CN102391962A - 一种屎肠球菌制剂及其生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种屎肠球菌制剂及其生产工艺。本发明提供的制剂，其活性成分为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No.5058。本发明的实验证明，本发明通过分离、鉴定、筛选，得到屎肠球菌康80，其抗逆性强、抗杂菌能力强、具有益生特性，本发明将其进行乳化制备得到屎肠球菌制剂，可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等各种动物。

Description

一种屎肠球菌制剂及其生产工艺
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种屎肠球菌制剂及其生产工艺。
背景技术
饲料中添加抗生素对集约化畜牧业发展做出重大贡献的同时，其产生的副作用如内源性感染和二重感染、耐药性的产生、肠道正常菌群的破坏和畜产品及环境中的残留等对养殖业、动物以及人类食品安全带来严重威胁。益生素就是以活的微生物为主，动物摄入一定量后，在胃肠道特定部位有一定数量的菌株能够粘附、定植和生长，主要通过调节肠道微生物菌群结构和平衡，对动物生长和健康起到有益作用的制剂，是一种良好的的替代抗生素的新型绿色安全添加剂。
屎肠球菌(Enterococcus Faecium)广泛存在于自然界和畜禽胃肠道内，是一种有益微生物，普通的屎肠球菌因其耐酸、耐高温等特性较差，未能在饲料添加剂中广泛应用。因此，根据目前畜牧业的需求，筛选一株耐酸耐高温具有益生特性的屎肠球菌具有广阔的发展前景。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种屎肠球菌制剂。
本发明提供的制剂，其活性成分为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述制剂的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)发酵屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No.5058，离心收集沉淀，得到菌泥；
2)将步骤1)得到的菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、无菌水混匀乳化，即得到屎肠球菌制剂。
在上述方法中，步骤1)中，所述发酵的温度为所述发酵的温度为15℃-45℃，所述发酵的时间为10小时-18小时，所述发酵所需的pH值为4.5-8.6，所述发酵的压力为0.01Mpa-0.03Mpa；
上述发酵的温度具体为15℃、37℃或45℃，所述发酵的时间为10小时、12小时或18小时，所述发酵所需的pH值具体为6.4-6.6；
上述发酵的搅拌速度为80rpm/min-120rpm/min，具体可为80rpm/min、100rpm/min或120rpm/min；
在上述方法中，步骤2)中，所述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比为3×1011cfu-8×1011cfu∶0.5g-2.5g∶0.1g-1g∶0.1g-1g∶10g；
上述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比具体为3×1011cfu、5×1011cfu或8×1011cfu∶0.5g、1g或2.5g∶0.1g、0.5g或1g∶0.1g、0.3g或1g∶10g。
在上述方法中，步骤1)中，所述发酵采用的培养基按照如下方法制备：将蔗糖、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4·3H2O、MnSO4、MgSO4·7H2O和水混匀，得到培养基，所述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度为35g/L-45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度为5g/L-15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度为1g/L-5g/L，所述KH2PO4·3H2O在所述发酵培养基中的浓度为0.5g/L-1.5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度为0.01g/L-0.03g/L，所述MgSO4·7H2O在所述发酵培养基中的浓度为0.1g/L-0.6g/L。
在本发明的实施例中，上述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度具体为35g/L、40g/L或45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度具体为5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度具体为15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度具体为1g/L、4g/L或5g/L，所述KH2PO4·3H2O在所述发酵培养基中的浓度具体为0.5g/L、1g/L或1.5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度具体为0.01g/L、0.02g/L或0.03g/L，所述MgSO4·7H2O在所述发酵培养基中的浓度具体为0.1g/L、0.4g/L或0.6g/L；
上述方法中，所述离心力为1800g-2200g，所述离心力具体为1800g、2000g或2200g；所述离心的时间为5min-10min，所述离心的时间具体为5min、8min或10min；
在上述方法中，步骤2)中，所述乳化的温度为25℃-28℃，所述乳化的时间为25min-45min；
在上述方法中，所述乳化的温度具体为25℃、27℃或28℃，所述乳化的时间为25min、30min或45min。
在上述方法中，在所述步骤2)后，在所述乳化后还包括将乳化产物干燥得到屎肠球菌制剂的步骤，其中干燥采用低温真空干燥箱在低温温度27-50℃，真空度-0.096Mpa条件下进行。
由上述的方法制备的屎肠球菌制剂也是本发明保护的范围。
上述的屎肠球菌制剂在作为动物饲料添加物中的应用也是本发明保护的范围。
上述的屎肠球菌制剂在制备动物饲料中的应用也是本发明保护的范围。
上述的屎肠球菌制剂在促进动物生长中的应用也是本发明保护的范围。
在上述应用中，所述促进动物生长为如下1)或2)：
1)提高猪平均日增重、提高猪平均日采食量、提高猪皮毛指数、降低猪料肉比和/或降低猪腹泻率；
2)提高鸡平均日增重和/或提高平均日采食量；
在上述应用中，所述动物为猪或鸡。
本发明的实验证明，本发明通过分离、鉴定、筛选，得到屎肠球菌康80，其抗逆性强、抗杂菌能力强、具有益生特性，本发明将其进行乳化制备得到屎肠球菌制剂，可以作为添加剂用于制备动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、牛、羊、鸡等各种动物。该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。本发明的屎肠球菌主要作为动物饲料的添加剂，可替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、降低腹泻、促进动物生长和提高饲料转化率、提高断奶仔猪以及生长育肥猪的生产性能。
本发明的屎肠球菌对防治动物消化系统疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时，本发明的屎肠球菌无耐药性和药物在动物产品中残留，不会对人类的健康产生潜在的危害，是一种有前途的绿色饲料添加剂。
上述提到的菌株康80于2011年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5058，其分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)。
附图说明
图1为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80的生长曲线
图2为饲料样品中乳酸菌16S rRNA基因序列系统发育树
图3为屎肠球菌发酵生产流程图
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基如无特殊说明配方如下：
1、MRS肉汤培养基
蛋白胨10g，牛肉粉5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，柠檬酸三氨2g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，酵母粉4g，用蒸馏水定容至1L。
2、MRS琼脂培养基
1L MRS肉汤培养基中加琼脂15g。
3、麦康凯培养基
月示胨3g，猪胆盐5g，中性红0.025g，蛋白胨17g，乳糖10g，结晶紫0.001g，氯化钠5g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L。
4、M17培养基
大豆蛋白胨5.0g，酵母提取物5.0g，酪蛋白胨5g，抗坏血酸0.5g，牛肉浸膏2.5g，β-甘油磷酸二钠19g，MgSO4·7H2O 0.25g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L。
实施例1、屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80的分离及鉴定
本发明的屎肠球菌是从饲料样品中提取、分离、筛选、纯化得到的。
(一)屎肠球菌康80(NFER-5)的分离与纯化
1.1 菌株的分离培养
取1g健康断奶仔猪粪便于装有9mL无菌生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1∶10稀释液，再取稀释液进行十倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1mL涂布于含有10ppm放线菌酮的MRS琼脂培养基及M17琼脂培养基，37℃厌氧培养48～72h，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的特征单菌落于MRS液体培养基中，进行划线分离纯化。观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的放置4℃冰箱贮藏备用。
1.2 革兰氏染色
用无菌注射器吸取少量MRS肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘干固定。滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液媒染，作用1min，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮∶95％乙醇＝3∶7)脱色30s，水洗；滴加沙黄染色液复染1min，水洗，待干，在普通光学显微镜上观察，菌体呈红色为阴性，紫色的为阳性。呈革兰氏阳性形态一致的杆菌，进一步进行接触酶试验。
1.3 接触酶试验
做MRS斜面培养基，取培养物约0.2mL注入装有MRS琼脂培养基斜面，5％CO2培养箱，37℃培养24h，长出菌落后，将3％过氧化氢溶液滴加到菌落上，若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。通过MRS培养基厌氧培养的培养物经革兰氏染色阳性和接触酶试验阴性可初步认为是乳酸菌属(Lactobacillus)。
3份饲料样品经分离纯化，结合革兰氏染色和接触酶试验，共分离出5株乳酸菌，其中杆菌3株，球菌2株，并分别命名为NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5。
(二)、抗逆性选育与生物学特性研究
1.1 耐热性能选育
将上述筛选的5株待测菌株NFER-1、NFER-2、NFER-3、NFER-4、NFER-5按2％(v/v)的接种量接种到MRS液体培养基中，分别于60℃、70℃、80℃水浴锅内处理10min后测定其活菌数，37℃恒温培养24h后观察结果，比较其在各温度下处理前与处理后的活菌数。
存活率的计算公式为：
S热＝n1/n0；
S热为分别经过60℃、70℃、80℃处理后的屎肠球菌存活率；n0为加热处理前每毫升活菌数；n1为加热处理10min后每毫升活菌数。
结果如表1所示，从表1中可以看出，NFER-2，NFER-4，NFER-5在70℃热处理10min后还有一定活菌数，且NFER-5浓度高达1.72×105，且NFER-5在80℃处理10min后仍有较高活菌数，浓度为1.00×104。而NFER-1，NFER-3在70℃处理10min之后无活菌，证明该两株菌株不耐热。一般仔猪饲料的制粒温度为70℃～85℃之间，耐高温之后存活率低也是乳酸菌作为饲料添加剂的主要限制性因素之一。从耐热存活率看，本试验选育的发酵乳酸杆菌可以耐受制粒时的高温，作为饲料添加剂将会有较好的前途。选取NFER-2，NFER-4，NFER-5进行下一步筛选。
表1 耐热试验结果
Figure BDA0000105254130000051
1.2 耐酸性能选育
将上述试验中耐热性较好的菌株NFER-2，NFER-4，NFER-5按2％(v/v)的接种量接种到pH值为3.0的MRS液体培养基中，分别在0h、1h、2h、3h采用平板倾注法测定其活菌数，37℃恒温培养24h观察结果，记录其活菌数，计算各菌株的存活率。
存活率的计算公式为：
S酸＝nx/n0
S酸为经过pH3.0处理后不同时间的屎肠球菌存活率；n0为pH3.0处理前每毫升活菌数；nx为pH3.0处理0h、1h、2h、3h后每毫升活菌数。
通过pH3.0处理后的各菌株存活率见表2。从表中可以看出只有NFER-5表现出较强的耐受性，3h处理后存活率仍达到80％，这个存活率对于其耐过胃酸的抑制作用或杀灭作用应是较为理想的，但NFER-2和NFER-4此条件下受到强烈的抑制。于是选取NFER-5进行下一步试验。
表2 不同时间耐酸试验结果
Figure BDA0000105254130000061
1.3 耐胆盐选育
将活化好的菌株用无菌生理盐水做倍比稀释，选取合适的稀释梯度并吸取1mL稀释液放于灭菌过的平皿内，做重复，然后用含0.30％及1.0％牛胆酸钠的MRS固体培养基倾注平板，37℃培养48h，进行菌落计数，作为试验组；同时用不含牛胆酸钠的MRS固体培养基倾注平板，37℃培养48h，菌落计数，作为对照组。计算菌株的存活率。
存活率的计算公式为：
S酸＝nx/n0
S酸为经过0.30％及1.0％牛胆酸钠处理的屎肠球菌存活率；n0为用不含牛胆酸钠的MRS固体培养基处理的每毫升活菌数；nx为用含0.30％及1.0％牛胆酸钠处理后每毫升活菌数。
不同胆盐浓度处理后的存活率结果见表3。由表可知，NFER-5在胆盐浓度为0.3％的条件下有极高的耐受性，而对1.0％的胆盐也有一定的耐受性，存活率达到了47.39％。研究表明，胆盐是肠乳酸菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer研究发现用胆盐选择性驯化乳酸菌对胆盐的耐受力是有效的，经过几代胆盐驯化之后得到的乳酸菌耐胆盐的能力比亲代乳酸菌强，乳酸菌容易对胆盐性能产生耐受性，且具有一定的遗传性，选育出耐胆盐的屎肠球菌在生产中具有重要的意义。
表3 不同胆盐浓度耐受性试验结果
Figure BDA0000105254130000062
1.4 抗生素抗性选育
将各种抗生素按表4所列溶剂溶解，滤菌后按试验所需用量无菌加入到灭菌的MRS培养基中，将上述试验中选育好的的菌株NFER-5按2％(v/v)的接种量接种到含不同含量抗生素(表4)的MRS液体培养基中，37℃培养24h，观察其菌落生长情况。
表4 各种抗生素种类、用量及试验结果
Figure BDA0000105254130000071
注：+，菌体生长；-，菌体不长
结果如表5所示，为试验中用到的抗生素种类，各抗生素使用量以及试验结果。
表5 各种抗生素种类、用量及试验结果
Figure BDA0000105254130000072
注：+，菌体生长；-，菌体不长
从表中可以看出NFER-5在含有喹乙醇、牛至油、洛克沙砷、杆菌肽锌、阿散酸、金霉素和抗敌素的培养基中生长正常；在含有乙酰甲喹、速大肥、泰乐菌素、磺胺二甲嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶、吉他霉素的培养基中不生长。说明NFER-5对喹乙醇、牛至油、洛克沙砷、杆菌肽锌、阿散酸、金霉素和抗敌素有抗性；对其它抗生素敏感。
1.5、抗菌的活性
将NFER-5(命名为康80)用MRS肉汤培养基37℃培养24h后，取5mL培养物(8.2×109CFU/mL)分别与5、10、15mL营养肉汤混合，制成3个含不同菌培养物浓度的营养肉汤(1/2、1/3、1/4)，分别接种伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi，CVCC2212，国家兽医微生物菌种保藏中心)、金黄色葡萄球菌(CVCC1882，国家兽医微生物菌种保藏中心)大肠杆菌K88(Escherichia Coli，CMCC44742，中国医学细菌保藏管理中心)和O157(Escherichia Coli，购自中国兽药监察所)，接种量为培养液的10％，置37℃，5％CO2培养箱培养24h。
检测每组培养物的菌落数，结果见表6。
表6 混合培养试验结果
Figure BDA0000105254130000081
从表中可以看出，在不同浓度下康80对伤寒沙门氏菌均有较好的抑制效果，可以使其活菌数下降5-6个数量级，而自身的生长不受影响，菌浓度均保持在1×108以上；而对大肠杆菌K88和O157有一定的抑制作用，能使其下降2-3个数量级，但效果没有对伤寒沙门氏菌明显，但NFER-5的活菌数基本上都保持不变；NFER-5对金黄色葡萄球菌没有抑制效果，其自身的生长也不受金黄色葡萄球菌影响。
1.6 耐贮藏存活率
MRS肉汤培养基，调节pH为6.7，置于Hungates滚管中，每管装20mL MRS肉汤培养基，制成厌氧无菌肉汤后，每管中加1mL NFER-5，放置在37℃培养箱中培养，分别于0h、24h、72h、104h、128h、176h取样1mL进行活菌计数。计数方法用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10-4～10-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂培养基(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO2的培养箱中，培养24h，取菌落数为50～150个的平皿计数，以平均值表示结果。
存活率的计算公式为：
S贮＝n1/n0
S贮为经过贮藏后的NFER-5存活率；n0为贮藏前每毫升活菌数；n1为分别贮藏0h、24h、72h、104h、128h、176h后每毫升活菌数。
结果如表7所示，
表7为试验菌株不同贮藏时间的活菌数及存活率结果。
Figure BDA0000105254130000091
从表中可以看出，NFER-5的初始活菌浓度为2.4×1010cfu/mL，经37℃恒温培养7d后NFER-5仍保持较高的活菌数量，达到6.8×109cfu/mL。说明此菌具有较好的稳定性。
1.7 生长曲线测定
在500mL锥形瓶里装300mL MRS肉汤培养基。按1％接种量接种乳酸菌培养物，37℃培养18h，以不加供试菌液的MRS液体培养基为空白对照，每隔一小时测定其OD600。记录数据并绘制生长曲线。
生长曲线主要反映一种微生物的生长特性，微生物的生长一般经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段，这是一种典型的生长曲线模型。延迟期是微生物对新的生长环境的适应过程，在这一过程中，微生物表现为数量不变或下降，对其自身的大分子和小分子的组成进行调整，同时也会产生特定的物质如酶等来适应新的环境。对数生长期是微生物对新的环境适应之后，生长繁殖速度呈几何级数的阶段，是数量增长最快的一个阶段，表现为菌体数量和重量的增加。但是到了对数期的末期，由于菌体生长代谢对营养物质的消耗和有毒产物的积累，细菌的生长繁殖速率下降。稳定期是细菌生长速率与死亡速率趋于平衡的阶段。衰亡期细菌数量明显下降。测定生长曲线对于确定合适的发酵时间具有重要作用。
NFER-5的生长曲线如图1所示。从图中可以看出，NFER-5在培养2小时后进入对数生长期，OD600值由0.18开始迅速上升，10小时进入稳定期，OD600值达到1.41，说明此菌生长速度。从生长曲线可以看出，NFER-5的最佳收获期是在培养后10-18h，在这一段时间收获菌体，可以减少获得单位活菌的成本。
1.8 NFER-5基因组DNA提取及16S rRNA测序
16SDNA序列分析：上述NFER-5细菌总DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化(北京)科技有限公司，Tiangen DP302-02)提取。16S rDNA扩增引物采用细菌通用引物，其引物序列为：正向引物为27f(对应于Escherichia coil 8-27位碱基)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTC AG-3′；反向引物为1495r(对应于Escherichiacoil 1495-1515位碱基)：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。反应体系(50μL)如表7所示：
表8 PCR扩增体系
PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性1min；58℃退火1min；72℃延伸2min，进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度约1500bp的阳性产物经纯化后送中美泰和生物技术(北京)有限公司进行序列测定，其中NFER-5细菌的16S rRNA的编码基因的核苷酸序列为序列表中的序列1。
得到的基因序列在GenBank数据库中进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)同源性比对，并利用本地软件Mega4.0与模式菌种进行系统进化亲缘关系研究。利用软件中的cluster W构建系统进化发育树，以同源性大于99％为种的分界阈值将待测菌株鉴定到种。
同样将上述的NFER-1、NFER-2、NFER-3与NFER-4也进行16S rRNA的鉴定，采用MEGA4.0软件分析饲料中乳酸菌和4株模式菌株的16S rRNA基因序列并绘制系统进化树，见图2。从系统进化树可得：NFER-1与NFER-4与Lactobacillus parabuchneriJCM12493亲缘关系较近，16S rRNA基因序列与Lactobacillus parabuchneri的同源性在99％以上，从而将这2株菌归属为Lactobacillus parabuchneri；NFER-3与Lactobacillus plantarum NCDO1752处于同一亚群，结合同源性结果鉴定为Lactobacillus plantarum；NFER-2与Streptococcus thermophilus的同源性为99％，与Streptococcus thermophilusATCC19258也处于同一分支，故鉴定为Streptococcusthermophilus；NFER-5与Enterococcus faecium LMG11423处于同一分支，确定为Enterococcus faecium，命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80。
因此，根据抑菌试验、菌种分离部位和生物学特性选育，筛选出康80作为益生菌的生产菌种。菌株康80于2011年7月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5058，其分类命名为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)。
屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058的细胞为球状，革兰氏染色阳性，其它生物学特性如表9所示。
表9 康80的生物学特性
Figure BDA0000105254130000111
Figure BDA0000105254130000121
该屎肠球菌(Enterococcus Faecium)，是肠球菌属(Enterococcus)的一种。
实施例2、屎肠球菌制剂制备
一、不同菌种液载体吸附所制得的制剂在室温下的长期贮存稳定性
1、实验方法
将屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No.5058接种于MRS培养基，并用醋酸调节pH至6.7，置普通培养箱37℃培养24小时后，用无菌水梯度稀释，得到浓度为1010cfu/g的菌种液。
将上述菌种液离心收集菌体与下述的菌种液载体混匀，室温(25℃)下乳化30分钟，分别得到如下4组制剂：
菌种液载体分别为麦芽糊精(C1960，购自上海源聚生物科技有限公司)、海藻糖(C2072，购自上海源聚生物科技有限公司)和阿拉伯树胶(诺瑞沃(北京)食品有限公司)；
麦芽糊精组制剂：将菌泥、麦芽糊精和水混匀乳化得到，菌体、麦芽糊精和水的质量配比为1∶1.5∶10；
海藻糖组制剂：将菌泥、海藻糖和水混匀乳化得到，菌体、海藻糖和水的质量配比为1∶1.5∶10；
阿拉伯树胶组制剂：将菌体、阿拉伯树胶和水混匀乳化得到，菌泥、阿拉伯树胶和水的质量配比为1∶1.5∶10；
麦芽糊精+海藻糖+阿拉伯树胶组制剂：将菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶混匀乳化得到，菌体、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶和水质量比为1∶1∶0.5∶0.3∶10；
在上述四组制剂制备完时立刻测量菌种活力(通过制剂中菌种的浓度体现)，然后常温(25℃)下分别放置1、6、12、18个周后，再分别测量菌种活力；计算放置后菌种活力占放置前菌种活力的百分比。
结果如表10所示，可以看出，说明麦芽糊精+海藻糖+阿拉伯树胶作为载体的制剂比较稳定。
表10 不同菌种液载体吸附所制得的制剂的长期稳定性研究
Figure BDA0000105254130000131
二、屎肠球菌制剂制备
方法一：
1、发酵屎肠球菌
1)培养基
发酵培养基按照如下方法制备：蔗糖40g/L，蛋白胨10g/L、酵母粉20g/L，K2HPO44g/L，KH2PO4·3H2O 1g/L，MnSO4 0.02g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，加水充分溶解。
2)发酵
整个屎肠球菌发酵生产流程图如图3所示；
2.1)发酵空罐灭菌
在温度121℃，罐压0.08-0.15Mpa的条件下进行发酵空罐灭菌，维持时间为30分钟，并保持流通蒸汽；最后降温至37℃；
2.2)发酵实罐灭菌
将发酵培养基放入发酵罐中，在温度121℃、罐压0.08-0.15Mpa，保持流通蒸汽条件下灭菌维持时间30分钟，
2.3)发酵培养
在发酵罐内温度为37℃的条件下，将由上述一得到的屎肠球菌(EnterococcusFaecium)康80CGMCC No.5058菌种液按照体积比为1％的接种量接种发酵罐培养基中；在温度37℃、罐压0.01-0.03Mpa、搅拌速率为80r/min、pH 6.4-6.6的条件下发酵12小时，在液体菌数≥8.0×1010cfu/mL的条件下降温保压。
2.4)离心收集菌泥
将其在罐压0.08-0.14Mpa条件下，将管道灭菌60-90分钟，收集发酵液，并利用碟式离心机离心(2000g，离心5min)，收集菌泥，检测其活菌数为5×1011cfu/g；
2、菌体乳化保护
将上述菌泥与麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、无菌水按照质量比1∶1∶0.5∶0.3∶10比例混匀，室温(25℃)下乳化30分钟；
其配比即为5×1011cfu∶1g∶0.5g∶0.3g∶10g。
3、喷雾干燥
利用喷雾干燥机在低温真空干燥箱在低温温度27-50℃，真空度-0.096Mpa条件下过筛收集产品，得到屎肠球菌制剂。
将屎肠球菌制剂进行活菌计数检测，其中的屎肠球菌数量(以活菌数计，cfu/g)为5×1010；
包装出厂：密封包装，常温，阴凉干燥处贮藏。
方法二：
1、发酵屎肠球菌
1)培养基
与方法一的发酵培养基基本相同，不同的是蔗糖35g/L，蛋白胨5g/L、酵母粉15g/L，K2HPO4 1g/L，KH2PO4·3H2O 0.5g/L，MnSO4 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L。
2)发酵
2.1)发酵空罐灭菌：与方法一相同。
2.2)发酵实罐灭菌：与方法一相同。
2.3)发酵培养：与方法一基本相同，不同的是发酵温度为15℃，发酵时间为10小时，搅拌速度为100rpm/min；
2.4)离心收集菌泥：与方法一基本相同，不同的是离心时间为8min，离心力为1800g，检测其活菌数为3×1011cfu/g；
2、菌体乳化保护
上述菌泥与麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、无菌水按照配比为3×1011cfu∶0.5g∶0.1g∶0.1g∶10g混匀，室温(27℃)下乳化25分钟；
3、喷雾干燥
与方法一相同，得到屎肠球菌制剂，检测，其屎肠球菌数量(以活菌数计，cfu/g)为3×1010。
方法二：
1、发酵屎肠球菌
1)培养基
与方法一的发酵培养基基本相同，不同的是蔗糖45g/L，蛋白胨15g/L、酵母粉25g/L，K2HPO4 5g/L，KH2PO4·3H2O 1.5g/L，MnSO4 0.03g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L。
2)发酵
2.1)发酵空罐灭菌：与方法一相同。
2.2)发酵实罐灭菌：与方法一相同。
2.3)发酵培养：与方法一基本相同，不同的是发酵温度为45℃，发酵时间为18小时，搅拌速度为120rpm/min；
2.4)离心收集菌泥：与方法一基本相同，不同的是离心时间为10min，离心力为2200g，检测其活菌数为8×1011cfu/g；
2、菌体乳化保护
上述菌泥与麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、无菌水按照配比为8×1011cfu∶2.5g∶1g∶1g∶10g混匀，室温(28℃)下乳化45分钟。
3、喷雾干燥
与方法一相同，得到屎肠球菌制剂，检测，其屎肠球菌数量(以活菌数计，cfu/g)为8×1010。
按照方法一、二、三获得的5批次发酵及其后处理得到的屎肠球菌制剂中屎肠球菌的含量平均为(以活菌数计，cfu/g)1000亿。
实验例3、屎肠球菌(Enterococcus Faecium)制剂的应用
一、对仔猪生产性能的影响
1.1 材料与方法：
试验动物
选取28±2d断奶的杜长大三元杂种仔猪100头，平均体重9.0±0.32kg，按体重随机区组分为2个处理组，每组5个重复，每个重复10头仔猪。
1.2 试验分组
试验共分为两个处理，处理1为试验组，基础日粮添加100g/t的由实施例2方法一得到的屎肠球菌制剂；处理2为对照组(仅有基础日粮)。基础日粮的组成及营养成分见表10。
表10 生长试验的基础日粮组成和营养水平
Figure BDA0000105254130000151
注：1.粗蛋白、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苏氨酸、钙和磷为实测值。
2.每公斤预混料提供：维生素A，11,000IU；维生素D3，1503IU；维生素E，44.1IU；维生素K，4.0mg；核黄素，5.22mg；泛酸，20.0mg；烟酸，26.0mg；维生素B12，0.01mg；锰，35.0mg；铁，100.0mg；锌，90.0mg；铜，165mg；碘，0.30mg；硒，0.30mg。
1.3 饲养管理
试验于汝州市三源牧业猪舍进行。试验期45天。试验期间仔猪饲养在全封闭式的保育仔猪舍内，舍内的温度保持在24～27℃。自由采食，每个栏圈安装有鸭嘴式饮水器供仔猪自由饮水。基础日粮的1％预混料自配，不含有任何抗生素。仔猪的免疫按猪常规兽医传染病的免疫程序进行，仔猪饲养管理措施严格执行卫生防疫制度。
1.4 样品收集与处理
试验在开始时以及结束时称仔猪个体重，计算日增重和饲料采食量。在整个饲养试验阶段，每天上午9:00点观察猪粪便情况(每头腹泻猪当天只统计一次)、发病和死亡情况。试验结束时对仔猪的外观进行逐头评分，具体方法见表11
皮毛指数＝皮肤红润程度+毛色亮度+毛顺程度
表11 仔猪外观评分标准
  分数   皮肤红润程度   毛色亮度   毛顺程度
  1   苍白   无光泽   明显凌乱
  2   微红   微弱光泽   微弱凌乱
  3   红润   明显光泽   柔软
1.5 数据统计
试验所有数据采用SPSS12.0(SPSS Inc.，USA)统计软件的独立样本t检验处理统计。
2、结果与分析
2.1 屎肠球菌对仔猪断奶后生长性能的影响
统计分析结果见表12，试验组间平均日采食量、平均日增重差异不显著，但与对照组相比差异显著，表明日粮中添加屎肠球菌可以增加断奶仔猪的日采食量和日增重。试验组的料肉比低于对照组，且差异显著，表明日粮中添加屎肠球菌可以降低断奶仔猪料肉比。因此，日粮中添加屎肠球菌、天蚕素可以能有效提高断奶仔猪的生长性能。
表12 日粮中添加屎肠球菌对断奶仔猪生产性能的影响
Figure BDA0000105254130000161
2.2 日粮中添加屎肠球菌对断奶仔猪腹泻的影响
各组腹泻情况见表13，试验组与对照相比，降低了77.20％，表明日粮中添加屎肠球菌可以有效减少断奶仔猪的腹泻。
表13 断奶仔猪腹泻情况
Figure BDA0000105254130000171
2.3 日粮中添加屎肠球菌对断奶仔猪皮毛指数的影响
由表14看出，试验组的皮毛指数显著好于对照组，表明日粮中添加屎肠球菌可以改善猪只的皮毛。
表14 日粮中添加屎肠球菌对仔猪毛皮指数的影响
  猪号   试验组   对照组   猪号   试验组   对照组
  1   333   233   26   333   233
  2   322   333   27   333   232
  3   333   223   28   333   233
  4   322   322   29   332   223
  5   322   233   30   333   333
  6   333   323   31   322   232
  7   333   333   32   223   233
  8   333   322   33   322   233
  9   333   333   34   333   233
  10   333   233   35   333   233
  11   232   212   36   333   322
  12   322   222   37   333   333
  13   322   322   38   333   322
  14   323   322   39   333   333
  15   333   233   40   333   233
  16   333   223   41   322   222
  17   323   322   42   233   322
  18   333   233   43   323   223
  19   232   333   44   333   333
  20   333   322   45   333   322
  21   322   221   46   332   231
  22   323   222   47   333   233
  23   333   223   48   333   233
  24   322   223   49   333   121
  25   333   233   50   333   221
2.4 经济效益分析
保育猪按18元/kg，饲料按6.15元/kg，屎肠球菌按200元/kg，，则各组收益见表15，与对照组相比，日粮中添加屎肠球菌每头猪可增加收入13.61元。
表15 日粮中添加屎肠球菌对仔猪经济效益的影响
Figure BDA0000105254130000181
因此，日粮中添加屎肠球菌可以显著提高酸奶仔猪的生产性能，降低仔猪腹泻率，改善猪只皮毛，增加猪的经济效益。
二、屎肠球菌制剂对肉鸡生长性能的影响
1.1 材料与方法：
试验动物
试验选用健康爱拔益加(Arbor Acres，AA)肉雏鸡3000只，平均体重约为49.1g，按体重随机区组分为2个处理组，每组5个重复，每个重复300只鸡。
1.2 试验分组
试验共分为两个处理，处理1为试验组，基础日粮添加100g/t的由实施例2方法一得到的屎肠球菌制剂；处理2为对照组，基础日粮的组成及营养成分见表16。整个试验期为54天。
表16 日粮配方及营养水平(％)
Figure BDA0000105254130000182
Figure BDA0000105254130000191
1.3 饲养管理
肉鸡场饲养方式为半封闭式网上平养，前15天饲喂颗粒料、15天到出栏饲喂给干粉料；自由采食和饮水；每周消毒两次，消毒方式带鸡喷雾消毒；温度由温度调控器控制；加热方式采用鼓风机吹热风；纵向通风；光照用白炽灯；每日观察鸡群的健康状况。
1.4 样品收集与处理
试验在开始时以及结束时称鸡，计算日增重、饲料采食量以及饲料转化效率。每日上午9:00观察鸡群，记录死亡数。
1.5 统计分析
数据的统计分析采用SPSS12.0(SPSSInc.，USA)软件的独立样本t-检验进行统计分析。
2、结果与讨论
试验期间肉鸡的生长性能指标的统计结果见表17。
表17 日粮中屎肠球菌对肉鸡生长性能的影响
Figure BDA0000105254130000201
从表17可以看出，日粮中添加屎肠球菌增加肉鸡的日增重(P＜0.01)、日采食量(P＜0.05)，降低饲料转化率(P＜0.05)。虽然试验组鸡的存活率略微下降，但差异不显著(P＞0.05)，这可能与试验过程中雏鸡得了腺胃炎有关。
因此，日粮中添加屎肠球菌可以显著提高肉鸡的生长性能，是一种有益的菌种。
用实施例2的方法二、三得到的制剂进行实验，结果与方法一无显著差异。
Figure IDA0000105254230000011

Claims (10)

1.一种屎肠球菌制剂，其活性成分为屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80CGMCC No.5058。
2.一种制备权利要求1所述的制剂的方法，包括如下步骤：
1)发酵屎肠球菌(Enterococcus Faecium)康80 CGMCC No.5058，离心收集沉淀，得到菌泥；
2)将步骤1)得到的菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水混匀乳化，即得到屎肠球菌制剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述发酵的温度为15℃-45℃，所述发酵的时间为10小时-18小时，所述发酵所需的pH值为4.5-8.6，所述发酵的压力为0.01Mpa-0.03Mpa；
所述发酵的温度具体为15℃、37℃或45℃，所述发酵的时间为10小时、12小时或18小时，所述发酵所需的pH值具体为6.4-6.6；
步骤2)中，所述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比为3×1011cfu-8×1011cfu∶0.5g-2.5g∶0.1g-1g∶0.1g-1g∶10g；
所述菌泥、麦芽糊精、海藻糖、阿拉伯树胶、水的配比具体为3×1011cfu、5×1011cfu或8×1011cfu∶0.5g、1g或2.5g∶0.1g、0.5g或1g∶0.1g、0.3g或1g∶10g。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述发酵采用的培养基按照如下方法制备：将蔗糖、蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、KH2PO4·3H2O、MnSO4、MgSO4·7H2O和水混匀，得到培养基，所述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度为35g/L-45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度为5g/L-15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度为15g/L-25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度为1g/L-5g/L，所述KH2PO4·3H2O在所述发酵培养基中的浓度为0.5g/L-1.5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度为0.01g/L-0.03g/L，所述MgSO4·7H2O在所述发酵培养基中的浓度为0.1g/L-0.6g/L。
所述蔗糖在所述发酵培养基中的浓度具体为35g/L、40g/L或45g/L，所述蛋白胨在所述发酵培养基中的浓度具体为5g/L、10g/L或15g/L，所述酵母粉在所述发酵培养基中的浓度具体为15g/L、20g/L或25g/L，所述K2HPO4在所述发酵培养基中的浓度具体为1g/L、4g/L或5g/L，所述KH2PO4·3H2O在所述发酵培养基中的浓度具体为0.5g/L、1g/L或1.5g/L，所述MnSO4在所述发酵培养基中的浓度具体为0.01g/L、0.02g/L或0.03g/L，所述MgSO4·7H2O在所述发酵培养基中的浓度具体为0.1g/L、0.4g/L或0.6g/L；
所述离心力为1800g-2200g，所述离心力具体为1800g、2000g或2200g；所述离心的时间为5min-10min，所述离心的时间具体为5min、8min或10min；
步骤2)中，所述乳化的温度为25℃-28℃，所述乳化的时间为25min-45min；
所述乳化的温度具体为25℃、27℃或28℃，所述乳化的时间为25min、30min或45min。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：
在所述步骤2)后，在所述乳化后还包括将乳化产物干燥得到屎肠球菌制剂的步骤。
6.由权利要求2-5中任一所述的方法制备的屎肠球菌制剂。
7.权利要求1屎肠球菌制剂或权利要求6所述的屎肠球菌制剂在作为动物饲料添加物中的应用。
8.权利要求1屎肠球菌制剂或权利要求6所述的屎肠球菌制剂在制备动物饲料中的应用。
9.权利要求1屎肠球菌制剂或权利要求6所述的屎肠球菌制剂在促进动物生长中的应用。
10.根据权利要求7-9中任一所述的应用，其特征在于：
所述动物为猪或鸡。
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