CN1831114A - 屎肠球菌菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种屎肠球菌菌株，该菌株的保藏名称为：屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZD－0401，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2006年1月16日，保藏号：CCTCC M206013。该菌株的用途是：将该菌株制成微生态制剂作为畜禽饲料的添加剂，用于促进养殖动物的生长性能。
Description
技术领域
本发明涉及一种屎肠球菌菌株(Enterococcus faecium)及其用途。
背景技术
动物肠道中通常有一层微生物或微生物层，在正常情况下即动物处于健康状况时，并未表现异常或致病现象，这一层微生物称为肠道微生物。它是动物胃肠道中不可缺少的组成部分，对宿主动物绝大多数是有益无害的。使用无菌或抗生素处理的试验动物所做的大量试验证明，由于肠道已经存在的微生物与侵入的病原菌竞争肠粘膜上的粘附位点，因此肠道正常菌群可以竞争性排斥外来致病菌在肠道的定植。乳酸菌是人和动物体内的有益微生物之一，是动物肠道的正常定植菌群，其定植在肠粘膜上皮细胞上，并抑制其它病原菌的粘附。在胃肠道400多种厌氧或好氧微生物中，乳酸菌约占10％。研究表现，与下痢猪相比，正常仔猪肠道大肠杆菌数量明显下降，而乳酸杆菌数大大提高。用乳酸杆菌接种仔猪，发现与未处理或下痢仔猪相比，处理猪肠组织匀浆液中大肠杆菌数量明显降低，而乳酸杆菌数量大大提高。
乳酸菌的保健功能早在20世纪初就已经被指出，但有关乳酸菌微生态制剂的研究却开始于20世纪70年代后期。目前，乳酸菌微生态制剂的保健功能已受到全世界的广泛关注，其功能及特点主要有以下几点：
(1)、调节动物消化道微生物区系平衡，阻止病原菌对肠道的入侵和定植。乳酸菌通过自身以及代谢产物与其它微生物之间的相互作用，调整菌群之间的关系，维持和保证微环境中微生物群最佳优势组合以及这种组合的相对稳定。而且乳酸菌与小肠粘膜上皮细胞结合，起占位作用，对有害菌有屏障排除能力。
(2)、抑制病原菌和抗感染，维持肠道的微生态平衡。乳酸菌可以产生乳酸等有机酸，显著降低消化道pH值，使肠内处于酸性环境。这对于致病菌如痢疾杆菌、伤寒杆菌、付伤寒杆菌、弯曲杆菌、葡萄球菌等致病菌有拮抗作用。而且低pH值能促进肠道蠕动，维持正常生理功能，防止致病菌的定植；乳酸菌还可以产生细菌素、过氧化氢等多种天然物质，其中过氧化氢能够抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌如假单抱菌属、大肠杆菌类和沙门氏菌属等，而细菌素对葡萄球菌、梭状芽抱杆菌以及沙门氏菌和志贺氏菌有拮抗作用。
(3)、活化免疫系统，增强免疫力。乳酸菌在幼龄动物免疫力的发展中起重要的作用，特别是针对抗原引起的保护性反应肠道炎症。Perdigon等研究证明干酪乳杆菌能促进肠道分泌免疫球蛋白IgA，增强宿主肠粘膜的肠道粘膜反应。Lessard和Brisson给断奶仔猪饲喂乳杆菌后，接种传染性胃肠炎病毒疫苗，试验组血清中的特异性抗体IgG水平显著高于对照组。进一步研究证实：乳酸菌及其代谢产物刺激动物机体的免疫系统，其作用与免疫佐剂相似，能诱导动物一些与免疫有关的细胞产生白细胞介素、促进细胞分裂素、干扰素、肿瘤坏死因子等。
(4)、乳酸菌还能产生一些特殊的酶系，如产生有机酸的酶系、合成多糖的酶系、分解乳酸菌生长因子的酶系、分解亚硝胺的酶系、降低胆固醇的酶系、控制内毒素的酶系、分解脂肪的酶系、合成各种维生素的酶系和分解胆酸的酶系等。这些酶能加速乳酸菌的生长，促进机体健康。
(5)、乳酸菌在发酵过程中会产生大量的乳酸和其他有机酸，从而使发酵液pH急剧下降，而在低pH情况下乳酸菌的生长将受到抑制，这对增加菌体生物量是非常不利的，所以在液体培养基中大都添加磷酸缓冲溶液和钙盐以降低pH对乳酸菌的危害。通常在发酵过程中pH控制在5.5-6.0左右。
基于乳酸菌的诸多优点，它已成为广大从事乳酸菌食品添加剂、益生素、开发新药、饲料工业等领域研究人员的研究热点。其中在饲料工业上，乳酸菌常和其他益生菌一起制成微生态制剂用于饲料来促进畜禽特别是幼龄动物的生长发育，减少发病率和死亡率。但是，目前乳酸菌最大的缺点就是生命力十分脆弱，无法久存。研究发现，乳酸菌必须在肠道特定部位才能产生功效。而天然乳酸菌不耐饲料制粒时的高温、胃酸及胆盐的侵蚀。经饲料制粒后大多数乳酸菌会死亡，在胃里大约三十分钟后就也会死亡殆尽，安全到达肠道发挥作用的活菌数非常低；也无法吸附在肠道粘膜的适当位置，结果只能是随着粪便排出体外，产生不了任何作用。鉴于此，强耐受力的乳酸菌株的分离和筛选迫在眉睫，这不仅关系到绿色畜禽养殖业的可持续发展和安全动物性产品的生产，也是保证广大人民的健康生活、保护养殖生态环境和我国进入WTO参与国际竞争的必然选择。
发明内容
针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能促进养殖动物的生长性能的屎肠球菌菌株。
本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种屎肠球菌菌株，该菌株的保藏名称为：屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2006年1月16日，保藏号：CCTCC M206013。
该菌株革兰氏阳性，椭圆形或球杆状，无芽孢，无鞭毛；在营养琼脂和麦康凯琼脂能生长，出现小于1mm的光滑圆润的菌落。在血琼脂平板上可形成约1mm的稍大菌落，光滑、较湿润、易乳化。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，也易形成长链。该菌株生长温度为30～40℃，最适生长温度35～38℃，适宜pH为5.0～7.5。
该菌株对庆大霉素、链霉素不敏感，对青霉素、氟霉素、红霉素、四环素、利福平、万古霉素、氯霉素敏感。能够利用(阳性)蔗糖、蜜二糖、葡萄糖(产气)、乳糖、麦芽糖和甘露醇；不能够利用(阴性)鼠李糖、棉子糖、山梨醇和松三糖。过氧化氢酶呈阴性，木糖精氨酸双水解酶阴性。
该菌株可在麦麸上生长，在PYG培养基中培养24～48h，发酵液菌数可达1010cfu/ml以上。该菌株能在6.5％氯化钠肉汤、pH9.6葡萄糖肉汤、50％胆汁PYG琼脂斜面，及50℃生长、热稳定性试验80℃水浴条件下10min存活率85～95％。该菌株发酵培养可产生代谢产物乳酸，产生量可达0.5g/L以上。
本发明还提供了屎肠球菌菌株的用途：用于促进养殖动物的生长性能；具体为将该菌株制成微生态制剂作为畜禽饲料的添加剂，用于促进养殖动物的生长性能。
将本发明的菌株制成微生态制剂的方法有如下两种：
1、液体发酵方法：以蛋白胨、麸皮和酵母膏为碳源和氮源，35～38℃发酵培养24～48h。
2、以麸皮和豆粉为主要原料的固体发酵方法，依次进行以下步骤：
(1)、一级种子(试管斜面种子)：将原始菌种接种至试管营养琼脂固体培养基，35～38℃培养24～48h；
(2)、二级种子(试管液体种子)：将一级种子接种至试管营养肉汤液体培养基，35～38℃培养24～48h；
(3)、三级种子(三角瓶液体种子)：将二级种子接种至含有50～150ml的5～20％麸皮浸出液培养基的三角瓶中，35～38℃培养24～48h；
(4)、培养基配制：麸皮和豆粉混合原料经粉碎后加入等重量比例水，0.11Mpa灭菌50min，冷却；
(5)、发酵：培养基按1～10％的比例接入三级种子，培养基含水量控制在45～50％，发酵室内相对湿度保持在80％以上，pH范围为5.0～7.5，温度维持在35～38℃，通风发酵36～60h。
将上述培养物在45～50℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包装即成固态的微生态制剂。
本发明的屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401具有如下优点：
1)菌株ZD-0401以畜禽养殖动物为对象设计并分离和筛选，针对性强；
2)耐高温、耐盐并对胆汁具有抗性，易于在动物体内存活和定植；可以代谢产生乳酸，兼有乳酸菌的效果，pH适应范围广；动物服用后，能安全到达肠道发挥作用的活菌数高，因此适宜制成饲料制粒；
3)该菌培养方便，生长速度快，能在廉价的原料上生长；
4)该菌不产生有害物质，以它制备的微生态制剂用作畜禽的绿色添加剂，可显著促进养殖动物的生长性能。
具体实施方式
实施例1、菌种分离和筛选
将健康猪肠道内容物制成悬浮液，经营养肉汤富集培养24小时后(35～38℃)，置于80℃水浴锅中加热5～10分钟，杀死不耐高温的菌体。取出静置10分钟，稀释后用无菌刮铲将样品液涂布均匀，用溶化的SBA培养基覆盖所有的平板，35～38℃生化培养箱中培养48h。挑取铁红色菌落稍加稀释后显微镜下观察，对于细胞呈椭圆形或球杆状，顺连的方向延伸，直径0.5～1.0μm，成对或成短链状的形态的菌落继续进行筛选。
对于过氧化氢酶呈阴性，木糖精氨酸双水解酶阴性的菌株进行进一步划线分离纯化，根据菌落大小选取生长良好的菌落反复接种筛选，直至得到均匀的单个菌落，命名为ZD-0401。
实施例2、菌种鉴定
(1)形态特征
菌株ZD-0401革兰氏阳性，椭圆形或球杆状，无芽孢，无鞭毛，在营养琼脂和麦康凯琼脂能生长，出现较小(小于1mm)光滑圆润的菌落。在血琼脂平板上形成稍大(约1mm)的菌落，光滑、较湿润、易乳化。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，也易形成长链。
(2)生化特性
菌株ZD-0401对庆大霉素、链霉素不敏感，对青霉素、氟霉素、红霉素、四环素、利福平、万古霉素、氯霉素敏感。能够利用(阳性)蔗糖、蜜二糖、葡糖(产气)、乳糖、麦芽糖和甘露醇；不能够利用(阴性)鼠李糖、棉子糖、山梨醇和松三糖。
(3)培养特征
菌株ZD-0401在温度30～40℃均可较好生长，最适生长温度35～38℃，适宜pH为5.0～7.5，能在6.5％氯化钠肉汤，pH9.6葡萄糖肉汤、50％胆汁PYG琼脂斜面、及50℃生长，热稳定性试验80℃水浴条件下，10min存活率85～95％。菌株ZD-0401在PYG培养基中培养24～48h，发酵液菌数可达1010cfu/ml以上。菌株ZD-0401发酵液代谢产物有机酸组分分析参照沈萍等(2004)利用气相色谱测定(HP6890GC，USA)，结果表明菌株ZD-0401发酵培养可产生代谢产物乳酸，产生量可达0.5g/L以上。根据《Bergey′s Mannual ofDeterminative Bacteriology》(Holt，J.G.，Gibbons，N.E.，1994)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠和蔡妙英等，2001)，通过性态特征、生化特性和培养特征，确定菌株ZD-0401为屎肠球菌。将该菌株进行保藏，保藏名称为：屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2006年1月16日，保藏号：CCTCC M206013。
实施例3、制作微生态制剂
本实施例中所有的“％”均代表重量比。
方法1、液体发酵法：
斜面培养基：营养琼脂培养基和10％麸皮浸出液，2％琼脂，自然pH，121℃高压灭菌30min。
营养盐溶液的组成(％)：KH2PO4，0.05；MgSO4.7H2O，0.05；CaCl2，0.01；NaCl，0.10；FeSO4.7H2O，0.005；MnSO4.H2O，0.001；ZnSO4.7H2O，0.0005；CoCl2，0.0005；其余为水。
培养基：在营养盐溶液中加入5％麸皮浸出液、1％酵母膏，调pH6.5。
培养条件：250ml三角瓶装入培养基100ml，用屎肠球菌ZD-0401悬液接种1.0ml，100r/min旋转式振摇，在37℃下培养36h。
方法2、固体发酵法：
(1)、一级种子(试管斜面种子)：将原菌种接种至试管营养琼脂固体培养基，37℃培养24h；
(2)、二级种子(试管液体种子)：将一级种子接种至营养肉汤液体培养基，37℃培养24h；
(3)、三级种子(三角瓶液体种子)：从二级种子接种至5％麸皮浸出液培养基，37℃培养24h；
(4)、培养基配制：原料(麸皮∶豆粉＝4∶1)经粉碎后加入等重量比例水，0.11Mpa灭菌50min，冷却至37℃；
(5)、发酵：培养基按5％的比例接入三级种子，37℃通风发酵48h。
(6)、培养物在45℃干燥，粉碎，加入配料，混合后包装。
实施例4、应用
效果1：
以1日龄AA商品代混合雏鸡160只为试验动物，分为对照组和试验组，各80只。每10只放置于一铁笼中(规格为100cm×80cm×50cm)，饲喂相同的玉米-豆粕型基础日量。其中对照组仅饲喂基础日量，试验组按照108cfu/kg的浓度添加ZD-0401；两组鸡同样的24h光照、自由采食和饮水。结果表明：在肉鸡饲料中添加ZD-0401，具有明显地促生长和改善饲料利用率的作用。42日龄时，试验组肉鸡平均体重和饲料系数分别为1.91kg和1.83，而对照组分别为1.82kg和1.98，差异均显著。进一步研究发现，添加ZD-0401的试验组与对照组相比较，肠道中大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌等有害菌株数目显著下降，而乳酸菌、双歧杆菌等有益菌株数目显著升高。此外，经检测，试验组肉鸡肠道中乳酸和丙酸的数量也显著高于对照组。
效果2：
本试验选用64头28±2日龄平均体重为7.5±0.3kg的去势断奶“杜长大”三元杂交仔猪，按照胎次一致，品种相同、体重相近、公母各半的分组方法，随机分为对照组和试验组，饲喂相同的基础日粮，试验组按照108cfu/kg的浓度添加ZD-0401。两组猪均在试验前对猪舍进行严格消毒，均采用群饲、自由采食和饮水。试验预饲期7天，正式期45天。结果表明，添加一定浓度的ZD-0401可以显著提高仔猪的生长性能和防病能力。与对照组相比，试验组平均日增重提高9.8％，饲料系数下降了18％，仔猪腹泻率下降70％。此外，与对照组相比较，试验组猪肠道中乳酸菌和双歧杆菌数量也明显增高，而大肠杆菌和沙门氏菌数量显著下降。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (5)
1、一种屎肠球菌菌株，其特征在于，该菌株的保藏名称为：屎肠球菌(Enterococcus faecium)ZD-0401，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2006年1月16日，保藏号：CCTCC M206013。
2、根据权利要求1所述的屎肠球菌菌株，其特征是：该菌株革兰氏阳性，椭圆形或球杆状，无芽孢，无鞭毛；在营养琼脂和麦康凯琼脂能生长，出现小于1mm的光滑圆润的菌落；在血琼脂平板上可形成约1mm的稍大菌落，光滑、较湿润、易乳化；在液体培养基中呈均匀浑浊生长，也易形成长链；
3、根据权利要求2所述的屎肠球菌菌株，其特征是：该菌株生长温度为30～40℃，适宜pH为5.0～7.5。
4、如权利要求1～3所述的屎肠球菌菌株的用途：用于促进养殖动物的生长性能。
5、根据权利要求4所述的屎肠球菌菌株的用途：将该菌株制成微生态制剂作为畜禽饲料的添加剂，用于促进养殖动物的生长性能。
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