CN106011036B - 一株具有益生作用的凝结芽孢杆菌hew-b379及其应用 - Google Patents

一株具有益生作用的凝结芽孢杆菌hew-b379及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株具有益生作用的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，该菌株命名为HEW‑B379，保藏编号为CGMCC No.12553。本发明的凝结芽孢杆菌HEW‑B379具有显著的益生性，可有效抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌的生长繁殖。本发明凝结芽孢杆菌HEW‑B379具有较强的抗逆性，可以耐高温、耐模拟胃液、模拟胆盐环境，且能保持99％‑100％的存活率，该菌可有效调节动物肠道微生物平衡，抑制有害微生物生长，促进动物对营养的吸收，提高饲料转化率，提高动物生产性能。

Description

一株具有益生作用的凝结芽孢杆菌HEW-B379及其应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一种具有益生作用的凝结芽孢杆菌HEW-B379及其应用。
背景技术
随着人们对畜产品安全和环境保护意识的不断加强，作为抗生素的替代品，益生菌越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。
由于芽孢杆菌对干燥、高温、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，这种稳定性增加了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽孢杆菌的研究具有重大意义。分离和筛选抗病原菌且具有益生效果的凝结芽孢杆菌，可以更好的应用于饲料添加剂，以代替抗生素。但凝结芽孢杆菌作为益生菌制剂或饲料添加剂的研究与应用较少，尤其是在替代饲养抗生素和促进动物对营养的吸收，提高动物生产性能等方面。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有益生作用的凝结芽孢杆菌HEW-B379及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的凝结芽孢杆菌HEW-B379(Bacillus coagulans)是从健康猪肠道内容物中分离的芽孢杆菌菌株，通过菌落形态观察、发酵性能检测、抑菌性能检测、16S rDNA基因序列分析和体外益生效果评价得到，该菌株抗逆性强，耐酸碱及耐高温强、益生性更加显著。其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。该菌株已于2016年5月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏编号为CGMCC No.12553。
本发明提供的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HEW-B379具有以下微生物学特征：凝结芽孢杆菌HEW-B379是革兰氏阳性杆菌，在MRS培养基上生长良好，白色菌落、圆形、有光泽、边缘整齐，菌落直径为2～3mm，菌落形态如图1，显微镜下菌体呈直杆状，芽孢短生，兼性厌氧生长，经革兰氏染色后菌株形态如图2；凝结芽孢杆菌HEW-B379生长适宜温度范围：4℃-65℃，最适生长温度：20℃-45℃；生长适宜pH1.5-10，最适pH值为6-8。部分生理生化特性如表1。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379的菌剂。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379的饲料添加剂。
饲料添加剂中凝结芽孢杆菌HEW-B379的活菌数为1.0×106～1.0×1010CFU/g。优选地，饲料添加剂中凝结芽孢杆菌HEW-B379的活菌数为1×107CFU/g。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379的动物饲料。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379的药物，所述药物为预防或治疗动物腹泻的药物。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379或含有其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379或含有其的菌剂在制备微生态益生制剂中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379或含有其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379或含有其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌。
本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.12553的凝结芽孢杆菌HEW-B379或含有其的菌剂在食品制造中的应用。优选地，所述的食品为动物用食品。
本发明中所述凝结芽孢杆菌HEW-B379的培养方法如下：
取凝结芽孢杆菌HEW-B379种子液1-5mL(种子液是挑取的单个菌落在种子液培养基中培养的，其活菌浓度以109CFU/mL计；种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培养条件相同)，接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养。
所述培养基由如下组分组成：可溶性淀粉0.5-5％，蔗糖0.5-5％，酵母浸粉0.5-3％，蛋白胨0.1-1.0％，磷酸氢二钾0.05-0.5％，硫酸镁0.05-0.5％，氯化钠0.1-2.0％，碳酸钙0.1-1.0％，余量为水，pH6.8±0.2；其中，优选为：可溶性淀粉1.2％，蔗糖1.8％，酵母浸粉1.0％，蛋白胨1.5％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.2％，氯化钠0.5％，碳酸钙0.2％，余量为水，pH6.8±0.2。
所述摇瓶发酵的条件为：发酵温度25-45℃，发酵时间8-24h，pH值6.0-8.0，转速为100-300r/m；优选为：发酵温度为40℃、pH值6.8、搅拌转速200r/m，发酵时间10h。
50L种子罐罐培养基与摇瓶发酵培养基相同。50L发酵罐发酵条件为：装液量为20-40L培养基，接种量为500-1000mL摇瓶种子液，发酵温度为25-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.0-8.0，搅拌转速100-300r/min。其中，优选为：装液量为35L培养基，接种量为600mL，发酵温度为40℃，发酵时间10h，pH值6.8，搅拌转速150r/min。
500L发酵罐中试培养基及发酵条件为：1-25％麸皮浸出液、1-5％淀粉、1-5％豆粕、1-5％玉米浆干粉、0.05-0.1％磷酸氢二钾、0.05-0.5％硫酸镁、0.1-2.0％氯化钠、0.01-0.05％硫酸锰、0.1-1.0％碳酸钙，余量为水，pH6.0-8.0，控制罐压0.02-0.05MpB，装液量250-300L、接种量25-35L，发酵温度为25-45℃，发酵时间5-20h，pH值6.0-8.0，搅拌转速100-300r/min，其中，优选为：装液量为300L培养基，接种量为35mL，发酵温度为40℃，发酵时间15h，pH值6.8，搅拌转速150r/min。
5T发酵罐培养基与500L发酵罐中试培养基相同，其发酵条件为：控制罐压0.02-0.05MpB，装液量2.5T-3.5T、接种量250-350L，发酵温度为25-45℃，发酵时间20-36h，pH值6.0-8.0，搅拌转速100-300r/min，其中，优选为：装液量为3T培养基，接种量为300mL，发酵温度为40℃，发酵时间30h，pH值6.8，搅拌转速150r/min。
本发明凝结芽孢杆菌HEW-B379的益生性的检验方法如下：
在无菌操作台上，将病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液10mL与90mL与冷却至50℃的营养琼脂(灭菌后)混匀，制备成厚度4mm左右的病原菌平板，将灭菌的牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑)放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加200μL的本发明制备的发酵液，勿使其外溢，25℃-45℃培养20-36h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值。
其中，所述病原菌平板是将121℃高温灭菌后的营养琼脂与病原菌菌悬液混匀后，倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的病原菌营养琼脂平板。
本发明凝结芽孢杆菌HEW-B379抗逆性的检验方法如下：
1、高温耐受试验：取10mL本发明制备得到的发酵液注入到试管1中，采用十倍逐级稀释，根据对发酵液活菌的估计，选择适当稀释倍数的稀释液进行涂布。再将装有10mL本发明制备得到的发酵液的试管2置于90℃水浴锅中加热15min，取加热后的凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液进行十倍逐级稀释，选择适当稀释倍数的稀释液进行涂布。最后将加热前和加热后的平板均在40℃条件下培养24h，计算凝结芽孢杆菌HEW-B379加热前后的数量。
2、模拟胃液及肠液的耐受试验：取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取1mL凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于40℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即检测残存活菌数，与原活菌数进行比较。
3、模拟胆盐的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将1mL凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液接种到9mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，检测残存凝结芽孢杆菌HEW-B379的活菌数，与原活菌数进行比较。
模拟胃液及肠液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法：
样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。涂布时用移液枪准确吸取0.1mL稀释液于营养琼脂平板中间位置，用无菌涂布器涂布均匀。40℃倒置培养24h。
本发明凝结芽孢杆菌HEW-B379预防和治疗腹泻的检验方法：
选取普通昆明小白鼠90只，雌性，18-20g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂1周，使小鼠尽快适应。开始正式试验，对照组每日无菌生理盐水200μL，试验Ⅰ组灌胃凝结芽孢杆菌发酵液200μL，试验Ⅱ组灌胃大肠杆菌发酵液200μL，每天早晨9：00灌胃，连续两周，试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食和饮水。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，试验前后分别称重1次。试验期间观察小鼠生长、腹泻和排便情况；每5天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，取小鼠粪便约1g，于无菌操作台内加入玻璃珠，震荡混匀，稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计算每克湿便中的大肠杆菌数。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明的凝结芽孢杆菌HEW-B379耐热性强(生长温度：4℃-65℃，最适生长温度：20℃-45℃)；耐酸碱范围宽泛(生长适宜pH1.5-10，最适pH值为6-8)；发酵力强、生长旺盛；经发酵培养基和工艺优化，发酵液活菌数可达到6.1×1010CFU/mL，更加适合饲料工业和畜禽养殖业发展，在畜牧养殖可大大降低生产成本、提高经济效益，为以后发展奠定了坚实的菌种基础。
(2)本发明的凝结芽孢杆菌HEW-B379具有显著的益生性，能显著抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。
(3)本发明的凝结芽孢杆菌HEW-B379具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟胆盐以及高温环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到99-100％，更加适合饲料工业和畜牧养殖业的要求。
(4)本发明中凝结芽孢杆菌HEW-B379可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性能，提高动物生产性能。经小鼠腹泻试验，HEW-B379试验组小鼠体重平均增长率显著高于对照组和大肠杆菌组(P<0.05)，且未出现腹泻情况；大肠杆菌组试验小鼠灌胃凝结芽孢杆菌发酵液后，小鼠精神状态好转，且腹泻情况减少。表明饲喂HEW-B379可有效预防和治疗小鼠腹泻，并能够促进小鼠生长。
(5)本发明的凝结芽孢杆菌HEW-B379不但可促进动物对饲料消化吸收，节约成本，同时改善了动物体内环境的微生态平衡，从而促进动物生长，显著提高了动物的生产性能等，降低了生产成本。具体表现在：107CFU/mL凝结芽孢杆菌可显著提高仔猪平均日增重13.85％(P<0.05)，腹泻率和死亡率分别降低了53.23％、5.8％。凝结芽孢杆菌既有与普通乳酸菌十分相似的特征，又因属于芽孢杆菌而可以体现芽孢杆菌抗逆性强、耐酸耐碱、耐高温和易于储藏等优良特性，可以抵抗胃酸和生物酶作用，顺利在肠道萌发并发挥其对肠道的有利作用。
附图说明
图1是凝结芽孢杆菌HEW-B379在营养琼脂培养基上的菌落形态。
图2是凝结芽孢杆菌HEW-B379经革兰氏染色显微镜下的菌株形态。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1凝结芽孢杆菌HEW-B379的分离和鉴定
1、芽孢杆菌的分离纯化：在无菌条件下采集健康猪肠道内容物1g，置于盛有4.5mL灭菌生理盐水的离心管中，充分震荡混匀，于85℃水浴锅中水浴15min，然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL灭菌生理盐水的离心管中，此稀释度为10-2，重复以上过程做10倍梯度稀释，至10-6稀释浓度，选择10-4～10-6三个稀释度，吸取0.1mL涂布于营养琼脂平板上，平板涂布后40℃倒置培养24h，用接种环挑取疑似芽孢杆菌的菌落在营养琼脂平板上进行划线分离培养，经24h培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于营养琼脂斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4℃冰箱保存备用。
2、菌落形态的观察将步骤1保存的斜面菌种，经2-3次活化，取干净的载玻片进行革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的产芽孢杆菌作为备用。
3、抑菌性芽孢杆菌的筛选：取致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、志贺氏菌属、韦荣氏球菌、绿脓杆菌、嗜水气单胞菌、多杀性巴氏杆菌)浓度为109CFU/mL的菌悬液0.1mL均匀涂布在营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个，在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌镊子夹取2个灭菌牛津杯对称放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取200μL疑似芽孢杆菌菌株发酵液于牛津杯中，另一个牛津杯中加入等量的YPD培养基作为对照，于40℃下恒温培养48h。每个菌株至少做3个重复，观察并测量抑菌圈大小，选择抑菌圈大的菌株8株，并分别标号为HEW-B10-1、HEW-B10-2、HEW-B10-3、HEW-B10-4、HEW-B10-5、HEW-B10-6、HEW-B10-7、HEW-B10-8。用接种环转接于MRS斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4℃冰箱保存备用，进行下一步的研究。
4、产细菌素芽孢杆菌的筛选
1)目标菌株的确定：
将步骤3中筛选获得的8个芽孢杆菌于YPD斜面培养基上进行菌种活化3-4次，取1-2环转接于装有300mL YPD液体培养基的摇瓶中40℃培养18h，转速为180r/m，调节pH值至7.0，然后分别吸取200μL芽孢杆菌发酵液，进行抑菌试验，选择抑菌性能最好的芽孢杆菌HEW-B10-2为本发明筛选的目标芽孢杆菌，其在营养琼脂培养基上的菌落形态见图1，其经革兰氏染色显微镜下的菌株形态见图2，将该菌暂时命名为芽孢杆菌HEW-B379。
2)抑菌蛋白的确认：
将步骤1)HEW-B10-2培养液中加入硫酸铵至到培养液中不再有沉淀析出，收集沉淀和上清液，将沉淀透析、去盐后溶于与上清液等体积的超纯水，均匀混合，得溶解液，取适量溶解液加入0.1mg/mL的蛋白酶37℃酶解2h。取培养液、上清液、溶解液、酶解液做抑菌试验。最终确定芽孢杆菌HEW-B379发酵产生的抑菌物质为抑菌蛋白。
5、菌株属的鉴定对HEW-B379菌株进行生理生化鉴定，氧化酶、接触酶、明胶液化试验、吲哚试验和淀粉水解均为阳性，表明HEW-B379菌株为芽孢杆菌属。通过厌氧生长试验、65℃生长试验及糖醇发酵试验，结果与《常见细菌系统鉴定手册》对照。鉴定结果显示HEW-B379菌株为凝结芽孢杆菌。
表1凝结芽孢杆菌HEW-B379部分生理生化特性
注：“+”表示反应阳性；“-”表示反应阴性。
6、16S rDNA测序测定采用细菌DNA提取的试剂盒提取HEW-B379菌株基因组DNA。通过引物F和R对HEW-B379菌株的16S rDNA基因片段进行测序，将所测得的序列与GenBank中的16S rDNA序列进行BLAST分析比对，可以看出菌株HEW-B379与凝结芽孢杆菌的同源性达到99.98％。通过菌株HEW-B379的形态特征、生理生化特征、16SrDNA特征，确定菌株HEW-B379为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
7.菌株保藏上述经分离、纯化、筛选得到的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)HEW-B379已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏编号为CGMCC NO.12553，分类命名为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)。
实施例2凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液的制备
取凝结芽孢杆菌HEW-B379(保藏编号为CGMCC No.12553)种子液(活菌浓度为109CFU/mL)3mL，接种于300mL培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵温度为40℃、pH6.8、200r/min，发酵时间10h。
其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成：可溶性淀粉1.2％，蔗糖1.8％，酵母浸粉1.0％，蛋白胨1.5％，磷酸氢二钾0.08％，硫酸镁0.2％，氯化钠0.5％，碳酸钙0.2％，余量为水，pH6.8±0.2。
摇瓶发酵结束后进行发酵罐一级种子培养，取0.6L摇瓶发酵种子液接种到50L发酵罐中装液量为35L培养基，接种量为600mL，发酵温度为40℃，发酵时间10h，pH值6.8，搅拌转速150r/min。50L发酵罐培养基组成同摇瓶发酵。
将50L发酵的一级种子液35L接种于500L二级种子罐中，500L发酵罐的培养基成分及发酵条件为：1-25％麸皮浸出液、1-5％淀粉、1-5％豆粕、1-5％玉米浆干粉、0.05-0.1％磷酸氢二钾，0.05-0.5％硫酸镁，0.1-2.0％氯化钠，0.01-0.05％硫酸锰0.1-1.0％碳酸钙，余量为水，pH6.0-8.0，装液量为300L培养基，接种量为35mL，发酵温度为40℃，发酵时间15h，pH值6.8，搅拌转速150r/min。
5T发酵罐培养基与500L发酵罐二级种子培养基相同，其发酵条件为：控制罐压0.02-0.05MpB，装液量为3T培养基，接种量为300mL，发酵温度为40℃，发酵时间30h，pH值6.8，搅拌转速150r/min。
发酵结束后，检测发酵液活菌数为6.1×1010CFU/mL，发酵液于4℃保存在冰箱内备用。
实施例3凝结芽孢杆菌HEW-B379益生性验证
在无菌操作台上，将病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌)浓度为109CFU/mL的实施例2制得的凝结芽孢杆菌HEW-B379菌悬液0.1mL均匀涂布在营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个，在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌镊子夹取2个灭菌牛津杯对称放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加200μL的本发明制备的发酵液，勿使其外溢，25℃-45℃培养20-36h，然后测量抑菌圈直径。每个实验三个重复，取平均值。结果如表2。
表2凝结芽孢杆菌HEW-B379对病原菌的抑菌效果
实施例4凝结芽孢杆菌HEW-B379抗逆性验证
1、耐高温试验：取本发明实施例2制备得到的凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液10mL于试管1中，置于90℃水浴锅中处理15min，计算凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液加热前后的数量。
结果表明，活菌存活率达到了100％。
2、模拟胃液及肠液的耐受试验：取100g/L的盐酸16.4mL加蒸馏水稀释，使pH值分别为1.5、2.5和3.5，取100mL稀盐酸溶液，分别加入1g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1moL/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰蛋白酶10g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μm)备用。取1mL凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液加入到9mL的模拟胃液中(即十倍逐级稀释)，并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于40℃静置培养2-4h。分别在1h、2h、3h、4h的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行比较，结果表明活菌存活率为99％。
3、模拟胆盐的耐受试验：用胰液素制成1g/L的溶液，并在溶液中加入0.3％的猪胆盐，用10％的NaOH调整pH为8.0，然后用0.45μm微滤膜过滤并除菌。将1mL凝结芽孢杆菌HEW-B379发酵液接种到9mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计算残存凝结芽孢杆菌HEW-B379的活菌数，与原活菌数进行比较。结果表明活菌存活率为99％。
模拟胃液及肠液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法：
样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。涂布时用移液枪准确吸取0.1mL稀释液于营养琼脂平板中间位置，用无菌涂布器涂布均匀。40℃倒置培养24h。
实施例5凝结芽孢杆菌CGMCC NO.12553急性毒性试验
凝结芽孢杆菌的安全性评价采用急性毒性试验，参照国标GB15193.3-2003最大耐受剂量法进行。取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规饲养1周后，一日分三次对小白鼠进行灌胃，0.25g/mL凝结芽孢杆菌HEW-B379菌液(相当于15000mg/kg体重)，连续灌服2周，观察小鼠是否有中毒或死亡的现象。
试验期间，小鼠均无中毒和死亡现象，因此本发明菌株的急性毒性试验最大耐受剂量MTD＞15000mg/kg，根据分级标准，可确定该菌种为无毒级，具有较高的安全性。
实施例6小鼠腹泻试验
选取普通昆明小白鼠90只，雌性，18-20g，常规饲养。随机分为三组，每个处理饲喂基础日粮，饲喂1周，使小鼠尽快适应。开始正式试验，对照组每日无菌生理盐水200μL，试验Ⅰ组灌胃实施例2制得的凝结芽孢杆菌发酵液200μL，试验Ⅱ组灌胃大肠杆菌发酵液200μL，每天早晨9：00灌胃，连续两周，试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食和饮水。环境温度控制在25±2℃，湿度60％，试验前后分别称重1次。试验期间观察小鼠生长、腹泻和排便情况，计算各组体重平均增长率，结果如表3；每5天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，取小鼠粪便约1g，于无菌操作台内加入玻璃珠，震荡混匀，稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计算每克湿便中的大肠杆菌数，结果如表4。
表3小鼠增重情况
表4小鼠粪便中大肠杆菌数的情况
试验期间，试验Ⅰ组小鼠精神较好，表现活跃，皮毛鲜亮，且平均增重显著高于对照组，粪便中大肠杆菌数显著降低，基本没有腹泻情况；试验Ⅱ组小鼠精神萎靡，不活跃，皮毛颜色发暗，粪便较湿，且粪便中大肠杆菌数显著增多，出现严重腹泻情况。将试验Ⅱ组小鼠随机分为两组，一组进行灌胃凝结芽孢杆菌发酵液200μL。另一组进行灌胃无菌生理盐水200μL作为对照组，灌胃1周，观察小鼠生长和粪便状况。发现灌胃凝结芽孢杆菌发酵液组的小鼠精神状态转好，且小鼠开始活跃，皮毛色泽转好，而对照组小鼠状态仍萎靡不振，食欲不振，减少腹泻情况。结果说明，本发明的凝结芽孢杆菌发酵液能够抑制小时腹泻，并促进小鼠生长。
实施例7哺乳仔猪试验
选24头分娩母猪，随机分为四组，并以分娩母猪所产仔猪为试验对象。分为1个对照组和三个试验组(试验组1总活菌数为107cfu/mL凝结芽孢杆菌HEW-B379、试验组2总活菌数为108cfu/mL凝结芽孢杆菌HEW-B379、试验组3总活菌数为109cfu/mL凝结芽孢杆菌HEW-B379)。试验组凝结芽孢杆菌制剂溶解于无菌水中，用于试验。试验组仔猪在吃初乳前分别灌服2mL凝结芽孢杆菌水溶液，对照组仔猪则灌服2mL生理盐水。以后在7d和14d时再次以同样剂量灌服。仔猪出生时称初重，28d断奶时再次称重，记录数据进行分析，期间观察仔猪腹泻及死亡情况。
表5凝结芽孢杆菌制剂对哺乳仔猪体重的影响
注：同列数字肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同的表示差异显著(P<0.05)，大写字母不同的表示差异极显著(P<0.01)。
由表5可见，试验组1～3平均增重均高于对照组，分别比对照组提高了13.85％、20.77％、20.45％。。试验组1～3的增重分别与对照组相比差异极显著(P<0.01)，试验组1～3之间增重差异不显著(P>0.05)。试验数据显示，凝结芽孢杆菌可有效提高哺乳期仔猪的体重。
表6凝结芽孢杆菌制剂对哺乳仔猪腹泻及死亡率的影响
由表6可见，哺乳期仔猪腹泻主要出现在一周左右。试验组1～3的腹泻率分别比对照组降低了53.23％、54.79％和55.04％。复合益生菌对于仔猪死亡率的影响，试验组1和试验组3分别死亡1头，试验组2未出现死亡的情况，对照组死亡4头。实验组1～3死亡率分别比对照组降低5.8％、7.55％和5.83％。实验结果显示，凝结芽孢杆菌可有效降低哺乳期仔猪的腹泻率和死亡率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）HEW-B379，其保藏编号为CGMCCNo.12553。
2.含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌HEW-B379的菌剂。
3.含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌HEW-B379的饲料添加剂。
4.如权利要求3所述的饲料添加剂，其特征在于，饲料添加剂中凝结芽孢杆菌HEW-B379的活菌数为1.0×106 ~1.0×1010CFU/g。
5.含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌HEW-B379的药物，所述药物为预防或治疗动物腹泻的药物。
6.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HEW-B379或权利要求2所述的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
7.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HEW-B379或权利要求2所述的菌剂在制备微生态益生制剂中的应用。
8.权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HEW-B379或权利要求2所述的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌。
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