CN104206645B - 用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法。以豆粕、麦麸皮、米糠为发酵原料,以米曲霉为主,兼有酵母菌、乳酸菌、芽孢菌为有益微生物发酵菌群，米曲霉、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌经过一级固体制种、二级液体种子罐扩繁培养。将四种菌的种子液按比例混合，接种到经旋转蒸球灭过菌的发酵原料中，经过有氧固体发酵，得到高含量小肽饲料添加剂。本发明具有发酵原料来源广泛价格低廉易于推广、生产工艺结构简单成本低易于操作、生产周期短发酵产物多产品质量好易于应用等特点。本产品在海珍品、畜禽养殖中的饲料中添加应用，可以防病治病、提高免疫力，提高成活率，提高生长速度，提高品质；可以改善养殖环境,净化水质。

Description

用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术，具体的说是用米曲霉、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌固体发酵豆粕生产高含量小肽饲料添加剂方法。
背景技术
米曲霉(Aspergillus oryzae)是真菌微生物，在分类学上是半知菌亚门，丝孢钢丝孢目，从梗孢科，曲霉属，属于真核生物真菌中的一个常见种。米曲霉能产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和植酸酶。在蛋白酶作用下，可以将原料中不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸；在淀粉酶作用下，可以将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子的麦芽糖、葡萄糖；在纤维素酶、植酸酶的作用下，可以将粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率。米曲霉在食品、饲料、酱油、酿酒等发酵行业应用，已有1000多年的安全生产历史。
米曲霉菌的主要特点是:繁殖速度快、代谢产物多、适应性强、耐高温、应用范围广、不产黄曲霉毒素。
酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，是真菌微生物，在分类学上是真菌门、粘菌亚门、隐球酵母科，细胞形态为球形或卵球形，直径5 10μm。繁殖方式为无性芽殖。生态分布广泛。能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、半乳糖等生成乙醇、甘油、酯类和糖醇等物质，可以增加发酵料的风味。
酵母菌具有生长繁殖速度快、耐盐耐高渗透压，容易培养、菌体及代谢产物营养丰富等特点。
乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)是细菌微生物，在分类学上是乳酸菌属，革兰氏阳性杆菌，杆的末端呈圆形，乳酸菌的作用是利用葡萄糖产生乳酸，和乙醇作用生成乳酸乙酯，有浓重的乳酸香味道。由于产生乳酸，降低了发酵料的pH值，可以促进了酵母菌繁殖。乳酸菌和酵母菌联合作用，发酵料有特殊的香气。
乳酸菌主要存活在小肠中，能分泌乳酸、乙酸和肽类抗菌素。乳酸菌主要用于调整肠道菌群平衡，抑制肠道不良微生物的增殖，对致病微生物有拮抗作用。特别是对胃肠功能失调和服用抗菌素而引起胃肠功能失调等症状有特效，可以迅速使肠道内的菌群恢复正常平衡，抑制腐败菌的增殖，具有很好的营养保健作用。
芽孢菌，这里指的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),是细菌微生物，在分类学上是芽孢杆菌属的一种，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动。芽孢大，椭圆到柱状，0.6～0.9×1.0～1.5微米，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙，污白色或微黄色，在液体培养时，常形成皱醭。
枯草芽孢杆菌具有繁殖速度快、耐高温、耐酸碱、耐挤压、稳定性能好、应用范围广等特点，在现代分子遗传学的科研探索中常作为模式菌株，在现实的生产实践中广泛应用于食品工业、饲料工业、水产养殖、环境保护和保健医药等诸多方面；在发酵料的发酵过程中，主要分解蛋白质作用，将蛋白质降解成氨基酸和肽类物质。
近年来，随着人们生活质量的不断提高，人们对副食品的要求越来越高，要吃的好，还要吃的健康，这对饲料行业提出更高的要求，1、要解决优质蛋白源紧缺问题；2、要解决饲料中过量使用抗生素问题；人们出于防病治病、增强免疫功能、提高饲料利用率、促进生长、提高品质、净化环境目的，许多科研人员、企业家纷纷用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌对豆粕进行发酵，生产微生物发酵小肽。目前在全国范围，先后成立20多家发酵豆粕生产微生物小肽的生物技术企业，年产量达到数十万吨以上。
国外和国内发酵豆粕，基本上都是采用芽孢菌、酵母菌、乳酸菌等三类菌群发酵，而我们在国内，首次提出并且实践用米曲霉、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌发酵豆粕，生产高含量小肽饲料添加剂。
目前，此技术经过我们生产应用，其应用效果非常好，已在辽宁的沈阳、大连地区，河北和河南等地区广泛应用，获得了理想的应用效果。取得了很好的经济效益，我们已将产品实现了商品化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
本发明采用的菌种为常规的米曲霉沪酿3042和常规的酵母菌、乳酸菌、芽孢菌为有益微生物发酵菌群，米曲霉经过一级固体制曲、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌经过一级固体制种、二级液体种子罐扩繁培养（二级液体种子罐扩繁培养基以玉米浆干粉为主要原料）。将四种菌的种子液按比例混合，接种到经旋转蒸球灭过菌的发酵原料中，经过有氧固体发酵，得到高含量小肽饲料添加剂。
本发明具有发酵原料来源广泛价格低廉易于推广、生产工艺结构简单成本低易于操作、生产周期短发酵产物多产品质量好易于应用等特点。
本产品在海珍品、畜禽养殖中的饲料中添加应用，可以防病治病、提高免疫力，提高成活率，提高生长速度，提高品质；可以改善养殖环境,净化水质，是一种绿色的优质的饲料添加剂。
本发明的优点是：1.米曲霉蛋白利用率已达到60.60%～82.20%，氨基酸短链肽生成率已达到22.20%～26.20%以上。而枯草芽孢杆菌、酵母菌、乳酸菌等菌株蛋白利用率只是52.20%～58.30%，氨基酸短链肽生成率是12.10%～16.12%以上。
2.在微生物发酵过程中，通过加入米曲霉，采用多种微生物的协同作战，通过米曲霉产生酶系的催化作用，将原料中的大分子有机物逐步分解为简单物质，再经过复杂的物理化学和生物化学的反应，形成具有独特的发酵料风味。
3.在产品中含粗蛋白62.18%以上，产品中含小肽18.13%以上（小肽分子量为2000个道尔顿以下的肽段）；产品中含赖氨酸3.08%、蛋氨酸1.48%、苏氨酸1.46%、谷氨酸6.67%。
本发明产品功能是：1.提蛋白饲料利用率，让动物吃发酵制品；2.用生物制剂处理养殖动物的肠胃，调整菌群平衡，杀灭有害菌，减少抗生素的使用量；3.使用本产品可以明显的改善养殖环境。
本产品属于高蛋白肽类饲料添加剂，可以替代抗生素又有促长作用，此类产品在国内尚属首次报道和生产，现已引起国内外广泛的关注。
本发明生产工艺简单，产品应用效果好。在海珍品、畜禽养殖中的饲料中添加应用，可以防病治病、提高成活率，提高免疫力，提高生长速度，提高品质；可以改善养殖生态环境,净化水质，是一种绿色的高效、无毒、无害的优质的功能性饲料添加剂，具有广阔的市场前景。
为实现上述目的，具体操作步骤为：
1)单菌落分离：
将经活化的米曲霉斜面菌种，在新配置的米曲霉试管斜面接一环成熟的孢子，经培养，得到米曲霉单菌落种子。
将经活化的酵母菌、乳酸菌、芽孢菌斜面菌种，分别在新配置的酵母菌培养基、乳酸菌培养基、芽孢菌培养基的培养皿上涂布，经培养，分别得到酵母菌、乳酸菌、芽孢菌的单菌落种子。
2）一级固体种子培养：
将步骤1）中分别得到的米曲霉单菌落种子接种到米曲霉固体培养基中，固体种子培养瓶为500ml三角瓶，经培养，得到米曲霉的一级固体种子；
酵母菌单菌落种子、乳酸菌单菌落种子、芽孢菌单菌落种子，分别接种到酵母菌培养基、乳酸菌培养基、芽孢菌培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养，分别得到酵母菌、乳酸菌、芽孢菌的一级固体种子；
3）二级液体种子培养：将步骤2）中分别得到的米曲霉一级固体种子（500ml三角瓶）接种到二级种子罐液体培养基中。酵母菌、乳酸菌、芽孢菌一级固体种子(茄形扁瓶)接种到二级种子罐培养基中。种子罐的接种量为：一级固体种子（500ml三角瓶）(茄形扁瓶)与液体重量比为1瓶：100公斤，经培养，分别得到二级液体种子液。
4）米曲霉液体种子液浓度（cfu）≥100亿个/ml。
5）酵母菌液体发酵液浓度（cfu）≥50亿个/ml。
6）乳酸菌液体发酵液浓度（cfu）≥50亿个/ml。
7）芽孢菌液体发酵液浓度（cfu）≥100亿个/ml。
步骤3）所采用的米曲霉种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0～3.0%、玉米浆干粉1.0～3.0%、豆粕1.0～2.0%、麦麸皮1.0～2.0%、米糠1.0～2.0%、硫酸铵0.1～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水。种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20min;培养条件：接种量（质量）10～20%；罐压0.01～0.10Mpa、风量100:80～100:120vvm、转速100～200rpm、温度28℃～36℃；时间48～64h。
所采用的酵母菌种子罐的培养基和培养条件为：酵母菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0～4.0%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水。种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20min;培养条件：接种量10～20%；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:150vvm、转速180～220rpm、温度28℃～36℃；时间48～64h。
所采用的乳酸菌种子罐的培养基和培养条件为：乳酸菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.0%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水。种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20min;培养条件：接种量10～20%；罐压0.01～0.10MPa、风量100:0～100:100vvm、转速0～100rpm、温度28℃～36℃；时间48～72h（乳酸菌24小时后为静置培养，其它时间为通气培养）。
所采用的芽孢菌种子罐的培养基和培养条件为：芽孢菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5～1.5%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水。种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20min;培养条件：接种量10～20%；罐压0.01～0.10MPa、风量100:80～100:120vvm、转速100～200rpm、温度28℃～32℃；时间48～64h。
较佳方案如下：
所采用的米曲霉种子罐的培养基和培养条件为：米曲霉（液体种曲）种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、豆粕1.0%、麦麸子1.0%、米糠1.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%、余量为水。种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件为:接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:100vvm、转速120rpm、温度32℃、时间56h。
所采用的酵母菌种子罐的培养基和培养条件为：酵母菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:150vvm、转速200rpm、温度30℃、时间56h。
所采用的乳酸菌种子罐的培养基和培养条件为：乳酸菌种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.5%,玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:50vvm、转速50rpm、温度32℃、时间为64h（乳酸菌24小时后为静置培养）；
所采用的芽孢菌种子罐的培养基和培养条件为：芽孢菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:100vvm、转速150rpm、温度30℃、时间56h。
采用血球计数法测定米曲霉的孢子；。
采用平板计数法测定酵母菌、乳酸菌、芽孢菌的菌数。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，可按下列步骤具体操作：
实施例1：
米曲霉(Aspergillus oryzae)（产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和植酸酶）单菌落纯化、一级固体种子培养、二级液体种子培养、菌数的检查及其确定，具体操作步骤如下：
1）单菌落纯化与优选：将经活化米曲霉斜面菌种，接种到新配置米曲霉固体培养基中，固体种子培养瓶为500ml三角瓶，经培养（温度30℃、时间56h），得到米曲霉的一级固体种子；
米曲霉单菌落纯化用培养基：
豆汁1000ml波美5度、硫酸镁0.5g、可溶性淀粉20g、磷酸二氢钾1g、硫酸铵0.5g、PH6.0、琼脂20g。
米曲霉一级固体种子用培养基：
麦麸皮500g、面粉10g、葡萄糖10g、水400～425ml、pH自然。
2）培养:将上步骤1）中得到的米曲霉单菌落种子，用孢子接种到米曲霉一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为500ml三角瓶，经培养（温度32℃、时间56），得到米曲霉一级固体种子；
3）二级液体种子培养（选择培养基和培养条件试验）：采取深层发酵法生产种子液，将培养好的三角瓶米曲霉一级固体种子，用200mL无菌水洗下孢子，用火焰接种法接入发酵罐中，（发酵罐可以是500立升、1吨、2吨），装液量不超过其体积70%，通气发酵培养。培养成熟时，菌液有一种大豆固有香味，显微镜下检查米曲霉菌丝健壮，无杂菌污染，孢子发亮且圆大等现象，即可与其他三种菌液混合使用。
米曲霉菌的主要特点是:繁殖速度快、代谢产物多、适应性强、耐高温、应用范围广、不产黄曲霉毒素。
米曲霉二级液体种子培养基和培养条件试验
a、米曲霉二级液体种子养基配方试验：
试验设计和试验结果如下表1：
表1.米曲霉菌二级液体种子罐培养基配方试验
因子/水平 1 2 3
葡萄糖（g/l） 20 30 40
玉米浆干粉（g/l） 20 30 40
豆粕（g/l） 0 10 20
麦麸皮（g/l） 0 10 20
米糠（g/l） 0 10 20
硫酸铵（g/l） 0 1 2
磷酸氢二钾（g/l） 0 1 2
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
ｂ、米曲霉二级种子培养条件试验
试验设计和试验结果如下表2：
表2.米曲霉二级液体种子罐培养条件试验
因子/水平 1 2 3
罐压（mpa） 0.10 0.05 0.01
风量（vvm） 100:120 100:100 100:80
转速(rpm) 140 120 100
温度(℃) 36 32 28
时间(h) 64 56 48
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
通过表1、表2的试验结果确定的米曲霉二级液体种子罐的培养基配方和培养条件为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、豆粕1.0%、麦麸皮1.0%、米糠1.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%、余量为水。种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件为:接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:100vvm、转速120rpm、温度32℃、时间56h。
实施例2
酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)（产生蛋白酶、氨基酸、维生素、生物素）单菌落纯化、一级固体种子培养、二级液体种子培养、菌数的检查及其确定，具体操作步骤如下：
1）单菌落纯化与优选：将经活化的酵母斜面菌种,在新配置的酵母菌培养基的培养皿上涂布，经培养（温度30℃、时间56h），得到酵母单菌落种子。
酵母单菌落纯化、一级固体种子培养基为：20%马铃薯（土豆）浸出液1000mL、蔗糖20g、琼脂18g、PH6.8。
2）一级固体种子培养:将上步骤1）中得到的酵母单菌落种子，接种到酵母菌一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养（温度30℃、时间56h），得到酵母一级固体种子；
3）二级液体发酵培养（选择培养基和培养条件试验）：采取深层发酵法生产发酵液，将培养好的茄形扁瓶酵母一级固体种子，用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，（发酵罐可以是500立升、1吨、2吨），装液量不超过70%，通气发酵培养。培养成熟时，菌液有一种酒香味，显微镜下检查菌体健壮，无杂菌污染等异常现象，即可与其他三种菌液混合使用。
酵母菌二级液体种子培养基和培养条件试验
ａ、酵母菌二级液体种子培养基配方试验
试验设计和试验结果如下表3：
表3.酵母菌二级液体种子罐培养基配方试验
因子/水平 1 2 3
葡萄糖（g/l） 20 30 40
玉米浆干粉（g/l） 20 30 40
硫酸铵（g/l） 0 1 2
磷酸氢二钾（g/l） 0 1 2
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
ｂ、酵母菌酵母菌二级液体种子培养条件试验
试验设计和试验结果如下表4：
表4.酵母菌二级液体种子罐培养条件试验
因子/水平 1 2 3
罐压（mpa） 0.10 0.05 0.01
风量（vvm） 100:200 100:150 100:100
转速(rpm) 220 200 180
温度(℃) 32 30 28
时间(h) 64 56 48
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
通过表3、表4的试验结果确定的酵母菌种子罐的培养基和培养条件为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:150vvm、转速200rpm、温度30℃、时间56h。
4）酵母菌显微镜检查：酵母细胞形态大小约为2-5×5-30μm酵母多数为单细胞微生物,常呈卵圆形或者圆柱形。
5）酵母菌培养皿检查：平板培养基上的酵母菌落呈白色粒状凸起，有酒香味。
实施例3：
乳酸菌(Lactobacillus acidophilus)，（产生乳酸、乙酸和各种有机酸、乳酸菌素、肽类抗生素、蛋白酶、维生素等）单菌落純化与优选、一级固体种子培养、二级液体发酵培养具体操作步骤如下：
1）单菌落純化与优选：将经活化的乳酸菌菌斜面菌种，在新配置的乳酸菌培养基的培养皿上涂布，经培养（温度32℃、时间为64h），得到乳酸菌单菌落种子。
2）一级固体种子培养:将上步骤1）中得到的乳酸菌单菌落种子，接种到乳酸菌一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养（温度32℃、时间为64h），得到乳酸菌一级固体种子；
乳酸菌单菌落純化、一级固体种子培养培养基组成为：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、乙酸钠5g、柠檬酸二胺5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、碳酸钙20、1mL吐温80、水1000mL、PH7.0、琼脂20g。
3）二级液体种子培养：
采取深层发酵法生产发酵液，将培养好的茄形扁瓶乳酸菌一级固体种子，用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，（发酵罐可以是500立升、1吨、2吨），装液量不超过70%，通小气量发酵培养，温度为32℃，培养时间为64小时。显微镜下检查乳酸菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检乳酸菌菌活菌数可达50亿/ml（采用血球计数法计算菌数），无杂菌污染等异常现象，即可与其他三种菌液混合使用。
乳酸菌二级液体种子培养基和培养条件试验
ａ、乳酸菌二级液体种子培养基配方试验
试验设计和试验结果如下表5：
表5.乳酸菌二级液体种子罐培养基配方试验
因子/水平 1 2 3
葡萄糖（g/l） 10 15 20
玉米浆干粉（g/l） 20 30 40
硫酸铵（g/l） 0 1 2
磷酸氢二钾（g/l） 0 1 2
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
ｂ、乳酸菌二级液体种子罐培养条件试验
试验设计和试验结果如下表6：
表6.乳酸菌二级液体种子罐培养条件试验
因子/水平 1 2 3
罐压（mpa） 0.10 0.05 0.01
风量（vvm） 100:100 100:50 100:0
转速(rpm) 100 50 0
温度(℃) 36 32 28
时间(h) 72 64 56
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
通过表5、表6的试验结果确定的乳酸菌种子罐的培养基和培养条件分别为:葡萄糖1.5%,玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:50vvm、转速50rpm、温度32℃、时间为64h（乳酸菌24小时后为静置培养）；
实施例4：
芽孢菌，这里指的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),是细菌微生物，（主要分解蛋白作用合成氨基酸和肽类物质）。单菌落純化与优选、固体一级种子培养、液体二级发酵培养具体操作步骤如下：
枯草芽孢杆菌具有繁殖速度快、耐高温、耐酸碱、耐挤压、稳定性能好、应用范围广等特点。
1）单菌落纯化与优选：将经活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种，在新配置的枯草芽孢杆菌培养基的培养皿上涂布，经培养（温度30℃、时间为56h），得到枯草芽孢杆菌单菌落种子。
2）一级固体种子培养:将上步骤1）中得到的枯草芽孢杆菌单菌落种子，接种到枯草芽孢杆菌一级固体种子培养基中，固体种子培养瓶为200ml茄形扁瓶，经培养（温度30℃、时间为56h），得到枯草芽孢杆菌一级固体种子；
芽孢菌单菌落純化、一级固体种子培养培养基组成为：葡萄糖10g、蛋白胨10g、牛肉膏5g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾2g、水1000mL、PH7.0、琼脂20g。
3）二级液体发酵培养：
采取深层发酵法生产种子液，将培养好的茄形扁瓶菌一级固体种子，用200mL无菌水洗入至500mL无菌的三角瓶中，用火焰接种法或压差接种到发酵罐中，（发酵罐可以是500立升、1吨、2吨），装液量不超过70%。显微镜下检查菌菌体运动活泼，健壮，整齐，无杂菌，无异味，无污染等异常现象，镜检嗜酸乳杆菌活菌数可达100亿/ml（采用血球计数法计算菌数），无杂菌污染等异常现象，即可与其他三种菌液混合使用。
芽孢菌二级液体种子罐培养基和培养条件试验
ａ、芽孢菌二级液体种子罐培养基配方试验，
试验设计和试验结果如下表7：
表7.芽孢菌二级液体种子罐培养基配方试验
因子/水平 1 2 3
葡萄糖（g/l） 5 10 15
玉米浆干粉（g/l） 20 30 40
硫酸铵（g/l） 0 1 2
磷酸氢二钾（g/l） 0 1 2
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
ｂ、芽孢菌二级液体种子罐培养条件试验
试验设计为5因素3水平，试验设计和试验结果如下表8：
表8.芽孢菌二级液体种子罐培养条件试验
因子/水平 1 2 3
罐压（mpa） 0.10 0.05 0.01
风量（vvm） 100:120 100:100 100:80
转速(rpm) 200 150 100
温度(℃) 32 30 28
时间(h) 64 56 48
菌数测定结果（cfu亿个/ml）
通过表7、表8的试验结果确定的芽孢菌种子罐的培养基和培养条件为：芽孢菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20min;培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:100vvm、转速150rpm、温度30℃、时间56h。
实施例5：
1)固体发酵料培养：将米曲霉、酵母菌、乳酸菌、芽孢菌经过一级固体制种、二级液体种子罐扩繁培养（二级液体种子罐扩繁培养基以玉米浆干粉为主要原料）。将实施例1-4获得的四种菌的种子液，按照米曲霉30份、酵母菌10份、乳酸菌10份、芽孢菌10份的比例混合，接种到经旋转蒸球灭过菌的发酵原料中，经通风供氧培养,得到高含量小肽饲料添加剂。
2)固体发酵料中各种原料重量比例：豆粕100份、麦麸皮10份、米糠10份；发酵原料与二级液体种子液的重量比为;发酵原料100份:米曲霉30份:酵母菌10份:乳酸菌10份:芽孢菌10份。
经通风供氧，通气量0.5V／V·min(通风供氧指经过滤的空气,采用的过滤介质有棉花；活性炭或玻璃纤维、或有机合成纤维等)，发酵培养,不同含水量的固体发酵料对温度的影响见下表：
表9.不同含水量的固体发酵料对微生物发酵温度的影响（℃）
序号 料液比 0h 12h 24h 36h 48h 64h 72h 90h 108h
1 100:60 20 35 45 55 55 50 40 35 30
2 110:80 20 35 45 60 60 55 45 40 30
3 120:100 20 35 45 60 60 55 45 40 35
*室温20℃±1℃ *2013年5月6日：
※1:发酵原料100份，加入60份菌液，相对含水量43.75%，重量含水量77.77%；
※2:发酵原料110份，加入80份菌液，相对含水量47.89%，重量含水量91.91%；
※3:发酵原料120份，加入100份菌液，相对含水量50.93%,重量含水量103.70%；
※原料中含水量按照10%计算
为了发酵操作方便和表述计算方便自定义：
※相对含水量%=
｛（加入的发酵菌液+发酵原料里含的水）/（发酵原料+加入的发酵菌液）｝×100%
※重量含水量%=｛（加入的发酵菌液/发酵原料里含的水）/发酵原料烘干重量｝×100%
在上述固体发酵料配方的情况下，表9试验果表明：固体发酵在发酵床上进行通风有氧培养，发酵料的起始质量含水量43.8%～50.9%(相对含水量)，起始温度为20℃～30℃，发酵过程控制温度为30℃～60℃，发酵时间应控制在100～120小时；且使发酵温度于40℃持续48小时以上后，通过翻倒、通风加氧，可使发酵料温度下降至30℃以下，物理反应和生化反应结束，发酵料有酒香和乳酸味产生，PH值为4.0～5.0，发酵达到终点；
对发酵床上发酵料进行通风，降低质量含水量到20～25%，然后传输到流化床上，在50℃～60℃条件下烘干，烘干到质量含水量≤10%，粉碎、过筛。
通过表9的试验结果确定的固体发酵料，发酵时的含水量为43.8%(相对含水量)。
粉碎处理条件：在无菌洁净条件下进行，粉碎后粒度100目、含水量10%，为合格产品。
实施例6：
将实施例5获得的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的产品,在仔猪（分3组2271头）的基础日粮（采用沈阳博善英胜生物技术有限公司生产的仔猪料（或也可采用辽宁蔚兰生物技术有限责任公司生产的仔猪料），日粮营养水平：蛋白质20%、赖氨酸1.25%、脂肪5%）中按0.1～0.2%添加，进行饲养试验，结果见表10：
表10.一种用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的产品对仔猪日增重和料重比的影响
通过表10可以看出：试验组1、试验组2比对照组，日增重明显增加，腹泻发病率明显下降。
采食量：每头仔猪每天的进食量；日增重：每头仔猪每天的增加量。
实施例7
将实施例5获得的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的产品,在海蓝褐色壳蛋鸡日粮（采用沈阳博善英胜生物技术有限公司生产的仔猪料（或也可采用辽宁蔚兰生物技术有限责任公司生产的仔猪料），日粮营养水平：粗蛋白17.7%、赖氨酸0.88%、代谢能11.1%）中按0.2%添加，进行饲养试验，结果见表11：
表11米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂产品对海蓝褐色蛋鸡鸡群生产性能的影响
由表11可以看出：在两组分别为287只海蓝褐色壳蛋鸡，经35天试验期，试验组比对照组（日粮中不添加实施例5获得的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的产品,产蛋率提高2.02%，日单产提高1.44g/只，死淘率降低1.8%，料蛋比降低6.0%，总产蛋量提高15.4kg，并且蛋壳硬度加强，亮，光泽好，颜色均匀一致，鸡粪成型，臭味、氨气味减轻,养殖环境明显改善。
实施例8：
将实施例5获得的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的产品,在幼参中进行应用试验，添加量为：试验组1（分为试验1-1、试验1-2二个水池）每天每个水体（m3）5g；试验组2（分为试验2-1、试验21-2二个水池）为每天每个水体（m3）3g；对照组（分为对照1、对照2二个水池）每天每个水体（m3）用5毫升海水；应用方法为泼洒，试验结果见表12：
表12.用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的产品对海参增重的影响
*试验时间：2013年3月1日～2013年3月15日；参池水温16℃；
*水体：长×宽×高＝1m×1m×1m＝1m3(立方米水体)
通过表12可以看出，在水温16℃时，经过15天的喂养，试验组1平均增重率22.9，试验组2平均增重率20.6，对照组平均增重率17.7，试验组的平均增重率明显高于对照组平均增重率，海参养殖中应用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的产品效果明显。
本发明具有生产工艺简单，易于操作、生产原料来源广，泛成本低易于推广、生产周期短发酵产物多，产品质量好，易于应用等特点。在畜牧水产中应用，可提高成活率，可提高免疫力，可加快生长发育,可改善养殖环境，是一种理想的优质微生物饲料添加剂饵料。
为提高产品质量，缩短生产周期，申请人还试用了中国科学院沈阳应用生态研究所分离、纯化并鉴定的高活性微生物菌株（如：酿酒酵母、嗜酸乳杆菌、、和光合细菌混合用）其应用效果更佳。

Claims (8)

1.用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：以豆粕、麦麸皮、米糠为发酵原料；以米曲霉为主，兼有酵母菌、乳酸菌、枯草芽孢杆菌为有益微生物发酵菌群，发酵原料中各种原料的重量比为; 豆粕100～120份: 麦麸皮10～20份: 米糠10～20份；发酵原料与有益微生物发酵菌群种子液的重量比为; 发酵原料100～120份: 米曲霉30～40份: 酵母菌10～20份: 乳酸菌10～20份: 枯草芽孢杆菌10～20份；
固体发酵在发酵床上进行通风有氧培养，发酵原料的起始相对含水量43.8%～50.9%，起始温度为20℃～30℃，发酵过程控制温度为40℃～60℃，发酵时间应控制在100～120小时； 且使发酵温度于40℃以上持续48小时以上后，翻倒、通风加氧，物理反应和生化反应结束，发酵料有酒香和乳酸味产生，pH值为4.0～5.0，发酵达到终点；
对发酵床上发酵料进行通风，降低相对含水量到20～25%，然后传输到流化床上，在50℃～60℃条件下烘干，烘干到质量含水量≤10%，粉碎、过筛；按百分含量计，发酵所得的产品中含粗蛋白62.18%以上；
产品中含小肽18.13%以上，小肽分子量为2000个道尔顿以下的肽段；
按百分含量计，产品中含赖氨酸3.08%、蛋氨酸1.48%、苏氨酸1.46%、谷氨酸6.67%。
2.按照权利要求1所述的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述固体发酵过程中，发酵原料中各种原料最佳重量比为：豆粕100份: 麦麸皮10份:米糠10份。
3.按照权利要求1所述的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述固体发酵过程中，发酵原料与微生物发酵菌群种子液的最佳重量比为；发酵原料100份: 米曲霉30份: 酵母菌10份: 乳酸菌10份: 枯草芽孢杆菌10份。
4.按照权利要求3所述的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：
所述发酵菌群种子液发酵在种子罐中分别培养，培养后种子罐中米曲霉种子液中每毫升含孢子数≥100个亿；酵母菌、乳酸菌种子液中每毫升含活菌数≥50个亿；枯草芽孢杆菌芽孢菌种子罐中每毫升含活菌数≥100个亿。
5.按照权利要求1所述的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：固体发酵料在发酵床上进行通风有氧培养，发酵原料起始相对含水量为43.8%，起始温度为20℃，过程控制温度为40℃～60℃，时间控制在100小时； 且使发酵温度于40℃以上持续48小时以上后，翻倒、通风加氧，物理反应和生化反应结束，发酵料有酒香和乳酸味产生，pH值为5.0，发酵达到终点；
继续对发酵床进行通风，发酵料含水量降低到20%～25%，然后传输在到流化床上，在50～60℃条件下烘干，烘干到含水量≤10%，粉碎、过筛。
6.按照权利要求4所述的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：所述米曲霉种子罐的培养基和培养条件为：米曲霉种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0～3.0%、玉米浆干粉1.0～3.0%、豆粕1.0～2.0%、麦麸子1.0～2.0%、米糠1.0～2.0%、硫酸铵0.1～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20 min; 培养条件：接种量质量百分数为10～20%；罐压0.01～0.10Mpa、风量100:80～100:120vvm、搅拌转速100～200rpm、温度28℃～36℃；时间48～64h；
所述酵母菌种子罐的培养基和培养条件为：酵母菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖2.0～4.0%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20 min; 培养条件：接种量10～20%；罐压0.01～0.10MPa、风量100:100～100:150vvm 、搅拌转速180～220rpm、温度28℃～36℃；时间48～64h；
所述乳酸菌种子罐的培养基和培养条件为：乳酸菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0～2.0%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20 min; 培养条件：接种量10～20%；罐压0.01～0.10MPa、风量100:0～100:100vvm 、搅拌转速0～100rpm、温度28℃～36℃；时间48～72h，其中乳酸菌24小时后为静置培养，其它时间为通气培养；
所述枯草芽孢杆菌种子罐的培养基和培养条件为：枯草芽孢杆菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖0.5～1.5%、玉米浆干粉2.0～4.0%、硫酸铵0～0.2%、磷酸氢二钾0～0.2%，余量为水，种子罐灭菌条件：灭菌0.08～0.10MPa、115～121℃、18～20 min; 培养条件：接种量10～20%；罐压0.01～0.10MPa、风量100:80～100:120vvm 、搅拌转速100～200rpm、温度28℃～32℃；时间48～64h。
7.按照权利要求6所述的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：
所述米曲霉种子罐的培养基和培养条件为：米曲霉种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、豆粕1.0%、麦麸子1.0%、米糠1.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20 min; 培养条件为: 接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:100vvm、搅拌转速120rpm、温度32℃、时间56h；
所述酵母菌种子罐的培养基和培养条件为： 酵母菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖3.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20 min; 培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:150vvm、搅拌转速200rpm、温度30℃、时间56h；
所述乳酸菌种子罐的培养基和培养条件为：乳酸菌种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.5%, 玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%，余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20 min; 培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:50vvm、搅拌转速50rpm、温度32℃、时间为64h,乳酸菌培养24小时后为静置培养；
所述枯草芽孢杆菌种子液的培养基和培养条件为： 枯草芽孢杆菌的种子罐培养基以重量百分比计为：葡萄糖1.0%、玉米浆干粉3.0%、硫酸铵0.1%、磷酸氢二钾0.1%、余量为水；种子罐灭菌条件：灭菌0.10MPa、121℃、20 min; 培养条件：接种量20%；罐压0.05Mpa、风量100:100vvm、搅拌转速150rpm、温度30℃、时间56h。
8.按照权利要求1所述的用米曲霉固体发酵豆粕生产小肽饲料添加剂的方法，其特征在于：
所述的生产方法属规模化生产，在种子液体培养中，种子罐采用1吨罐或2吨罐发酵，并采用4套分别对应米曲霉、酵母菌、乳酸菌和枯草芽孢杆菌的深层发酵过程；在原料配料中采用3～5仓100吨全自动配料方法；在固体发酵中采用自动式履带传输系统，混料、接菌、铺料、发酵、通风、烘干、计量、包装过程，全部程序化控制，自动化生产。
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