CN105176870A - 一种固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法，属于微生物发酵技术领域。方法包括(1)凝结芽孢杆菌的种子液培养；(2)三角瓶固体菌种的制备；(3)凝结芽孢杆菌的有氧固体发酵培养；(4)凝结芽孢杆菌的厌氧固体发酵培养等步骤、工艺。本发明利用凝结芽孢杆菌先有氧发酵后厌氧发酵的工艺，具有凝结芽孢杆菌发酵水平高，芽孢生成率高等特点。本发明可在饲用凝结芽孢杆菌生产及畜禽、水产企业中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种以凝结芽孢杆菌的有氧和厌氧固体发酵相结合的工艺来生产凝结芽孢杆菌的方法。
技术背景
凝结芽孢杆菌是一种兼性好氧微生物，在有氧和厌氧条件下均能生长，既能产乳酸又能形成芽孢的益生菌。与不能形成芽孢的乳酸菌等益生菌相比,凝结芽孢杆菌能形成芽孢，能耐热、抗逆性强；与普通的芽孢杆菌相比，凝结芽胞杆菌在动物肠道生长繁殖过程中能产生乳酸，促进肠道pH下降，能有效降低动物肠道中的有害的致病微生物的数量，这是普通芽孢杆菌所不具备的。凝结芽胞杆菌的芽孢具有抗逆性强、耐高温高热、易贮藏等特性，能顺利通过胃酸和消化酶的双重作用进入肠道。并在肠道迅速萌发生长成为营养体活菌定殖并代谢产生乳酸，从而改善其肠道菌群平衡，能显著降低动物肠道中有害微生物的数量和腹泻率，能提高日增重、饲料转化率，因此，凝结芽孢杆菌在饲料工业中具有广泛的应用前景。
由于好氧的固体发酵其芽孢形成率极低，目前市场销售的饲用凝结芽孢杆菌主要是以液体发酵的方式生产的。产品是以豆粕、玉米粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖等为培养料，或再添加一些生长刺激物和无机盐为发酵培养基生产的，在这种条件下凝结芽孢杆菌生长繁殖虽然较快且较多，芽孢形成率比好氧固体发酵稍高，但是，这些凝结芽孢杆菌主要还是以营养体的形式存在，只有30～40％的凝结芽孢杆菌得以转化，以芽孢的形式存在。如何提高芽孢率成为凝结芽孢杆菌发酵生产的关键问题，这种低芽孢率的凝结芽孢杆菌产品阻碍了它在饲料工业中的广泛应用。
发明内容
本发明目的在于，针对目前凝结芽孢杆菌生产所存在的芽孢生成率较低的缺陷，提供一种以价格低廉、材料易得的农副产品为原料，辅以合理的发酵工艺，达到提高发酵水平、提高芽孢产率的固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法。
本发明目的通过以下技术方案来实现。
一种固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法，该方法按以下步骤进行：
(1)凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans菌株编号ACCC00403)(本发明所涉及的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的菌株编号为00403，从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)引进)的种子液培养：将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入三角瓶培养基中,300ml三角瓶培养基装量为50ml，经35～38℃，180～200rpm摇床培养16～20h后成为三角瓶液体种子，备用；所述三角瓶的种子培养基为：乳糖1.0％蛋白胨1％牛肉浸膏0.5％氯化钠0.5％，调pH为7.0～7.5，121℃灭菌15min；
(2)凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备：500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份80～90∶10～20∶1～2比例配制而成的培养基20～30g，并按该固形物重量的1～1.2倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(1)种子液各2ml，混合均匀、35～38℃培养24h后，于0～4℃保存，备用；
(3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为麸皮∶米糠∶氢氧化钙按重量份80～90∶20～10∶1～2的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min；将步骤(2)每瓶三角瓶固体种子加150～300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子∶以固形物重量计的10～20公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2～3cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；
(4)凝结芽孢杆菌厌氧固体发酵培养：将经曲盘有氧发酵后的培养物转入密封的塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下培养24～36h.至凝结芽孢杆菌芽孢率达到80％以上时，停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
本发明的有益效果是：
1、本发明工艺先将凝结芽孢杆菌先制成三角瓶液体种子后，再将它们制备成三角瓶固体种子；发酵时分两步，先有氧发酵，后厌氧发酵。本发明小组意外的发现，经过先有氧发酵，后厌氧发酵可以显著提高芽孢的数量。其原理可能是是进行有氧生产发酵培养时，凝结芽孢杆菌大量生产繁殖；在厌氧发酵条件下，可促进凝结芽孢杆菌由营养体大量转化成芽孢。后续处理的低温烘干，也利于凝结芽孢杆菌在生长代谢过程中所同时产生的蛋白酶、淀粉酶等生物活性物质的保留，这些物质能与凝结芽孢杆菌同时作为添加剂加入饲料后，就更能促进畜禽对营养物质的消化吸收，从而也提高了本发明凝结芽孢杆菌产品的应用优势。
2、本发明以麸皮、米糠等易得、廉价农副产品替代了以往如牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等的发酵原料，既降低了饲用凝结芽孢杆菌的生产成本，并显著提高了凝结芽孢杆菌的芽孢数量，由已有的液体发酵每毫升芽孢数20亿左右上升到本发明的每克干物质稳定在80亿以上，克服了以往生产成本高与凝结芽孢杆菌发酵时芽孢转化率水平低的难题，可推动凝结芽孢杆菌产品在畜禽、水产饲料水产企业中的应用。
3、本发明与已有的液体发酵工艺相比，不存在废水排放污染环境的问题，有利于环境保护。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但其发明内容并不受这些内容所限止。
本发明所涉及的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的菌株编号为00403，从中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)引进。
实施例1：(固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法1)
本发明方法按如下步骤进行：
(1)凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)菌株编号为ACCC00403的种子液培养：将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入三角瓶培养基中,300ml三角瓶培养基装量为50ml，经35～38℃，180～200rpm摇床培养16～20h后成为三角瓶液体种子，备用；所述三角瓶的种子培养基为：乳糖1.0％、蛋白胨1％、牛肉浸膏0.5％、氯化钠0.5％，调pH为7.0～7.5，121℃灭菌15min；
(2)凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备：500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份80∶20∶1比例配制而成的培养基30g，并按该固形物重量的1倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(1)种子液各2ml，混合均匀、35～38℃培养24h后，于0～4℃保存，备用；
(3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为麸皮∶米糠∶氢氧化钙按重量份90∶10∶2的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min；,将步骤(2)每瓶三角瓶种子加150～300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子∶以固形物重量计的10公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2～3cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；
(4)凝结芽孢杆菌厌氧固体发酵培养：将经曲盘有氧发酵后的培养物转入密封的塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下继续培养24～36h.至凝结芽孢杆菌芽孢率达到80％以上时，停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
结果是：通过本发明的实施例子1，获得90％的凝结芽孢杆菌得以转化，以芽孢的形式存在；芽孢数量为每克干物质98亿个。
实施例2：(固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法2)
本例中，步骤(2)凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备：500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份85∶15∶1.5比例配制而成的培养基25g，并按该固形物重量的1.1倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(1)种子液各2ml，混合均匀、35～38℃培养24h后，于0～4℃保存，备用；
步骤(3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为麸皮∶米糠∶氢氧化钙按重量份85∶15∶1.5的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min；,将步骤(2)每瓶三角瓶种子加150～300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子∶以固形物重量计的15公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2～3cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；其余工艺、步骤同实施例1。
结果是：通过本发明的实施例子1，获得92％的凝结芽孢杆菌得以转化，以芽孢的形式存在；芽孢数量为每克干物质109亿个。
实施例3：(固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法3)
本例中，步骤(2)凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备：500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份90∶10∶2比例配制而成的培养基20g，并按该固形物重量的1.2倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(1)种子液各2ml，混合均匀、35～38℃培养24h后，于0～4℃保存，备用；
步骤(3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为麸皮∶米糠∶氢氧化钙按重量份80∶20∶1的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min；,将步骤(2)每瓶三角瓶种子加150～300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子∶以固形物重量计的20公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2～3cm后，于35～38℃室温条件下发酵培养20～24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；
其余工艺、步骤同实施例1。
结果是：通过本发明的实施例子1，获得86％的凝结芽孢杆菌得以转化，以芽孢的形式存在；芽孢数量为每克干物质87亿个。
Claims (1)
1.一种固体发酵生产饲用凝结芽孢杆菌的方法，其特征在于按以下步骤进行：
(1)保藏号为ACCCNo.00403菌株的凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)的种子液培养：将凝结芽孢杆菌斜面菌种接入三角瓶培养基中,300ml三角瓶培养基装量为50ml，经35～38℃，180～200rpm摇床培养16～20h后成为三角瓶液体种子，备用；所述三角瓶的种子培养基为：乳糖1.0％蛋白胨1％牛肉浸膏0.5％氯化钠0.5％，调pH为7.0～7.5，121℃灭菌15min；
(2)凝结芽孢杆菌三角瓶固体菌种的制备：500ml的三角瓶中装由麸皮、米糠和乳糖按重量份80～90∶10～20∶1～2比例配制而成的培养基20～30g，并按该固形物重量的1～1.2倍加入水、拌匀，经0.1Mpa灭菌30min后成固体培养基；再在每瓶中接入步骤(1)种子液各2ml，混合均匀、35～38℃培养24h后，于0～4℃保存，备用；
(3)凝结芽孢杆菌有氧固体发酵培养：固体发酵培养基为麸皮∶米糠∶氢氧化钙按重量份80～90∶20～10∶1～2的比例配制而成，加与固形物同等重量水，0.1Mpa灭菌30min；将步骤(2)每瓶三角瓶固体种子加150～300ml无菌水充分搅拌后，按每瓶种子∶以固形物重量计的10～20公斤固体发酵培养基比例接种，装入曲盘至发酵物料厚度为2～3cm后，于35～38℃室温条件下进行有氧发酵培养20～24h，然后立即进入下一步的厌氧固体发酵；
(4)凝结芽孢杆菌厌氧固体发酵培养：将经曲盘有氧发酵后的培养物转入密封的塑料袋中，扎紧塑料袋，尽量赶走袋中的空气，继续在35～38℃培养条件下培养24～36h；至凝结芽孢杆菌芽孢率达到80％以上时，停止发酵；在不高于50℃条件下将发酵物烘干、粉碎成40目后，检验、包装成产品。
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