CN103289910A - 一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，采用凝结芽孢杆菌作为发酵菌种，在优化的固体培养基中，在温度为37~40℃的条件下培养，经过三级放大而进行大规模发酵生产，然后将凝结芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度可达9.10×10⁹CFU/g鲜曲，芽孢浓度可达2.45×10⁹CFU/g鲜曲。本发明有益效果：本发明生产工艺简单稳定，活菌体密度高，发酵产物无需分离纯化便可直接使用，易于生产和推广；同时将凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂添加到饲料中，能够在动物的盲、结和直肠定植，发酵产生大量抗菌凝固素、乳酸、氨基酸、维生素和多种消化酶，提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低料肉比。

Description

一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法

技术领域

本发明涉及固体发酵工程领域，尤其涉及一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法。 

背景技术

近年研究表明，益生菌可改善动物肠道菌群的平衡，增强动物机体免疫力，提高动物消化功能，促进动物生长发育和提高动物生产性能等益生作用，其作为绿色饲料添加剂取代抗生素已得到广泛应用。 

凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），革兰氏阳性菌，不仅属于硬（或厚）壁菌门，而且属于肠道乳酸菌，又称为“有孢子性乳酸菌”。是经美国FDA批准的一种“普遍认为安全”的杆菌类乳酸菌，口服后，凝结芽孢杆菌在动物的盲、结和直肠定植，发酵产生大量抗菌凝固素、乳酸、氨基酸、维生素和多种消化酶。 

凝结芽孢杆菌经人工胃液（pH1.4）处理2小时后的存活率为95.29%，双歧杆菌存活率为5.20%，乳酸杆菌的存活率为5.50%。研究表明凝结芽孢杆菌对人工胃液的酸性条件耐受性极强，其存活不受影响，明显优于其它微生态制剂，能顺利通过胃进入肠道，从而保证药效的正常发挥，将凝结芽孢杆菌密封于塑料瓶内，置于55℃干燥箱内处理60小时后，测定活菌数的结果表明，仍不低于1亿 cfu/g，水分含量无明显改变，凝结芽孢杆菌制剂可以在室温保存，有效期可达24个月。 

凝结芽孢杆菌的功能特点：（1）有效抑制有害菌的生长，改良肠道微生态环境，促进肠道发育，增强肠道功能；（2）提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低料肉比；（3）有效改善断奶仔猪由于应激和过敏反应引起的菌群失调性腹泄；（4）无任何毒副作用，使用安全，并可降低环境中的氨气、硫化氢等有害气体，改善养殖环境。 

凝结芽孢杆菌活菌制剂能耐胃酸进入肠道，分泌肠道蠕动促进剂乳酸，促进肠道蠕动，加速排便。同时凝结芽孢杆菌能促进双歧杆菌等肠道有益菌生长，分泌抗菌凝固素，抑制肠道内变形杆菌和痢疾杆菌等肠道有害菌，减少氨、胺和吲哚等肠道毒素的产生，消除肠道毒素对肠的麻痹作用，避免肠道毒素吸收入血对肝、脑和皮肤等造成损伤，并能提高免疫功能，延缓衰老。凝结芽孢杆菌在肠道内产生酶和维生素类营养物质，促进营养物质的消化吸收；同时凝结芽孢杆菌活菌制剂对右旋葡聚糖硫酸钠诱发的大鼠实验性溃疡性结肠炎，能显著地缩小溃疡面积，降低髓过氧化物酶活性，有明显的抗炎治疗作用，它对大鼠免疫性溃疡性结肠炎有显著治疗作用，能抑制IL-8、TNF-α等致炎症因子的过度异常表达，抑制抗结肠抗体IgG的过度表达，降低B淋巴细胞转化率，提高T淋巴细胞转化率，纠正肠免疫紊乱，恢复肠免疫耐受力，消除炎症和溃疡，有效治疗溃疡性结肠炎，展现出了教好的应用前景。 

根据凝结芽孢杆菌发酵条件单因素优化实验结果，筛选出最佳的碳源、氮源、磷源及2种对发酵水平影响较大的无机盐类（MnSO₄·H₂O和MgSO₄·7H₂O），设计五因素四水平正交试验，并对结果进行直观分析和方差分析，优化培养基组成，得到最佳固体培养基配方，固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为2:1）、KH₂PO₄ 0.3~0.5wt%、MnSO₄·H₂O 0.02wt%和MgSO₄·7H₂O 0.125wt‰，将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀。将固体培养基在121℃温度的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用。经过对凝结芽孢杆菌发酵条件进行优化以得到其最佳培养温度为37~40℃，起始 pH值7.0，接种量8~10%。目前的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，工艺过程复杂，不易简单操作，活菌体密度较低，不能达到生产以及使用的要求。 

发明内容

本发明的目的是提供一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，以克服现有的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法存在的上述不足。 

实现本发明目的的技术方案如下： 

一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基固体平板上划线，在温度为37~40℃的条件下培养20~24小时；

（2）制备一级种子：将活化的凝结芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于200 mL 液体种子培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为37~40℃和250rpm条件下，振荡培养20~24小时后，制得一级种子菌；

（3）配制固体发酵培养基：将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件，搅拌均匀，将固体培养基在121℃温度下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4）固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为37~40℃的条件下，培养20~24个小时，制得二级种子；

（5）将得到的二级种子，按照步骤（4）进一步固体发酵得到三级种子；

（6）可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照步骤（4）进一步固体发酵扩大培养；

（7）将凝结芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度可达9.10×10⁹ CFU/g 鲜曲, 芽孢浓度可达2.45×10⁹ CFU/g 鲜曲。

进一步的，所述步骤（1）中的菌种为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）。 

优选的，所述步骤（1）中固体种子培养基的组成为：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、25%浓度MnSO₄添加至0.2%和琼脂粉15g；所述步骤（2）中的液体种子培养基的组成为：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g和25%浓度MnSO₄添加至0.2%；所述培养基均通过高温高压灭菌。 

优选的，所述步骤（3）中的固体干基为：以玉米粉和豆饼粉为基础料、KH₂PO₄ 0.3~0.5wt%、MnSO₄·H₂O 0.02wt%和MgSO₄·7H₂O 0.125wt‰；所述固体干基中玉米粉与豆饼粉的质量之比为2:1。 

本发明的另一个目的在于提供该凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂在动物养殖业中的应用，优选的，所述凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂的添加量为1~3wt%。 

本发明有益效果：本发明生产工艺简单稳定，活菌体密度高，发酵产物无需分离纯化便可直接使用，易于生产和推广；同时将凝结芽孢杆菌作为饲料添加剂添加到饲料中，能够在动物的盲、结和直肠定植，发酵产生大量抗菌凝固素、乳酸、氨基酸、维生素和多种消化酶，提高饲料品质，促进饲料的消化吸收，降低料肉比。 

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为本发明的限制。 

实施例1 固体发酵生产凝结芽孢杆菌培养物的工艺流程，步骤如下： 

（1）菌种活化：本发明采用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）作为发酵菌种，保藏号：GIM 1.421，购于广东省微生物菌种保藏中心。将-80℃保存的凝结芽孢杆菌菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、25%浓度MnSO₄添加至0.2%和琼脂粉15g，经高温高压灭菌后备用）固体平板上划线，37~40℃培养20~24小时；

（2）制备一级种子：将活化的凝结芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于200 mL 液体种子培养基中种子培养基（胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g和25%浓度MnSO₄添加至0.2%，经高温高压灭菌后备用），将三角瓶置于摇床中，37~40℃，250rpm，振荡培养20~24小时后，制得一级种子液；

（3）配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为2:1）、KH₂PO₄ 0.3~0.5wt%、MnSO₄·H₂O 0.02wt%和MgSO₄·7H₂O 0.125wt‰。将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件，搅拌均匀。将固体培养基在温度为121℃的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；  

（4）固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为37~40℃的条件下，培养20~24个小时，制得二级种子。将二级种子按照8~10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为37~40℃的条件下，培养20~24个小时，制得三级种子。可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步扩大培养。将凝结芽孢杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达9.10×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢浓度可达2.45×10⁹ CFU/g 鲜曲；

（5）将固体发酵的凝结芽孢杆菌培养物进行低温干燥，粉碎和包装，制成产品。

实施例2 固体发酵生产凝结芽孢杆菌培养物的小鼠急性毒性试验 

选取健康NIH小鼠40只，雌雄不拘，体重30g左右，随机分成2组，分别为空白对照组和凝结芽孢杆菌培养物干粉组，每组20只小鼠。实验前先记录一次小鼠的体重，实验开始时，各组小鼠按0.8ml的最大给药体积一次性给予受试样品，给药后连续观察7天，观察7天内小鼠是否出现精神，活动，饮食异常情况及死亡情况。对于死亡的小鼠应立即解剖观察心，肝，脾，肺，肾等，记录病变情况。于第8d将各组小鼠记录体重，比较组间差异；然后处死全部小鼠，对重要器官进行观察，记录病变情况。

试验结果：小鼠单次给药最大浓度和最大体积的当天，未见小鼠出现死亡，且小鼠毛色光洁、活动正常、饮食正常；给药后连续观察7天，各组小鼠精神活跃，活动正常，摄食及饮水正常，且未见死亡情况发生。各组小鼠给药前后的体重和观察结果分别见表1、表2所示，受试样品对小鼠的体重无明显的影响，实验结束后，处死所有的小鼠，肉眼对重要脏器包括心、肝、脾、肺、肾、脑等进行检查，未发现明显的器质性病变；由此提示在当前剂量下，受试样品未见明显毒性反应。 

                                 

表1 小鼠给药前后体重变化表

  

            

表2 给药后连续观察7d实验记录

实验结论：由小鼠单次给药最大耐受量实验结果可得，小鼠一次给予样品的最大浓度和最大体积18.7g/kg时，未见明显毒性反应，按体表面积换算相当于70kg成人服用剂量为145g；按体重换算相当于70kg成人服用剂量为1309g；受试样品为低毒且安全的样品。

实施例3 凝结芽孢杆菌饲料产品促进断奶仔猪生长的应用 

实验选取320头断奶仔猪（二元仔猪285头，三元仔猪36头），随机分为对照组和实验组，每组160头仔猪，设160个重复。对照组基础日粮中不添加凝结芽孢杆菌，实验组基础日粮中添加凝结芽孢杆菌培养物1.5%。对照组初始均重与实验组初始均重差异不显著。实验结束时，实验组每头保育猪较对照组平均提高了1.84 kg，平均日增重提高了43 g，死亡淘汰率降低了3%，料肉比降低了0.18。实验证明，凝结芽孢杆菌饲料产品能够有效地提高保育猪的生产性能。

       

注：表中数据后*表示t-检验分析结果，在p<0.01水平下，**表示差异极显著 

表3生产性能分析           

此外，每日饲养管理观察，实验组饲喂7天后猪群皮毛红润，活力强，采食量高；20天后毛色、活力效果更加明显；42天实验结束后猪只体型修长，骨架拉长，非常有利于猪只的后期生长。对照组中有两头猪只因腹泻原因造成身体消瘦不采食，通过手动饲喂湿拌料（日粮中添加奶粉、复合抗菌肽和水）成功救活，说明该凝结芽孢杆菌饲料产品对发病猪的恢复效果明显。 

Claims (8)

1.一种凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）菌种活化：将-80℃保存的菌种在固体种子培养基固体平板上划线，在温度为37~40℃的条件下培养20~24小时，所述菌种为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）；

（2）制备一级种子：将活化的凝结芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于200 mL 液体种子培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为37~40℃和250rpm的条件下，振荡培养20~24小时后，制得一级种子菌；

（3）配制固体发酵培养基：将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件下，搅拌均匀，将固体培养基在温度为121℃条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；

（4）固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为37~40℃的条件下，培养20~24小时，制得二级种子；

（5）将得到的二级种子，按照步骤（4）进一步固体发酵得到三级种子；

（6）可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照步骤（4）进一步固体发酵扩大培养；

（7）将凝结芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度可达9.10×10⁹ CFU/g 鲜曲，芽孢浓度可达2.45×10⁹ CFU/g 鲜曲。

2.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，其特征在于：所述步骤（1）中固体种子培养基的组成为：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、25%浓度MnSO₄添加至0.2%，和琼脂粉15g。

3.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，其特征在于：所述步骤（2）中的液体种子培养基的组成为：胰化蛋白胨 10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g，和25%浓度MnSO₄添加至0.2%。

4.根据权利要求3所述的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，其特征在于：所述培养基均通过高温高压灭菌后使用。

5.根据权利要求1所述的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，其特征在于：所述步骤（3）中的固体干基为：以玉米粉和豆饼粉为基础料、KH₂PO₄ 0.3~0.5wt%、MnSO₄·H2O 0.02wt%和MgSO₄·7H₂O 0.125wt‰。

6.根据权利要求5所述的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法，其特征在于：所述基础料中玉米粉与豆饼粉的质量之比为2:1。

7.权利要求1-6任一项所述的凝结芽孢杆菌的固体发酵生产方法制备的凝结芽孢杆菌培养物用于动物养殖业中的饲料添加剂。

8.根据权利要求7所述的凝结芽孢杆菌培养物用于动物养殖业中的饲料添加剂，其特征在于：所述的凝结芽孢杆菌培养物的添加量为1~3wt%。