml(采用血球计数法计算菌数)，得到种子液即可混合使用。
枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基和培养条件试验
a、枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基配方试验，
试验设计为4因素3水平，试验设计和试验结果如下表4：
表4.枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基配方试验
b、枯草芽孢杆菌种子罐培养条件试验
试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表5：
表5.枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养条件试验
| 因子/水平 | 1 | 2 | 3 |
| 罐压(mpa) | 0.01 | 0.025 | 0.05 |
| 风量(vvm) | 100:100 | 100:150 | 100:200 |
| 转速(rpm) | 100 | 150 | 200 |
| 温度(℃) | 30 | 31 | 32 |
| 时间(h) | 24 | 36 | 48 |
| 菌数测定结果(cfu亿个/ml) | 10.2×10<sup>9</sup> | 10.5×10<sup>9</sup> | 10.9×10<sup>9</sup> |
通过表4、表5的试验结果确定的枯草芽孢杆菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5％、玉米浆干粉3.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH7.0；灭菌条件：温度121℃、压力0.10MPa、时间20min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度32℃；时间48h。
实施例4
酿酒酵母菌发酵罐种子培养基配方及其发酵条件的确认
酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)(产生蛋白酶、氨基酸、维生素、生物素)单菌落纯化、固体茄形扁瓶种子培养和发酵罐深层发酵种子培养、菌数的检查及其确定，具体操作步骤如下：
单菌落纯化:见原料制备步骤的(9)1)；
固体茄形扁瓶种子培养:见原料制备步骤的(9)2)；
发酵罐深种子培养：将酿酒酵母菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，用200mL无菌水，将茄形扁瓶种子洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中。显微镜下检查菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检活菌数可达50亿/ml(采用血球计数法计算菌数)，得到种子液即可混合使用。
酿酒酵母菌发酵罐种子培养基和培养条件试验
a、酿酒酵母菌发酵罐种子培养基配方试验
试验设计为4因素3水平，试验设计和试验结果如下表6：
表6.酿酒酵母菌发酵罐种子培养基配方试验
b、酿酒酵母菌种子罐培养条件试验
试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表7：
表7.酿酒酵母菌发酵罐种子培养条件试验
| 因子/水平 | 1 | 2 | 3 |
| 罐压(mpa) | 0.01 | 0.025 | 0.05 |
| 风量(vvm) | 100:100 | 100:150 | 100:200 |
| 转速(rpm) | 100 | 150 | 200 |
| 温度(℃) | 32 | 30 | 28 |
| 时间(h) | 64 | 56 | 48 |
| 菌数测定结果(cfu亿个/ml) | 52.2×10<sup>8</sup> | 52.8×10<sup>8</sup> | 53.6×10<sup>8</sup> |
通过表6、表7的试验结果确定酿酒酵母菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0％、酵母粉2.0％％、玉米浆干粉2.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.8；灭菌件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10％；罐压0.05MPa、风量100:200vvm、转速200rpm、温度28℃；时间48h。
酿酒酵母菌显微镜检查：酵母细胞形态大小约为2～5×5～30μm酵母多数为单细胞微生物,常呈卵圆形或者圆柱形。
酿酒酵母菌酵母菌培养皿检查：平板培养基上的酵母菌落呈白色粒状凸起，有酒香味。
实施例5
植物乳杆菌发酵罐种子培养基配方及其发酵条件的确认
植物乳杆菌(Lactobacillus acidoPHilus)属于乳杆菌属，杆的末端呈圆形，主要存在小肠中。具有酸甜芳香味，能分泌乳酸、乙酸可以使PH值下降，调整肠道菌群平衡，产生肽类抗菌素，抑制肠道不良微生物的增殖，对致病微生物有拮抗作用。单菌落纯化、固体茄形扁瓶种子培养和发酵罐发酵培养、菌数的检查及其确定，具体操作步骤如下：
单菌落纯化:见原料制备步骤的(10)1)；
固体茄形扁瓶种子培养:见原料制备步骤的(10)2)；
发酵罐种子培养：将植物乳杆菌茄形扁瓶种子按质量分数比例计算为200公斤液体接入1个茄形扁瓶种子的接种量，接种到发酵罐培养基中(700公斤液体接入3～4个茄形扁瓶种子)，用200mL无菌水，将茄形扁瓶种子洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中。显微镜下检查菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检活菌数可达50亿/ml(采用血球计数法计算菌数)，得到种子液即可混合使用。
植物乳杆菌液体种子培养基和培养条件试验
a、植物乳杆菌液体种子培养基配方试验
试验设计为4因素3水平，试验设计和试验结果如下表8：
表8.植物乳杆菌发酵罐种子培养基配方试验
| 因子/水平 | 1 | 2 | 3 |
| 葡萄糖(g/l) | 10 | 15 | 20 |
| 酵母粉(g/l) | 10 | 15 | 20 |
| 玉米浆干粉(g/l) | 10 | 15 | 20 |
| 硫酸铵(g/l) | 0 | 0.5 | 1 |
| 硫酸镁(g/l) | 0 | 0.5 | 1 |
| 磷酸氢二钾(g/l) | 0 | 0.5 | 1 |
| 菌数测定结果(cfu亿个/ml) | 50.3×10<sup>8</sup> | 50.5×10<sup>8</sup> | 50.9×10<sup>8</sup> |
b、植物乳杆菌种子培养条件试验
试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表9：
表9.植物乳杆菌液体发酵罐种子培养条件试验
| 因子/水平 | 1 | 2 | 3 |
| 罐压(mpa) | 0.01 | 0.025 | 0.05 |
| 风量(vvm) | 100:0 | 100:50 | 100:100 |
| 转速(rpm) | 100 | 150 | 100 |
| 温度(℃) | 33 | 34 | 35 |
| 时间(h) | 64 | 56 | 48 |
| 菌数测定结果(cfu亿个/ml) | 52.2×10<sup>8</sup> | 55.8×10<sup>8</sup> | 60.6×10<sup>8</sup> |
通过表8、表9的试验结果确定的植物乳杆菌种子罐的培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0％、酵母粉2.0％、玉米浆干粉2.0％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％，余量为水,pH6.6；灭菌条件：温度115℃、压力0.08MPa、时间18min；培养条件：接种量10；罐压0.05MPa、风量100:100vvm、转速100rpm、温度35℃；时间48h(24小时后为静置培养)。植物乳杆菌种子液中含植物活菌数≥50亿/ml。
植物乳杆菌显微镜检查：细胞形态大小约为2～5×5～30μm植物乳杆菌多数为：
植物乳杆菌培养皿检查：平板培养基上的植物乳杆菌落呈白色细小粒状凸起，具有酸甜芳香味和乳酸香味。
实施例6：
固体发酵中原料配比、含水量、流化温度时间等参数的确认
精氨酸浓浆菌液湿粉20～30份、豆粕70～80份、玉米浆干粉10～20份；发酵原料与精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌种子液的重量比为，发酵原料100～120份:精氨酸产生菌20～30份、枯草芽孢杆菌5～10份、酿酒酵母菌5～10份、植物乳杆菌酵母菌5～10份；固体发酵在发酵床上进行，起始温度为20～30℃，发酵温度为30～60℃，发酵时间为100～120小时；通风供氧风量为0.1～0.3V/V.min,发酵结束时有酵母酒香和乳酸味道产生。散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度60～80℃，出风温度30～40℃,流化时间12分钟～20分钟，含水量12.0％～15.0％，粉碎、过筛目数80目～100目。得到含水量≤10％的畜禽用精氨酸活性肽粉。
a、不同原料配比不同含水量对发酵温度的影响试验设计
试验设计为4因素9水平，试验设计和试验结果如下表10：
表10固体发酵中不同原料配比不同含水量对发酵温度的影响试验设计
b、不同原料配比不同含水量对发酵温度的影响试验结果
不同原料配比不同含水量对发酵温度的影响试验结果见表11：
表11固体发酵中不同原料配比不同含水量对发酵温度的影响(℃)
c、固体发酵同原料配比产品保证值的测定
固体发酵不同原料配比产品保证值的测定结果见表12：
表12固体发酵不同原料配比产品保证值的测定结果
d、不同流化温度时间对发酵料含水量和微生物指标的影响
不同流化温度和时间对发酵料含水量和微生物指标的影响见下表13:
表13不同流化温度和时间对发酵料含水量和微生物指标的影响
通过表10、表11、表12、表13的试验结果表明：固体发酵原料中各种原料重量比为：精氨酸浓浆菌液湿粉20份、豆粕70份、玉米浆干粉10份；发酵原料与微生物发酵菌群种子液的最佳重量比为，发酵原料100份:精氨酸产生菌20份、枯草芽孢杆菌5份、酿酒酵母菌5份、植物乳杆菌酵母菌5份；
通过上述的试验能够观察到，水分含量高，发酵速度快，容易发霉，水分含量低，发酵速度慢，也容易发霉。
固体发酵料在发酵床上通入无菌空气进行有氧发酵，起始含水量为36％，起始温度为25℃，发酵温度为50℃，发酵时间为100小时；供氧风量为0.3V/V.min,发酵结束时有酵母酒香和乳酸味道产生。散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度80℃，出风温度35℃,流化时间12分钟，含水量12.0％，粉碎、过筛目数100目，得到含水量≤10％的畜禽用精氨酸活性肽粉。
实施例7：
将实施例6获得的畜禽用精氨酸活性肽粉，在海蓝褐色壳蛋鸡日粮中添加2.0wt.％的精氨酸活性肽粉进行饲养试验，结果见表14：
表14.畜禽用精氨酸活性肽粉对海蓝褐色蛋鸡鸡群生产性能的影响
*试验组为日粮+2wt.％的精氨酸活性肽粉；
对照组为日粮；
由表14可以看出：在287只海蓝褐色壳蛋鸡，经35天试验期，试验组比对照组(日粮中不添加畜禽用精氨酸活性肽粉)，产蛋率提高2.02％，日单产提高1.44g/只，死淘率降低1.8％，料蛋比降低6.0％，总产蛋量提高15.4kg，并且蛋壳硬度加强，亮，光泽好，颜色均匀一致，鸡粪成型，臭味、氨气味减轻,养殖环境明显改善。
实施例8：
将实施例6获得的畜禽用精氨酸活性肽粉，在肉鸡日粮中添加2wt.％～4wt.％的精氨酸活性肽粉进行饲养试验，结果见表15：
表15.畜禽用精氨酸活性肽粉对肉鸡鸡群生产性能的影响
*试验组1为日粮+2wt.％的精氨酸活性肽粉；
试验组2为日粮+4wt.％的精氨酸活性肽粉；
对照组为日粮；
通过表15可以看出：在肉鸡日粮中添加2％～4％进行饲养试验，结果表明：试验组1平均日增重60.05克，试验组2平均日增重62.65克，对照组平均日增重53.51克，试验组1与对照组平均日增重提高12.20％，试验组2与对照组平均日增重提高17.06％。试验组1料肉比均为1.64，试验组2料肉比均为1.63，对照组料肉比1.66，试验组1与对照组料肉比降低0.02，试验组2与对照组料重比降低0.03。在肉鸡日粮中添加2％～4％畜禽用精氨酸活性肽粉没有腹泻发生，并且粪便松软，颜色浅黄色，臭味减轻，养殖环境明显改善。
实施例9：
将实施例6获得的畜禽用精氨酸活性肽粉，在肥猪日粮中添加2wt.％～5wt.％进行饲养试验，畜禽用精氨酸活性肽粉对育肥猪生长性能的影响结果见表16：
表16.添加畜禽用精氨酸活性肽粉对育肥猪生长性能的影响(150天)
*试验组1为日粮+2wt.％的精氨酸活性肽粉；
试验组2为日粮+5wt.％的精氨酸活性肽粉；
对照组为日粮；
通过表16可以看出：在肥猪日粮中添加2％～5％进行饲养试验，结果表明：试验组1平均日增重0.616公斤，试验组2平均日增重0.627公斤，对照组平均日增重0.557公斤，试验组1与对照组平均日增重提高10.77％，试验组2与对照组平均日增重提高12.66％。试验组1料重比均为2.787：1，试验组1料重比均为2.727：1，对照组料重比均为2.912：1，试验组1与对照组料重比降低0.125，试验组2与对照组料重比降低0.184。在肥猪日粮中添加畜禽用精氨酸活性肽粉没有腹泻发生，并且粪便松软，颜色浅黄色，臭味减轻，养殖环境明显改善。
实施例10：
将实施例6获得的畜禽用精氨酸活性肽粉，在奶牛日粮的精补料中添加5.0％～10.0％畜禽用精氨酸活性肽粉，进行饲养试验，试验设计为：试验组1为5％添加，试验组2为10％添加，奶牛提高产奶率试验结果见表17：
表17.精补料中添加畜禽用精氨酸活性肽粉对奶牛产奶量的影响
*试验组1为日粮+5wt.％的精氨酸活性肽粉；
试验组2为日粮+10wt.％的精氨酸活性肽粉；
对照组为日粮；
试验结果经过方差和T检验，其结果见表19、20：
表18.t-检验:饲料报酬率(FCR)成对双样本均值分析
*试验组1与对照组t检验P值小于0.01差异极显著。
通过表18可以看出，t-检验:饲料报酬率(FCR)成对双样本均值分析，试验组1与对照组t检验P值小于0.01差异极显著。
表19.t-检验增重率成对双样本均值分析
*试验组2与对照组t检验P值小于0.01差异极显著。
通过表18、表19可以看出，t-检验增重率成对双样本均值分析,试验组2与对照组t检验P值小于0.01差异极显著。
通过表18、表19、表20可以看出，在正常的条件和同等的管理水平下，在奶牛日粮的精补料中添加5.0％～10.0％畜禽用精氨酸活性肽粉，经过10天的喂养，结果表明：试验组1日产奶量34.97公斤，试验组2日产奶量34.83公斤，对照组日产奶量33.23公斤，试验组1与对照组日产奶量增加5.23％，试验组2与对照组日产奶量增加4.82％。试验组1与试验组2料奶比均为0.30：1，对照组料奶比为0.32：1，试验组与对照组料奶比降低0.02.，精补料中添加畜禽用精氨酸活性肽粉没有腹泻发生。
实施例11：
将实施例6获得的畜禽用精氨酸活性肽粉，在肉牛日粮的精补料中添加3％～5％畜禽用精氨酸活性肽粉，进行饲养试验，试验设计为：试验组1为3％添加，试验组2为5％添加，肉牛增重试验结果见表20：
表20.精补料中添加畜禽用精氨酸活性肽粉对肉牛增重的影响
*试验组1为日粮+3wt.％的精氨酸活性肽粉；
试验组2为日粮+5wt.％的精氨酸活性肽粉；
对照组为日粮；
通过表20可以看出：在肉牛日粮的精补料中添加3％～5％畜禽用精氨酸活性肽粉，进行饲养试验，结果表明：试验组1日增重量2.16公斤，试验组2日增重量2.21公斤，对照组日增重量1.98公斤产奶量，试验组1与对照组日增重量增加9.09％，试验组2与对照组日产奶量增加11.6％。试验组1料肉比为2.32：1，试验组2料肉比为2.27：1，对照组料肉比为2.53：1，试验组1与对照组料肉比降低0.21，试验组2与对照组料肉比降低0.26.精补料中添加畜禽用精氨酸活性肽粉日增重明显，没有腹泻新现象发生。
本发明具有生产工艺简单，易于操作、生产原料来源广，泛成本低易于推广、生产周期短发酵产物多，产品质量好，易于应用等特点。在畜牧水产中应用，可提高成活率，可提高免疫力，可加快生长发育,可改善养殖环境，是一种理想的优质畜禽用精氨酸活性肽粉。
与实施例1－11不同之处在于，为提高产品质量，缩短生产周期，分离、纯化并鉴定的高活性微生物菌株,其应用效果更佳。
目前，经过我们生产应用，其应用效果非常好，已在辽宁的沈阳、大连、锦州、铁岭，河北的石家庄、秦皇岛、山东的青岛、烟台、潍坊等地区应用，取得了很好的经济效益，我们已将产品实现了商品化生产。
Claims (4)
1.一种生产方法制备的精氨酸活性肽粉在制备海蓝褐色壳蛋鸡、肉牛和奶牛饲料添加剂中的用途，其特征在于，所述生产方法为：以精氨酸浓浆菌液湿粉、豆粕、玉米浆干粉为原料，以精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌为有益微生物菌群，发酵原料中各种原料的重量比为：精氨酸浓浆菌液湿粉20～30份、豆粕70～80份、玉米浆干粉10～20份；发酵原料与精氨酸产生菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、植物乳杆菌种子液的重量比为：发酵原料100～120份、精氨酸产生菌20～30份、枯草芽孢杆菌5～10份、酿酒酵母菌5～10份、植物乳杆菌5～10份；固体发酵在发酵床上进行，起始温度为20～30℃，发酵温度为30～60℃，发酵时间为100～120小时；通风供氧风量为0.1～0.3V/V.min，发酵结束时有酵母酒香和乳酸味道产生；物料散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度60～80℃，出风温度30～40℃，流化时间12分钟～20分钟，质量含水量12.0%～15.0%，粉碎、过筛目数80目～100目，得到含水量≤10%的畜禽用精氨酸活性肽粉；
发酵结束时pH值为4.0～5.0，总酸为500～600°T；
发酵结束时产品粗蛋白50%～60%，其中含分子量为2000个道尔顿以下的短链肽12.0%～20.0%、赖氨酸2.50%～3.50%、蛋氨酸0.50%～1.50%、苏氨酸1.50%～2.00%、色氨酸0.50%～1.00%、精氨酸3.00%～5.00%、谷氨酸5.50%～6.50%；
发酵原料中精氨酸浓浆菌液湿粉质量含水量20%～30%、豆粕质量含水量10%～15%、玉米浆干粉质量含水量10%～15%；精氨酸浓浆菌液湿粉的制备方法：将精氨酸产生菌菌种接种到精氨酸产生菌发酵罐种子培养基中，精氨酸产生菌发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0%、谷氨酸2.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水，接种量为10%，经过48h培养，得到含精氨酸菌产生菌活菌数≥100亿/ml种子液；精氨酸浓浆菌液湿粉的浓缩过程与反应条件：首先将4吨精氨酸发酵液打入到5吨反应釜中，开启搅拌，按照0.1%～0.4%加入絮凝剂，用硫酸将精氨酸发酵液pH值调到5.0～6.5，在40℃～55℃温度下反应，反应时间为50～80分钟，而后用3MPa的压力压入到压滤机中，压滤时间为20～50分钟，得到含水量为20%～30%的精氨酸浓浆菌液湿粉；
所述四种微生物液体种子分别采用固体茄形扁瓶种子培养和液体发酵罐种子培养；
所述精氨酸产生菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液中每毫升含活菌数为≥100个亿；酿酒酵母菌种子液和植物乳杆菌种子液中每毫升含活菌数为≥50个亿；
精氨酸产生菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0%～3.0%、谷氨酸1.0%～3.0%、玉米浆干粉2.0%～4.0%、硫酸铵0.05%～0.15%、硫酸镁0.05%～0.15%、磷酸氢二钾0.05%～0.15%，余量为水，pH为6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃，压力0.08～0.10MPa，时间18～20 min；培养条件：接种量10～20 wt %，罐压0.01～0.10MPa，风量100：100～100：200vvm、转速100～200rpm，温度30℃～32℃，时间24～48h；
枯草芽孢杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5%～1.0%、玉米浆干粉3.0%～3.5%、硫酸铵0.1%～0.2%、硫酸镁0.1%～0.2%、磷酸氢二钾0.1%～0.2%、余量为水，pH为6.8～7.0；灭菌条件：温度115～121℃，压力0.08～0.10MPa，时间18～20 min；培养条件：接种量10～20V%，罐压0.01～0.10MPa，风量100：100～100：200vvm，转速100～200rpm，温度30℃～32℃，时间48～64h；
酿酒酵母菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%～3.5%、酵母粉2.0%～2.5%、玉米浆干粉2.0%～2.5%、硫酸铵0.1%～0.2%、硫酸镁0.1%～0.2%、磷酸氢二钾0.1%～0.2%、余量为水，pH为6.6～6.8；灭菌条件：温度115～121℃，压力0.08～0.10MPa，时间18～20 min；培养条件：接种量10～20 wt %，罐压0.01～0.10MPa，风量100：100～100：200vvm，转速100～200rpm，温度28℃～30℃，时间48～64h；
植物乳杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.0%、酵母粉1.0%～2.0%、玉米浆干粉1.0%～2.0%、硫酸铵0%～0.1%、硫酸镁0%～0.1%、磷酸氢二钾0%～0.1%、余量为水，pH为6.4～6.6；灭菌条件：温度115～121℃，压力0.08～0.10MPa，时间18～20min，培养条件：接种量10～20 wt %，罐压0.01～0.10MPa，风量100：100～100：200vvm，转速100～200rpm，温度33℃～35℃，时间48～64h，其中24小时后为静置培养。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生产方法的固体发酵过程中，发酵原料与微生物发酵菌群种子液的重量比为：发酵原料100份、精氨酸产生菌20份、枯草芽孢杆菌5份、酿酒酵母菌5份、植物乳杆菌5份。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生产方法中所述精氨酸产生菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0%、谷氨酸2.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水，pH为6.8；灭菌条件：温度115℃，压力0.08MPa，时间18min；培养条件：接种量10wt%，罐压0.05MPa，风量100：200vvm，转速200rpm，温度32℃，时间48h；
所述枯草芽孢杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水，pH为7.0；灭菌条件：温度121℃，压力0.10MPa，时间20 min；培养条件：接种量10V%，罐压0.05MPa，风量100：200vvm ，转速200rpm，温度32℃，时间48h；
所述酿酒酵母菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、酵母粉2.0%、玉米浆干粉2.0%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水，pH6.8；灭菌件：温度115℃，压力0.08MPa，时间18min；培养条件：接种量10 wt %，罐压0.05MPa，风量100：200vvm，转速200rpm，温度28℃，时间48h；
所述植物乳杆菌液体发酵罐种子培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0%、酵母粉2.0%、玉米浆干粉2.0%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水，pH为6.6；灭菌条件：温度115℃，压力0.08MPa，时间18min；培养条件：接种量10wt%，罐压0.05MPa，风量100：100vvm，转速100rpm，温度35℃，时间48h，其中24小时后为静置培养。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述生产方法中固体发酵料在发酵床上通入无菌空气进行有氧发酵，起始含水量为36 wt %，起始温度为25℃，发酵温度为50℃，发酵时间为100小时，供氧风量为0.3V/V.min，发酵结束时有酵母酒香和乳酸味道产生，物料散开通风后，传送到流化床上烘干，进风温度80℃，出风温度35℃，流化时间12分钟，含水量12.0%，粉碎、过筛目数100目，得到畜禽用精氨酸活性肽粉。
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