CN102321552B

CN102321552B - 一株饲用丁酸梭菌及其应用

Info

Publication number: CN102321552B
Application number: CN201110230736.4A
Authority: CN
Inventors: 张东晓; 梁运祥; 赵述淼; 唐泽华; 谢树贵; 雷红升; 付生慧; 游伟; 方莉玉
Original assignee: BEIJING GOLD-TIDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING GOLD-TIDE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2014-04-16
Anticipated expiration: 2031-08-12
Also published as: CN102321552A

Abstract

本发明一株饲用丁酸梭菌及其应用，公开了一株饲用丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845，是革兰氏阳性杆菌，光学显微镜下观察，其大小为(0.6～1.2)μm×(3.0～7.0)μm，端圆，中间部分轻度膨胀，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周生鞭毛，能运动；孢子卵圆，偏心或次端生芽孢；在厌氧琼脂平板上形成白色或奶油色的小规则圆形菌落；在厌氧条件下生长，生长温度范围：20℃～60℃，最适生长温度：30℃～42℃；生长酸碱度范围：pH 2～10，最适pH值为7.0。由该菌株制成的菌剂无毒无害，耐胃液，耐胆盐，对多种有害菌有很强的抑制作用，可广泛应用到禽、畜养殖业，增强动物抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代物。

Description

一株饲用丁酸梭菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物菌株，特别是涉及一株丁酸梭菌菌株及其在制备饲料及饲料添加剂中的应用。

背景技术

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)又称酪酸梭菌或丁酸梭状芽孢杆菌，是存在于人和畜禽肠道的一种厌氧有益菌。丁酸梭菌能形成内生芽孢，具有耐高温、耐胃酸、耐胆盐、耐部分抗生素(如庆大霉素、卡那霉素等)等特性。丁酸梭菌制剂作为饲料添加剂或兽药，与非芽孢类活菌制剂相比具有显著优势。

目前，有关丁酸梭菌的研究和应用还处于初级阶段，专利文献CN 101851596A公开了一株高效解磷的丁酸梭菌及其制备方法和应用；专利文献CN 1246144A公开了一种对肝脏损害具有治疗和预防效果的丁酸梭菌；专利文献CN 1995330A公开了一种丁酸梭状芽孢杆菌微生态制剂的生产方法；专利文献CN 1771831A公开了一种饲料级微生物添加剂及其制备与应用，所述的微生物添加剂主要包括益生菌部分和营养液部分，所述的益生菌部分含有嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、丁酸梭菌，所述的营养液部分含有乙酸、丙酸、丁酸；专利文献CN 1403567A公开了一种制备乳酸芽孢、丁酸芽孢杆菌活菌制剂的新方法，利用酶生物技术处理植物蛋白原料制得培养基，用于乳酸芽孢、丁酸芽孢杆菌单独发酵培养，发酵物经离心、赋形、常温以上温度干燥制得乳酸芽孢、丁酸芽孢杆菌的干粉活菌制剂。上述专利文献中公开的丁酸梭菌微生态制剂均未涉及丁酸梭菌先进行厌氧液态发酵、再用固体物料(麸皮、豆粕、稻壳等)吸附、最后烘干的工艺。

发明内容

本发明的目的是提供一株对致病菌具有抑制作用的可用于制备饲料和饲料添加剂的丁酸梭菌。

本发明所提供的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)菌株的名称为B1，该菌株已于2011年05月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4845。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845是革兰氏阳性杆菌，光学显微镜下观察，其大小为(0.6～1.2)μm×(3.0～7.0)μm，端圆，中间部分轻度膨胀，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周生鞭毛，能运动；孢子卵圆，偏心或次端生芽孢；在厌氧琼脂平板上形成白色或奶油色的小规则圆形菌落；在厌氧条件下生长，生长温度范围：20℃～60℃，最适生长温度：30℃～42℃；生长酸碱度范围：pH 2～10，最适pH值为7.0；部分生化特性如表1所示：

表1丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的部分生化特性

注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。

体外拮抗试验结果表明：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845对大肠杆菌(Escherichia coli O139、E.coli K88、E.coli K99)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium O4Hi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等均有很强的抑制作用。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845可耐受pH 1.0～3.0磷酸盐缓冲液3h；可耐受浓度为0.5％(质量百分比浓度)的胆盐20h。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845对氨苄青霉素、硫酸链霉素、红霉素和氯霉素敏感，对庆大霉素和卡那霉素耐受能力较强。

急性毒性试验结果表明小鼠对丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCCNo.4845的最大耐受剂量MTD＞15000mg/kg，根据分级标准，该菌株为无毒物质。

本发明的第二个目的是提供一种丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCCNo.4845在饲料中应用的微生态制剂。

本发明所提供的微生态制剂，其活性成分为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845。

所述微生态制剂中还可添加有豆粕、麸皮和稻壳中一种或几种。

本发明的另一个目的是提供一种上述微生态制剂的制备方法。

本发明所提供的微生态制剂的制备方法，是将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845培养液与豆粕、麸皮和稻壳中的一种或几种混合后，烘干，粉碎，得到微生态制剂。

具体来讲，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845微生态制剂的制备方法，可包括以下步骤：

1)配制梭菌增殖培养基(RCM培养基)，灭菌后备用；

2)将含菌量为10⁸-10⁹cfu/mL的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCCNo.4845菌液100～500μl接种于装有9mL无菌RCM培养基的试管中，37±1℃下厌氧静置培养24～48h；然后按1％～5％(体积/体积百分比浓度)的接种量，转接到装有350mL无菌RCM培养基的500mL三角瓶中，37±1℃下厌氧静置培养12～36h；再按1％～5％(体积/体积百分比浓度，g/100mL)的接种量，转接到装有无菌RCM培养基的发酵罐中，装液系数70-80％(优选为75％)，37±1℃条件下厌氧静置培养24～48h，得到丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845发酵液；

3)将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845发酵液与豆粕、麸皮和稻壳中的一种或几种按体积质量比1∶0.5～1∶2拌匀后在50-60℃(优选为55℃)下烘干，再经粉碎，得到丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845微生态制剂。

本发明提供了一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845。由该菌株制成的菌剂无毒无害，耐胃液，耐胆盐，对多种有害菌有很强的抑制作用，可广泛应用到禽、畜养殖业(直接添加到动物日粮中即可)，增强动物抗病能力，有望成为饲用抗生素的替代物，应用前景广阔。

生物材料说明：

本发明丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的名称为B1，该菌株已于2011年05月16日保藏于地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.4845。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的分离、鉴定及保藏

一、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的分离

梭菌增殖培养基(RCM培养基)：酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、0.5％美蓝0.2mL、蒸馏水1000mL；使用之前调节pH 7.1±0.1，在培养基上层覆5mm液体石蜡，115℃、20min灭菌备用。

梭菌选择性培养基(TSN培养基)：胰蛋白胨15g、酵母浸粉10g、亚硫酸钠1g、枸橼酸铁0.5g、新生霉素0.02g、多粘菌素0.05g、琼脂0.5g(配固体培养基时用)，pH 7.2，115℃、20min灭菌备用。

分别从湖北省劲牌酒业有限公司刘仁八镇基酒基地酒窖、湖北枝江酒业有限公司酒窖和湖北省白云边酒业有限公司酒窖多点、混合采集窖泥，采样深度均为10cm。取采集样品10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，在三角瓶中放30颗小玻璃珠，振荡20min，80℃水浴10min，杀死非芽孢菌，再静置20s～30s。吸取10mL上清液转接到RCM培养基中，37℃厌氧培养48h。将上述培养液置80℃水浴10min，转接入TSN培养基中，37℃厌氧选择性富集培养48h。梯度稀释(10⁶、10⁷、10⁸倍稀释度)培养液，涂布梭菌选择性培养基平板，置于厌氧培养罐中，37℃培养48h，除去好氧和兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌。选取培养特征、菌落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株，命名为B1，进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析鉴定。

二、B1菌株的生理生化鉴定

对B1菌株进行生理生化鉴定，结果：革兰氏阳性杆菌，光学显微镜下观察，其大小为(0.6～1.2)μm×(3.0～7.0)μm，端圆，中间部分轻度膨胀，单个或成对，短链，偶见有丝状菌体，周生鞭毛，能运动。孢子卵圆，偏心或次端生芽孢。丁酸梭菌在琼脂平板上形成白色或奶油色的小规则圆形菌落；在厌氧条件下生长，生长温度范围：20℃～60℃，最适生长温度：30℃～42℃；生长酸碱度范围：pH 2～10，最适pH值为7.0；部分生化特性如表2所示：

表2 B1菌株的部分生化特性

注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。

三、B1菌株的16S rDNA测序比对

以菌株B1的总DNA为模板，在引物P0(5′-AACGCGAAGAACCTTAC-3′)和PC3(5′-ACGGGCGGTGTGTAC-3′)的引导下PCR扩增该菌株的16S rDNA序列，PCR反应体系为10×Buffer 2.0μL，dNTP(10mmol/L)2.0μL，P0(20μmol/L)1.0μL，PC3(20μmol/L)1.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq酶(5.0U/μL)0.20μL，超纯水补加到总体积20μL。PCR反应条件为：先94℃预变性3min；然后94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环；再72℃延伸10min；最后4℃保温10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了大小约440bp的特异条带。用购自Axygen公司的琼脂糖凝胶试剂盒回收并纯化该目的条带，送上海Invitrogen公司进行序列测定，测序结果表明菌株B1的16S rDNA序列具有序列表中序列1的核苷酸序列。将所测得的序列与Genbank中的16S rDNA序列进行Blastn相似性分析比较，结果菌株B1与Clostridium butyricum的16S rDNA序列的同源性达到了100％。

综合生理生化鉴定和16S rRNA测序结果，可以确定菌株B1为丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，该菌株已于2011年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4845。

实施例2、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845芽孢的耐酸性质分析

菌种活化，按1％(体积/体积百分比)的接种量将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845接种到装有9mL RCM培养基的试管中，37℃厌氧静止培养48h，离心弃上清，洗涤、悬浮菌体。取0.2mL离心洗涤菌悬液分别接种于含有2mL pH 1.0、pH 2.0、pH 3.0的无菌磷酸缓冲液(甲液：磷酸溶液，乙液：磷酸氢二钠溶液；通过调节甲液、乙液比例，将pH分别调为1.0、2.0、3.0)的厌氧试管中，置37℃培养箱中，分别于0h、1h、2h、3h进行活菌计数，计算存活率。

结果经pH值为1的磷酸缓冲液作用1h后，芽孢的成活率为60％，作用3h后，芽孢的成活率为32.7％；而经pH值为2和3的磷酸缓冲液作用3h后，芽孢的成活率均高于90％，表明丁酸梭菌B1可耐受pH 1.0～3.0的酸性环境3h。

实施例3、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的耐胆盐性质分析

菌种活化，按1％(体积/体积百分比)的接种量将丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845接种到装有9mL RCM培养基的试管中，37℃厌氧静止培养48h，离心去上清，洗涤、悬浮菌体。取0.2mL离心洗涤菌悬液接种于含0.1％、0.3％、0.5％(质量百分比浓度)猪胆盐的2mL RCM液体培养基中。置37℃培养箱中，分别于0h、1h、2h、3h、20h进行活菌计数，计算存活率。

检测结果表明，该菌株在0.5％(质量百分比浓度)的胆盐溶液中1h后存活率为76.7％，20h后存活率为24.3％；在0.3％(质量百分比浓度)以下的胆盐溶液中20h后存活率为66.5％，在0.1％(质量百分比浓度)以下的胆盐溶液中几乎不受影响。

实施例4、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的耐抗生素性质分析

菌种活化，按1％(体积/体积百分比)的接种量接种于分别含有以下抗生素的RCM培养基中，抗生素浓度分别为氨苄青霉素(10μg/mL)、硫酸链霉素(10μg/mL)、硫酸链霉素(25μg/mL)、红霉素(15μg/mL)、红霉素(30μg/mL)、氯霉素(10μg/mL)、庆大霉素(10μg/mL)、卡那霉素(15μg/mL)、卡那霉素(30μg/mL)，置于37℃厌氧培养24h，观察丁酸梭菌生长情况，考察其对抗生素的耐受情况。

检测结果表明，丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845对氨苄青霉素、硫酸链霉素、红霉素、氯霉素敏感，对庆大霉素、卡那霉素耐受能力较强。

实施例5、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的急性毒性试验分析

安全性评价采用急性毒性试验，参照GB 15193.3-2003最大耐受剂量法进行。取体重在18～22g的昆明小鼠雌、雄各15只，观察3天后，一日内分三次经口给予0.25g/mL的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845菌液(10⁹CFU/mL)0.4mL(相当于15000mg/kg体重)，连续14天观察小鼠是否有中毒和死亡现象。

结果所有小鼠均未出现中毒和死亡现象，表明本发明菌株的急性毒性试验最大耐受剂量MTD＞15000mg/kg，根据分级标准，该菌株为无毒物质，具有较高的口服安全性。

实施例6、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的体外拮抗试验

一、菌种活化

丁酸梭菌活化：将冻干管保藏的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCCNo.4845菌株接种于装有RCM培养基的PA瓶中，置825-A型厌氧菌培养罐(沈阳市第五人民医院生产)中37℃静止厌氧培养48h，取0.1mL转接9mL RCM培养基试管，厌氧静止培养16h。

致病菌活化：猪大肠杆菌K88、猪大肠杆菌K99、猪大肠杆菌O139、猪肠炎沙门氏菌O4Hi和金黄色葡萄球菌(所有致病菌均来自华中农业大学农业微生物国家重点实验室)冻干管分别转接至LB培养基斜面，37℃下培养48h后，取一环菌接种于装有9mL LB液体培养基的试管中，厌氧静止培养16h。

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂18g(液体培养基不加琼脂)，水975mL，121℃、30min灭菌。

二、活菌计数方法

致病菌采用稀释平板计数法：将待测菌液摇匀，10倍连续稀释，选取适当的稀释度菌悬液0.1mL分别滴加在3个LB培养基平板上，置37℃培养48h后，计算其菌数后取平均值。丁酸梭菌是严格厌氧菌，在有氧情况下无法长出，因此计数结果为致病菌菌数。

三、拮抗致病菌试验

致病菌的单独培养：取10只装有9.9mL LB液体培养基的试管，将活化好的致病菌稀释到10⁴～10⁵CFU/mL，取0.1mL接种到试管中，置37℃静止培养，分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h取出一支混匀测活菌数和pH值。

丁酸梭菌和致病菌混合培养：取10只装有9.8mL GAM液体培养基(牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、pH 7.2～7.4)的试管，将活化好的丁酸梭菌和致病菌菌液均稀释到10⁴～10⁵CFU/mL，各取0.1mL接种到试管中，置厌氧罐37℃恒温静止培养。分别在0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h取出一支混匀测活菌数和pH值，并与单独培养时对照。

体外拮抗试验结果：两种菌混合培养过程中，致病菌的菌数一直显著低于单独培养，到48h时，大肠杆菌（Escherichia coli O139、E.coli K88、E.coli K99）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium O4Hi）的菌数差异达到2个数量级以上，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的差异达到5个数量级以上。表明丁酸梭菌（Clostridium butyricum）B1CGMCC No.4845对大肠杆菌（Escherichia coliO139、E.coli K88、E.coli K99）、伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium O4Hi）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等均有很强的抑制作用。

实施例7、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）B1CGMCC No.4845微生态菌剂的制备

用本发明的方法制备丁酸梭菌（Clostridium butyricum）B1CGMCC No.4845微生态菌剂，具体方法包括以下步骤：

1）配制RCM培养基：酵母浸膏3g、牛肉浸膏10g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉1g、氯化钠5g、三水合乙酸钠3g、半胱氨酸盐酸盐0.5g、0.5％美蓝0.2mL、蒸馏水1000mL；使用之前调节pH7.1±0.1，在培养基上层覆5mm液体石蜡，115℃、20min灭菌备用。

2）取在-20℃下甘油管保藏的含菌量为10⁸－10⁹cfu/mL的丁酸梭菌（Clostridium butyricum）B1CGMCC No.4845菌液，取100～500μl接种于装有9mL灭过菌的RCM培养基的试管中，37±1℃下厌氧静置培养24～48h；然后按1％～5％（体积/体积百分比浓度）的接种量，转接到装有350mL无菌RCM培养基的500mL三角瓶中，37±1℃下厌氧静置培养12～36h；再按1％～5％（体积/体积百分比浓度）的接种量，转接到装有无菌RCM培养基的发酵罐中，装液系数75％（70-80％均可），37±1℃条件下厌氧静置培养24～48h，得到丁酸梭菌（Clostridium butyricum）B1CGMCC No.4845发酵液；该发酵液可冻干形成冻干菌剂在－20℃～30℃条件下保存。

3）将菌液与麸皮（豆粕、麸皮和稻壳中的一种或几种均可，它们作为细菌载体，保护菌体在烘干过程中不失活）按体积质量比1：0.5～1：2拌匀后在55℃（50-60℃均可）下烘干，再经粉碎，得到丁酸梭菌（Clostridium butyricum）B1CGMCC No.4845微生态菌剂。该微生态菌剂可在常温常压下保存6个月，存活率大于50%，不易失活。

实施例8、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845饲喂断奶仔猪效果分析

用实施例7制备的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845微生态菌剂进行饲喂断奶仔猪效果分析，方法为：选择21日龄体重相近的断奶仔猪40头，经检验各处理间体重差异不显著(±0.20kg)(P＞0.05)。将仔猪随机编号分为4组，每组10头(公母随机)。4个组分别为：

空白对照组：基础日粮；

抗生素组(阳性对照)：基础日粮+抗生素(新霉素120mg/kg、喹烯酮75mg/kg)；

低剂量组：基础日粮+低剂量丁酸梭菌微生态菌剂(剂量2×10⁷cfu/kg)；

中剂量组：基础日粮+中剂量丁酸梭菌微生态菌剂(剂量10⁸cfu/kg)；

高剂量组：基础日粮+高剂量丁酸梭菌微生态菌剂(剂量5×10⁸cfu/kg)。

封闭式猪舍饲养，温度控制在20℃。试验猪自由采食、饮水。按养猪场常规程序进行免疫接种。试验期为30d。

结果如表3所示，与抗生素阳性对照组相比，用本发明菌株制成的微生态菌剂能够提高饲料利用率，促进断奶仔猪的生长(料肉比降低1.8％)，降低断奶仔猪腹泻率(腹泻率降低33.5％)，可起到取代抗生素的作用。

表3断奶仔猪饲喂丁酸梭菌(Clostridium butyricum)B1 CGMCC No.4845的效果

Claims

1.一种制备丁酸梭菌（Clos tridiumbutyricum）B1CGMCC No.4845微生态菌剂的方法，包括以下步骤：

1）配制梭菌增殖培养基即RCM培养基，灭菌后备用；

2）按体积百分比浓度1％～5％的接种量，将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）B1CGMCC No.4845菌液转接到装有无菌RCM培养基的发酵罐中，装液系数70-80％，37±1℃条件下厌氧静置培养24～48h，得到丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）B1CGMCC No.4845发酵液；

3）将丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）B1CGMCC No.4845发酵液与豆粕、麸皮和稻壳中的一种或几种按体积质量比1：0.5～2拌匀后在50-60℃下烘干，再经粉碎，得到丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）B1CGMCC No.4845微生态制剂。