CN112143685A - 一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵方法及其应用 - Google Patents

一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵方法及其应用，属于微生物发酵技术领域。本发明通过研究发现，通过在凝结芽孢杆菌中加入适宜含量的可可粉进行固体发酵，可有效加快芽孢形成，提高凝结芽孢杆菌出芽率，同时提高其芽孢耐酸、耐胆盐性能；而且发酵过程也能提高可可粉中黄酮苷元含量，进一步提高制备产品的益生作用，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵 方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
微生态制剂具有调节动物肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡和提高免疫力的功效，其有益作用已被公认。凝结芽孢杆菌益生菌除具有上述优点外，还具有产乳酸、抗逆性强、耐高温高压、易储存等特性。目前凝结芽孢杆菌液体发酵已经有很多报道，发酵水平在5×108cfu/ml左右，经进一步吸附、干燥、粉碎等加工工艺，产品活菌数更低。
相对于液体发酵，固体发酵设备简单，能耗低，成本低，发酵水平不高。目前有关凝结芽孢杆菌固体发酵报道较少，普通凝结芽孢杆菌的耐受性较差，为保证微生态制剂长期储存不易失活，制备时必须要考虑热稳定性、耐酸性、耐胆盐性等一系列问题。快速大量的产生芽孢，是制备凝结芽孢杆菌制剂的关键。发明人发现，液体发酵产量高，但是凝结芽孢杆菌不易存活，固体发酵周期长。因此为了更好的发挥凝结芽孢杆菌的益生作用，有必要对其产孢条件进行优化。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵方法及其应用，本发明通过研究发现，通过在凝结芽孢杆菌中加入适宜含量的可可粉进行固体发酵，可有效加快芽孢形成，提高凝结芽孢杆菌出芽率，同时发酵过程也能提高可可粉中黄酮苷元含量，进一步提高制备产品的益生作用，因此具有良好的实际应用之价值。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供可可粉在凝结芽孢杆菌发酵中的应用。
所述发酵为固体发酵。
更具体的，所述应用至少包括：
1)提高凝结芽孢杆菌产芽孢含量；
2)提高可可粉中黄酮苷元含量。
本发明的第二个方面，提供一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵即得。
本发明的第三个方面，提供上述发酵方法在制备凝结芽孢杆菌制剂中的应用。所述凝结芽孢杆菌制剂可广泛应用于食品、药品、保健和畜牧水产行业。同时，由于其富含黄酮苷元等营养成分，使其营养保健价值得到进一步提高。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
上述技术方案提供通过在凝结芽孢杆菌中加入适宜含量的可可粉进行固体发酵，可有效加快芽孢形成，提高凝结芽孢杆菌出芽率，同时提高其芽孢耐酸、耐胆盐性能；而且发酵过程也能提高可可粉中黄酮苷元含量，进一步提高制备产品的益生作用，使得制备得到的凝结芽孢杆菌制剂可广泛应用于食品、药品、保健和畜牧水产等行业，因此具有良好的实际应用之价值。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
如前所述，液体发酵产量高，但是凝结芽孢杆菌不易存活，固体发酵周期长。因此为了更好的发挥凝结芽孢杆菌的益生作用，有必要对其产孢条件进行优化。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供可可粉在凝结芽孢杆菌发酵中的应用。
所述发酵为固体发酵。
本发明的又一具体实施方式中，所述应用至少包括：
1)提高凝结芽孢杆菌产芽孢含量；
2)提高可可粉中黄酮苷元含量。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵即得。
其中，“活化后的凝结芽孢杆菌接种至液体培养基”步骤中接种量控制为0.5～5％(w/w)，优选为2％。
所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.2～1.8％(优选为1.5％)，蛋白胨1.0～1.4％(优选为1.2％)，酵母粉0.5～1.0％(优选为0.5％)，K2HPO4 0.05～0.2％(优选为0.1％)，余量为水，pH为弱碱性，优选为7.5～8.0；更进一步的，所述液体培养基组成为：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在35～45℃条件下培养16～20h，转速控制为180～220rpm；优选为40℃培养18h，转速控制为200rpm；通过控制液体培养基及培养条件，从而使凝结芽孢杆菌积累营养并快速增殖，从而较快进入对数生长期。
本发明的又一具体实施方式中，凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时，经检测，其发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
本发明的又一具体实施方式中，所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物，所述添加物包括碳源、氮源和盐类。
本发明的又一具体实施方式中，麦麸和糠粉的混合物中，麦麸和糠粉的质量比为1～3：1，优选为1：1。
所述碳源为糖蜜，所述氮源为蛋白胨，所述盐类为K2HPO4。
本发明的又一具体实施方式中，所述碳源添加量为培养基底物的0.1～0.3％(w/w，优选为0.2％)，所述氮源添加量为培养基底物的0.1～0.3％(w/w，优选为0.2％)，所述盐类添加量为培养基底物的0.1～0.3％(w/w，优选为0.2％)。
本发明的又一具体实施方式中，麦麸、糠粉和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40-50目，优选为40目。通过进一步细化粒径，一方面为凝结芽孢杆菌生长繁殖提供营养物质，另一方面有利于凝结芽孢杆菌的粘附。
本发明的又一具体实施方式中，所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的10～30％(优选20％)接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的1～10％(优选3％)加入可可粉，控制含水量为30～60％(优选为50％)，调节初始pH为7.0～7.2。
本发明的又一具体实施方式中，所述固体发酵采用变温发酵处理，优选的，置于35-40℃培养10～15h，然后在40-45℃继续培养10～15h。采用上述变温发酵处理，一方面能够促进芽孢形成，另一方面也能提高黄酮苷元产量。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述发酵方法在制备凝结芽孢杆菌制剂中的应用。所述凝结芽孢杆菌制剂可广泛应用于食品、药品、保健和畜牧水产行业。同时，由于其富含黄酮苷元等营养成分，使其营养保健价值得到进一步提高。
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案进行说明。以下各实施例中所用的原料都可通过商购获得，所用的设备均为现有设备。
实施例1
一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌按2％(w/w)接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵。
其中，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在40℃培养18h，转速控制为200rpm；此时发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物(质量比1:1)，所述添加物为糖蜜，蛋白胨和K2HPO4。其中糖蜜添加量为培养基底物的0.2％，蛋白胨添加量为培养基底物的0.2％，所述K2HPO4添加量为培养基底物的0.2％。
麦麸、糠粉和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40目。
所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的20％接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的3％加入可可粉，控制含水量为50％，调节初始pH为7.2。
所述固体发酵采用变温发酵处理，具体为：置于40℃培养12h，然后在45℃继续培养12h。
实施例2
一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌按2％(w/w)接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵。
其中，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在38℃培养20h，转速控制为180rpm；此时发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物(质量比2:1)，所述添加物为糖蜜，蛋白胨和K2HPO4。其中糖蜜添加量为培养基底物的0.2％，蛋白胨添加量为培养基底物的0.2％，所述K2HPO4添加量为培养基底物的0.1％。
麦麸、糠粉和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40目。
所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的20％接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的3％加入可可粉，控制含水量为40％，调节初始pH为7.2。
所述固体发酵采用变温发酵处理，具体为：置于38℃培养15h，然后在43℃继续培养12h。
实施例3
一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌按2％(w/w)接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵。
其中，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在40℃培养18h，转速控制为200rpm；此时发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物(质量比1:1)，所述添加物为糖蜜，蛋白胨和K2HPO4。其中糖蜜添加量为培养基底物的0.2％，蛋白胨添加量为培养基底物的0.2％，所述K2HPO4添加量为培养基底物的0.2％。
麦麸、糠粉和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40目。
所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的30％接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的5％加入可可粉，控制含水量为50％，调节初始pH为7.2。
所述固体发酵采用变温发酵处理，具体为：置于40℃培养15h，然后在45℃继续培养10h。
实验例1
一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌按2％(w/w)接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵。
其中，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在40℃培养18h，转速控制为200rpm；此时发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物(质量比1:1)，所述添加物为糖蜜，蛋白胨和K2HPO4。其中糖蜜添加量为培养基底物的0.2％，蛋白胨添加量为培养基底物的0.2％，所述K2HPO4添加量为培养基底物的0.2％。
麦麸、糠粉和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40目。
所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的20％接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的3％加入可可粉，控制含水量为50％，调节初始pH为7.2。
所述固体发酵置于45℃培养24h。
实验例2
一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌按2％(w/w)接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵。
其中，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在40℃培养18h，转速控制为200rpm；此时发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸，所述添加物为糖蜜，蛋白胨和K2HPO4。其中糖蜜添加量为培养基底物的0.2％，蛋白胨添加量为培养基底物的0.2％，所述K2HPO4添加量为培养基底物的0.2％。
麦麸和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40目。
所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的20％接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的3％加入可可粉，控制含水量为50％，调节初始pH为7.2。
所述固体发酵采用变温发酵处理，具体为：置于40℃培养12h，然后在45℃继续培养12h。
实验例3
一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌按2％(w/w)接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵。
其中，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在40℃培养18h，转速控制为200rpm；此时发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物(质量比1:1)，所述添加物为糖蜜，蛋白胨和K2HPO4。其中糖蜜添加量为培养基底物的0.2％，蛋白胨添加量为培养基底物的0.2％，所述K2HPO4添加量为培养基底物的0.2％。
麦麸、糠粉和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为60目。
所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的20％接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的3％加入可可粉，控制含水量为50％，调节初始pH为7.2。
所述固体发酵采用变温发酵处理，具体为：置于40℃培养12h，然后在45℃继续培养12h。
实验例4
一种生产凝结芽孢杆菌芽孢的发酵方法，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌按2％(w/w)接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中进行固体发酵。
其中，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5。
液体发酵培养条件包括：在40℃培养18h，转速控制为200rpm；此时发酵菌液芽孢量可达到6×108cfu/ml。
所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物(质量比1:1)，所述添加物为糖蜜，蛋白胨和K2HPO4。其中糖蜜添加量为培养基底物的0.2％，蛋白胨添加量为培养基底物的0.2％，所述K2HPO4添加量为培养基底物的0.2％。
麦麸和糠粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40目。
所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的20％接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，控制含水量为50％，调节初始pH为7.2。
所述固体发酵采用变温发酵处理，具体为：置于40℃培养12h，然后在45℃继续培养12h。
效果验证
1、发酵产物中活菌数和芽孢率的测定
采用本发明实施例1和实验例1-3中所述方法进行发酵处理，发酵后产品采用稀释平板计数方法测定产品活菌含量，结晶紫染色后油镜观察芽孢率，以槲皮素作为黄酮苷元代表成分，使用HPLC测定槲皮素含量，测定结果见下表1。
表1
样品 活菌数(cfu/ml) 芽孢率(％)
实施例1 8.2×10<sup>9</sup> 98
实验例1 2.5×10<sup>9</sup> 91
实验例2 1.8×10<sup>9</sup> 89
实验例3 3.4×10<sup>9</sup> 86
实验例4 1.9×10<sup>9</sup> 80
由表1可知，本发明实施例1采用的发酵方法最终发酵产物中活菌数最高，同时其芽孢率也显著高于各实验例组。
2、发酵产物中黄酮苷元成分测定
采用本发明实施例1和实验例1-3中所述方法进行发酵处理，以槲皮素作为黄酮苷元代表成分，使用HPLC测定槲皮素含量，测定结果见下表2。
表2
Figure BDA0002730646730000121
由表2可知，实施例1中槲皮素含量远高于其他实验例，表明采用本申请的发酵方法，同时还能有效提高可可粉中黄酮苷元含量。
3、胆盐、pH对发酵获得的凝结芽孢杆菌芽孢的影响
由于凝结芽孢杆菌作为益生菌使用时，需要进入动物(如人体)胃肠道环境中，而一般人体的胃酸pH为2.0-3.0，且为胆盐环境，因此凝结芽孢杆菌芽孢在胃肠道中的存活和增殖必须适应强酸和胆盐环境。因此考察实施例1和实验例1-4中凝结芽孢杆菌芽孢在强酸环境和胆盐环境中的2h存活率，实验结果见表3和表4。
表3
样品 pH 2.0
实施例1 56.72％
实验例1 50.35％
实验例2 51.89％
实验例3 53.56％
实验例4 50.78％
表4
样品 0.3％(胆盐浓度)
实施例1 98.56％
实验例1 96.78％
实验例2 97.24％
实验例3 98.51％
实验例4 88.26％
由表3和表4可知，采用本申请的发酵方法，能有效提高发酵获得的凝结芽孢杆菌芽孢对强酸环境和胆盐环境均具有良好的适应能力，从而有助于其作为益生菌使用时发挥益生特性。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.可可粉在凝结芽孢杆菌发酵中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述发酵为固体发酵。
3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述应用至少包括：
1)提高凝结芽孢杆菌产芽孢含量；
2)提高可可粉中黄酮苷元含量。
4.一种使用可可粉生产高含量凝结芽孢杆菌芽孢益生菌的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：将活化后的凝结芽孢杆菌接种至液体培养基中进行扩大培养，待凝结芽孢杆菌进入对数生长初期时转而将凝结芽孢杆菌液体菌液接种至固体培养基中此时同时向固体培养基中加入可可粉进行固体发酵即得。
5.如权利要求4所述发酵方法，其特征在于，所述“活化后的凝结芽孢杆菌接种至液体培养基”步骤中接种量控制为0.5～5％(w/w)，优选为2％。
6.如权利要求4所述发酵方法，其特征在于，所述液体培养基按质量百分比，由以下组分组成：葡萄糖1.2～1.8％(优选为1.5％)，蛋白胨1.0～1.4％(优选为1.2％)，酵母粉0.5～1.0％(优选为0.5％)，K2HPO4 0.05～0.2％(优选为0.1％)，余量为水，pH为弱碱性，优选为7.5～8.0；更进一步的，所述液体培养基组成为：葡萄糖1.5％，蛋白胨1.2％，酵母粉0.5％，K2HPO4 0.1％，余量为水，pH为7.5；
液体发酵培养条件包括：在35～45℃条件下培养16～20h，转速控制为180～220rpm；优选为40℃培养18h，转速控制为200rpm。
7.如权利要求4所述发酵方法，其特征在于，所述固体培养基包括培养基底物和添加物，其中，培养基底物为麦麸和糠粉的混合物，所述添加物包括碳源、氮源和盐类；
优选的，麦麸和糠粉的混合物中，麦麸和糠粉的质量比为1～3：1，优选为1：1；
优选的，所述碳源为糖蜜，所述氮源为蛋白胨，所述盐类为K2HPO4；
优选的，所述碳源添加量为培养基底物的0.1～0.3％(w/w，优选为0.2％)，所述氮源添加量为培养基底物的0.1～0.3％(w/w，优选为0.2％)，所述盐类添加量为培养基底物的0.1～0.3％(w/w，优选为0.2％)；
优选的，麦麸、糠粉和可可粉粉粹过筛处理，所述筛目数为40-50目，优选为40目。
8.如权利要求4所述发酵方法，其特征在于，所述固体发酵具体方法为：按固体培养基质量的10～30％(优选20％)接种上述凝结芽孢杆菌液体菌液，同时按固体培养基质量的1～10％(优选3％)加入可可粉，控制含水量为30～60％(优选为50％)，调节初始pH为7.0～7.2。
9.如权利要求4所述发酵方法，其特征在于，所述固体发酵采用变温发酵处理；优选的，置于35-40℃培养10～15h，然后在40-45℃继续培养10～15h。
10.权利要求4-9任一项所述发酵方法在制备凝结芽孢杆菌制剂中的应用。
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