CN109423465A - 一种控制黄曲霉毒素b1的复合生物制剂及其应用 - Google Patents

一种控制黄曲霉毒素b1的复合生物制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂及其应用，所述的复合生物制剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和酵母细胞壁复配制成。本发明中的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和屎肠球菌能够有效抑制饲料中霉菌生长。本发明有效结合了生物降解和生物吸附两种饲料中黄曲霉毒素B1的脱毒方法，其中枯草芽孢杆菌具有高效降解黄曲霉毒素B1的能力，酵母细胞壁可以有效吸附黄曲霉毒素B1。此外，本发明中的复合生物制剂不仅可以达到防霉、脱霉功能，还具有微生物的益生效果。

Description

一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂及其应用
技术领域
本发明涉及饲料技术领域，具体地，本发明涉及一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂的制备及其应用方法。
背景技术
黄曲霉毒素是毒性最大的一类霉菌毒素，广泛存在于霉变的花生、玉米等粮食作物和肉奶食品中。
黄曲霉毒素主要是由黄曲霉(Asergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)等病原真菌产生的一大类结构相似的次级代谢产物。目前已经发现的黄曲霉毒素及其衍生物有18种，包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、ML、M2以及B2a、G2a、P1、Q1、R0等，除黄曲霉毒素B1、B2和G1、G2为天然产生之外，其余均为它们的衍生物。其中以黄曲霉毒素B1毒性最大，对动物有剧烈急性毒性和明显慢性毒性，具有很强致突变、致畸作用。研究表明，黄曲霉毒素B1在动物体内的靶器官是肝脏，容易损害并引发肝炎、肝硬化、肝坏死等病症。基于黄曲霉毒素的巨大危害，世界各国对食品和词料中的黄曲霉毒素都做出了严格规定，我国的食品安全限量标准为5-20μg/kg，饲料卫生标准规定的饲料中黄曲霉毒素B1安全限量标准为10-50μg/kg，欧盟的黄曲霉毒素限量标准是国际上最严格的，黄曲霉毒素B1不得超过2μg/kg，总的黄曲霉毒素含量不得超过4μg/kg。为保障食品安全和人类健康，减少霉菌毒素对人类和畜禽的危害，就需要消除饲料和食品中霉菌毒素的污染。目前，霉菌毒素的控制措施主要包括两个方面：一是防止霉菌毒素的产生；二是霉菌毒素脱毒。现有的脱毒措施主要包括物理脱毒、化学脱毒、吸附脱毒和生物脱毒等。但是，物理脱毒实用性较差，化学脱毒存在影响动物安全和适口性的问题，均无法满足生产需求。目前，吸附脱毒技术是较为成熟，应用较广泛的脱毒方法。生物脱毒则被认为是去除饲料中霉菌毒素的最佳方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和酵母细胞壁复配制成的复合生物制剂，有效结合生物降解和生物吸附两种饲料中黄曲霉毒素B1的脱毒方法，达到预防和清除饲料中黄曲霉毒素B1的效果。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂，由枯草芽孢杆菌(保藏编号为CGMCCNO.14442)、地衣芽孢杆菌(保藏编号为CGMCC NO.14441)、屎肠球菌(保藏编号为CGMCCNO.9666)和酵母细胞壁组成。
优选的，所述每克复合生物制剂中枯草芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g。
优选的，所述每克复合生物制剂中地衣芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g。
优选的，所述每克复合生物制剂中屎肠球菌活菌数为108-1010CFU/g。
优选的，所述每克复合生物制剂中甘露寡糖(酵母细胞壁成分)质量百分含量为1％-4％。
本发明的复合生物制剂中枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时；
(2)将斜面培养的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，装液量为50-150mL/500mL，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时；
(3)将枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌种子液以0.1-0.5％重量比接种于种子罐中，装液量为50-150L/500L，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时；
(4)将种子罐培养液以0.1-0.5％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05MPa，搅拌转速为120-180转/分，以体积比计，通风比为0.5-1：0.1-0.5，，发酵时间为12-24小时；
步骤(1)中斜面培养基组成：牛肉浸膏1.0-5.0g，大豆蛋白胨5.0-15.0g，酵母膏1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-10.0g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0；
步骤(2)中种子培养基组成：蛋白胨5-15g，牛肉膏0.1-2g，氯化钠0.1-3g，蒸馏水1000mL，pH为7.4；
步骤(3)中种子罐培养基组成：玉米粉0.1-0.5％，葡萄糖0.1-1.0％，豆饼粉0.1-3％，鱼粉0.01-0.1％，碳酸钙0.1-2％，硫酸铵0.01-0.05％，磷酸氢二钾0.001-0.01％，硫酸镁0.001-0.01％和硫酸锰0.001-0.01％；
步骤(4)中发酵培养基组成：酵母粉0.1-3％、0.1-3％的豆粕水解液0.1-3％、葡萄糖0.1-1％、玉米淀粉0.1-1.5％、碳酸钙0.1-0.5％，pH为7.0-7.5。
本发明屎肠球菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将屎肠球菌接种于MRS固体斜面培养基，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时；
(2)将斜面培养的屎肠球菌接种于种子培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时；
(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐，在30-40℃有氧或兼性条件培养12-24小时；
以上所述步骤(1)中MRS斜面培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6g，琼脂粉16g，蒸馏水1000mL，121℃，灭菌30min。
步骤(2)中种子培养基为MRS斜面培养基中去除琼脂粉。
步骤(3)中改良MRS培养基组成：大豆蛋白胨5-30g，葡萄糖1-10g，酵母粉1-10g，乙酸钠1-10g，拧檬酸二胺0.1-8g，Tween80 0.1-5g，磷酸氢二钾0.1-5g，硫酸镁0.05-lg，硫酸锰0.001-0.2g，碳酸钙1-30g，蒸馏水1000mL，调节pH值5.5-7.5。
将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和屎肠球菌发酵液与酵母细胞壁混合，混合后枯草芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g，地衣芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g，屎肠球菌活菌数为108-1010CFU/g，酵母细胞壁的量以甘露寡糖计，甘露寡糖含量为1％-4％。
本发明还提供一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂的应用方法，将复合生物制剂按照0.05-0.1％添加量加入到饲料中，可以抑制霉菌生长，预防饲料中黄曲霉毒素B1产生；将复合生物制剂按照0.1-0.2％添加量加入到饲料中，可以有效清除霉变饲料中的黄曲霉毒素B1。
本发明的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和酵母细胞壁在防霉和脱霉的同时，还具有微生物的益生功能，可维持动物肠道健康，增强机体免疫力，减少饲养过程中抗生素药物的使用，为食品产品提供保证。
本发明的枯草芽孢杆菌CA01005(Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌CA02003(Bacillus licheniformis)已于2017年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号分别为CGMCC NO.14442、CGMCC NO.14441。屎肠球菌CE001(Enterococcus Faecium)已于2014年9月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9666。
本发明有效结合了生物降解和生物吸附两种饲料中黄曲霉毒素B1的脱毒方法，其中枯草芽孢杆菌具有高效降解黄曲霉毒素B1的能力，酵母细胞壁可以有效吸附黄曲霉毒素B1。此外，本发明中的复合生物制剂不仅可以达到防霉、脱霉功能，还具有微生物的益生效果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明的技术方案：
实施例1黄曲霉拮抗菌株和降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选及鉴定
1材料方法
1.1试验材料
1.1.1试剂
香豆素，黄曲霉毒素B1，黄曲霉毒素B1检测试剂盒。
1.1.2培养基
(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基38g，蒸馏水(ddH2O)1000mL，121℃，灭菌30min。
(2)马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基
马铃薯葡萄糖肉汤培养基35g，蒸馏水(ddH2O)1000mL，121℃高压灭菌30min。
(3)液体活化培养基
蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水(ddH2O)1000mL，121℃高压灭菌30min。
(4)初筛培养基
磷酸二氢钾0.25g、七水硫酸镁0.25g、硝酸钾0.50g、硫酸铵0.50g、氯化钙0.005g、6水氯化铁0.003g、琼脂粉18g，蒸馏水1000mL，pH值7.0，121℃灭菌30min。用沸水溶解香豆素，按1:3的比例加入香豆素溶液使其最终含量为0.1％。
(5)发酵培养基
牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、氯化钠8.5g、磷酸二氢钾1.0g、蒸馏水1000mL，pH值6.5，121℃灭菌30min。
1.1.3试验菌种
病原菌：黄曲霉。
益生菌：芽孢杆菌(CA01005、CA01027、CA01052、CA01103、CA01185、CA01216、CA02003、CA02011、和CA02105)，乳酸菌(屎肠球菌CE001、CB01032、CB01079、CB010107、CB010168和CB01216)。
以上菌株均由北京科为博生物技术研究院分离保藏。
1.2试验方法
1.2.1黄曲霉拮抗菌株的筛选
1.2.1.1菌种的活化
将黄曲霉菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，于30℃倒置培养，待形成孢子后备用。
将益生菌接种到液体活化培养基中，37℃，180rpm，培养16h。
1.2.1.2试验步骤
(1)将培养好的黄曲霉菌种用无菌水冲洗，制成106的孢子悬液；
(2)将益生菌的活化液采用平板计数法计数，用无菌水制成106悬液；
(3)按照1％接种量，分别将黄曲霉孢子悬液与益生菌悬液接种到同一马铃薯葡萄糖肉汤液体培养基中，以单独接种黄曲霉孢子悬液的为空白对照于30℃，160rpm，培养48h；
(4)培养完成后，将培养液过滤(除去益生菌菌体)后，称取黄曲霉菌体湿重。抑菌率计算公式：
抑菌率(％)＝(空白对照组湿重-益生菌处理组湿重)/空白对照组湿重×100％1.2.2降解黄曲霉毒素B1菌株的筛选
(1)初筛
将保藏菌种分别在初筛培养基平板上重复划线3次，37℃培养，选取生长良好的菌株。
(2)复筛
用无菌接种环挑取适量菌体，接种于装有30mL发酵培养基的100mL三角瓶中，37℃、180rpm、培养16小时制成种子液。取0.5mL种子液接种于含有9.45mL发酵培养基的50mL发酵管中加入0.5mL质量浓度为100μg/mL的黄曲霉毒素B1，使其终浓度为500μg/L，37℃、180rpm、培养72h。然后使用黄曲霉毒素B1检测试剂盒检测黄曲霉毒素B1含量。
1.2.3菌种鉴定
gyrB基因序列分析：细菌总DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化(北京)科技有限公司，Tiangen DP302-02)提取。gyrB基因扩增引物为：gyrBF：5'–GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'；gyrBR：5'–AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'。反应体系(20μL)：1μLDNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.2μL Easy Taq、2μL dNTPs、2μL 10×Easy Taq Buffer、14μL ddH2O，以上成分于冰上添加，混匀后离心；PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后送睿博兴科生物技术(北京)有限公司进行序列测定。得到的基因序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对。
2结果
从表1中可以看出，益生菌菌株均对黄曲霉的生长有抑制能力，其中芽孢杆菌的CA01005、CA02003菌株和屎肠球菌CE001菌株抑菌能力较强，抑菌率大于70％。表明，益生菌能够抑制黄曲霉孢子的萌发，减缓其生长速度。
表1黄曲霉菌体湿重及抑菌率
2.2降解黄曲霉毒素B1的筛选
通过3次重复划线培养初筛，得到5株(CA01005、CA01052、CA02003、CA02105和CA01216)能在以香豆素为唯一碳源的培养基上稳定生长的菌株。采用发酵复筛，得到一株能够降解黄曲霉毒素B1的菌株CA01005，黄曲霉毒素B1降解率达到88.6％。2.3菌株的鉴定
通过gyrB基因序列鉴定，CA02003菌株与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的相似性为99％，确定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，菌株CA01005与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的相似性为99％，确定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌株于2017年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为分别为CGMCC NO.14441和CGMCC NO.14442。
实施例2控制黄曲霉毒素B1复合生物制剂的制备
1.枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时。
(2)将斜面培养的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，装液量为50-150mL/500mL，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时。
(3)将枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌种子液以0.1-0.5％重量比接种于种子罐中，装液量为50-150L/500L，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时。
(4)将种子罐培养液以0.1-0.5％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05MPa，搅拌转速为120-180转/分，通风比为0.5-1：0.1-0.5(体积比)，发酵时间为12-24小时。
上述步骤(1)中斜面培养基组成：牛肉浸膏1.0-5.0g，大豆蛋白胨5.0-15.0g，酵母膏1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-10.0g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0；
步骤(2)中种子培养基组成：蛋白胨5-15g，牛肉膏0.1-2g，氯化钠0.1-3g，蒸馏水1000mL，pH为7.4；
步骤(3)中种子罐培养基组成：玉米粉0.1-0.5％，葡萄糖0.1-1.0％，豆饼粉0.1-3％，鱼粉0.01-0.1％，碳酸钙0.1-2％，硫酸铵0.01-0.05％，磷酸氢二钾0.001-0.01％，硫酸镁0.001-0.01％和硫酸锰0.001-0.01％；
步骤(4)中发酵培养基组成：酵母粉0.1-3％、0.1-3％的豆粕水解液0.1-3％、葡萄糖0.1-1％、玉米淀粉0.1-1.5％、碳酸钙0.1-0.5％，pH为7.0-7.5。
2.屎肠球菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将屎肠球菌接种于MRS固体斜面培养基，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时。
(2)将斜面培养的屎肠球菌接种于种子培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时。
(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐，在30-40℃有氧或兼性条件培养12-24小时。
以上所述步骤(1)中MRS斜面培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6g，琼脂粉16g，蒸馏水1000mL，121℃，灭菌30min。步骤(2)中种子培养基为上述MRS斜面培养基中去除琼脂粉。步骤(3)中改良MRS培养基组成：大豆蛋白胨5-30g，葡萄糖1-10g，酵母粉1-10g，乙酸钠1-10g，拧檬酸二胺0.1-8g，Tween80 0.1-5g，磷酸氢二钾0.1-5g，硫酸镁0.05-lg，硫酸锰0.001-0.2g，碳酸钙1-30g，蒸馏水1000mL，调节pH值5.5-7.5。
3.将枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和屎肠球菌发酵液与酵母细胞壁混合，混合后枯草芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g，地衣芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g，屎肠球菌活菌数为108-1010CFU/g，酵母细胞壁的量以甘露寡糖计，甘露寡糖含量为1％-4％。
实施例3黄曲霉毒素B1脱毒效果
在霉变饲料中加入不同脱毒产品，对比黄曲霉毒素B1脱毒效果，从表2中可以看出，复合生物制剂对黄曲霉毒素B1降解率明显高于酵母细胞壁。
表2不同制剂黄曲霉毒素B1脱毒试验
在霉变饲料中加入本发明实例2制备的不同添加量的复合生物制剂后，从表3结果可以看出，各添加量均可不同程度的降解黄曲霉毒素B1，其中复合生物制剂添加量为2‰时，对黄曲霉毒素B1的降解率最高为96.22％，降解效果显著。
表3不同添加量复合生物制剂黄曲霉毒素B1脱毒试验
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 北京科为博生物科技有限公司
<120> 一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1113
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)
<400> 1
cacggttgac atcttcaccg cttccggtgc caagggcggt gatcatagaa cgaacctcat 60
tgttggacaa tattttgtcc aggcgggctt tttcgacgtt caaaattttc cctctcaaag 120
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ggttttctag cagaaacttt tcaagcgctt ctgaaaatag cgcatctgtt atcgtacgcg 420
cttctgagtt gccgagcttt gttttcgtct gcccttcaaa ttgaggatcc gggtgcttga 480
ttgaaataat cgctgtcaaa ccttcccgga cgtcttctcc gcttaagttc ggatcgcttt 540
ctttgaatac gccgtttctt ctcgcgtaat cattgatgac cctcgtcaaa ccggtcttaa 600
agccggcttc atgggttccg ccttcatacg tatgaatgtt gttagcaaat gaataaatgt 660
tgcttgtata gctgtcattg tattgaagag ccacctcgac tgtaatgccg tctttggatc 720
cttcaatata gaccggctct tcatgaataa cttcccgcga acggttcaag tgttcaacat 780
agcttttaat accgccttca tagcagtatt cattcttgcg ttcttttcct tctcgcttgt 840
cttcgatcgt gattttgacg ccttttgtca agaaagcgag ttcgcggaca cgagtggcga 900
gcgtatcata gtcgtattca gtcgtttccg tgaatatttc cggatcaggc ttgaagtgtg 960
tggtcgttcc cgtcacttcc gtatctccaa tgactttcaa atcagctttc ggaacgccac 1020
gttcaaattc ctgataatgg atttttccat ctctgtaaac cgttacatcc agctcggttg 1080
aaagggcgtt aacatcagaa gcaccgacgc cgt 1113
<210> 2
<211> 1149
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400> 2
ataagtgtcc ggaggattac acggtgtagg tgcgtcagtt gtaaacgcgc tttcaacgga 60
gcttgatgtg acggtacacc gtgacggtaa aatccaccgc caaacctata aacgcggagt 120
tccggttgca gaccttgaaa tcattggcga aacggatcat acaggaacga cgacacattt 180
tatcccggat cctgagattt tcacagaaac aactgtgtat gattatgatc tgcttgctaa 240
ccgcgtgcgc gaattagcct ttttgacaaa aggcgtcaac atcacgattg aagataaacg 300
tgaaggacaa gagcgcaaaa atgagtacca ttacgaaggc ggaattaaaa gttatgtaga 360
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ggacggcatt acggttgaag tggctttgca atacaatgac agctacacaa gcaacattta 480
ctcgtttaca aacaacatta acacgtatga aggcggtacc cacgaagctg gtttcaaaac 540
gggtctgact cgtgttatca acgattacgc cagaaaaaaa gggcttatta aggaaaatga 600
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aggtaaaatc ctgaacgttg aaaaagccag attggataaa atcctatcta acaacgaagt 1080
gcgctctatg atcacagcgc tcggcacggg tatcggggaa gatttcaacc tggagaaagc 1140
ccgttacca 1149

Claims (8)

1.一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂，其特征在于，所述复合生物制剂由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和酵母细胞壁组成；枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNO.14442，地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC NO.14441，屎肠球菌的保藏编号为CGMCCNO.9666。
2.根据权利要求1所述的一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂，其特征在于，复合生物制剂中枯草芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g，地衣芽孢杆菌活菌数为108-1010CFU/g，屎肠球菌活菌数为108-1010CFU/g，酵母细胞壁的量以甘露寡糖计，甘露寡糖质量百分含量为1％-4％。
3.根据权利要求1所述的一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：
1)将枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时；
2)将斜面培养的枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌菌落接种于种子培养基中，装液量为50-150mL/500mL，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时；
3)将枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌种子液以0.1-0.5％重量比接种于种子罐中，装液量为50-150L/500L，在30-40℃、120-180转/分的条件下培养12-24小时；
4)将种子罐培养液以0.1-0.5％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05MPa，搅拌转速为120-180转/分，以体积比计，通风比为0.5-1：0.1-0.5，发酵时间为12-24小时。
4.根据权利要求3所述的一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂，其特征在于，
步骤1)中斜面培养基组成：牛肉浸膏1.0-5.0g，大豆蛋白胨5.0-15.0g，酵母膏1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-10.0g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0；
步骤2)中种子培养基组成：蛋白胨5-15g，牛肉膏0.1-2g，氯化钠0.1-3g，蒸馏水1000mL，pH为7.4；
步骤3)中种子罐培养基组成：玉米粉0.1-0.5％，葡萄糖0.1-1.0％，豆饼粉0.1-3％，鱼粉0.01-0.1％，碳酸钙0.1-2％，硫酸铵0.01-0.05％，磷酸氢二钾0.001-0.01％，硫酸镁0.001-0.01％和硫酸锰0.001-0.01％；
步骤4)中发酵培养基组成：酵母粉0.1-3％、0.1-3％的豆粕水解液0.1-3％、葡萄糖0.1-1％、玉米淀粉0.1-1.5％、碳酸钙0.1-0.5％，pH为7.0-7.5。
5.根据权利要求1所述的一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂，其特征在于，所述屎肠球菌的生产方法包括如下步骤：
1)将屎肠球菌接种于MRS固体斜面培养基，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时；
2)将斜面培养的屎肠球菌接种于种子培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养12-24小时；
3)将步骤2)所获得的种子液接种于发酵罐，在30-40℃有氧或兼性条件培养12-24小时。
6.根据权利要求5所述的一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂，其特征在于，
所述步骤1)中MRS斜面培养基组成：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温-80 1mL，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6g，琼脂粉16g，蒸馏水1000mL，121℃，灭菌30min；
步骤2)中种子培养基为MRS斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤3)中改良MRS培养基组成：大豆蛋白胨5-30g，葡萄糖1-10g，酵母粉1-10g，乙酸钠1-10g，拧檬酸二胺0.1-8g，Tween80 0.1-5g，磷酸氢二钾0.1-5g，硫酸镁0.05-lg，硫酸锰0.001-0.2g，碳酸钙1-30g，蒸馏水1000mL，调节pH值5.5-7.5。
7.权利要求1-6任一项所述的一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂在饲料中的应用。
8.根据权利要求7所述的一种控制黄曲霉毒素B1的复合生物制剂在饲料中的应用，其特征在于，所述应用为：
预防饲料中黄曲霉毒素B1产生：将复合生物制剂加入到饲料中，混合均匀，其添加量为饲料重量的0.05-0.1％；
或者，
清除霉变饲料中的黄曲霉毒素B1：将复合生物制剂加入到饲料中，混合均匀，其添加量为饲料重量的0.1-0.2％。
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