CN108660096A - 一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法 - Google Patents

一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法，属于微生物培养技术领域，所述方法包括以下步骤：1)活化培养芽孢杆菌获得种子液；2)将所述种子液接种于液体发酵培养基中进行好氧发酵18～28h获得好氧发酵液；3)将所述好氧发酵液厌氧静置20～50h获得成熟芽孢；所述活化培养、好氧发酵过程中进行通气和搅拌。所述方法减少了发酵过程中通气和搅拌的开启时间，从而降低能源消耗和设备的损耗，而所得产品芽孢数及稳定性与好氧发酵无明显差异。

Description

一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，尤其涉及一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法。
背景技术
有些细菌(多为杆菌)在一定条件下，细胞质高度浓缩脱水所形成的一种抗逆性很强的球形或椭圆形的休眠体即为芽孢。一般一个细菌细胞只形成一个芽孢，有的在细胞一端，有的在细胞中部。由于芽孢是在细胞内形成的，所以也常称之为内生孢子。部分芽孢杆菌，比如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、海洋芽孢杆菌，作为生物农药、生物饲料、生物肥料得到广泛应用，具有良好的经济效益和生态效益，由于芽孢具有很强的抗逆性，考虑到产品的货架期，芽孢类产品普遍以芽孢形式保存。
芽孢的形成是一个极其复杂的过程，包括形态结构、化学成分等多方面的变化。光学显微镜和电子显微镜观察研究的结果，表明芽孢的形成在结构上主要经历以下几个阶段：①杆菌形成阶段：核物质融合成轴丝状(杆状)。②小细胞形成阶段：在细胞中央或一端，细胞膜内陷形成隔膜包围核物质，产生一个小细胞。③前孢子形成阶段：小细胞被原来的细胞膜包围，生成前孢子。前孢子实质上是一个被两层同心膜包围着的原生质体。在光学显微镜下观察未染色的活细菌，可以看到前孢子是一个清亮的、与菌体其他部分明显不同的区域。④芽孢形成阶段：前孢子再被多层膜包围，如皮层、孢子衣等，最后成为成熟的芽孢，由于细胞壁的溃溶而释放出来。
很多芽孢杆菌属于兼性厌氧菌，其培养方式大多数为液态发酵，少数为固态发酵。液态发酵普遍采用好氧发酵工艺，通过显微镜镜检来观察芽孢形成情况，芽孢数85％以上放罐，此时芽孢大部分处于成熟阶段，采用该工艺可以得到质量较好的芽孢类产品，但是培养芽孢杆菌的全程均采用好氧发酵，对发酵设备的损耗大，浪费能源。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种好氧与厌氧相结合的兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法，降低整个发酵过程的能源消耗和设备的损耗。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法，包括以下步骤：1)活化培养芽孢杆菌获得种子液；2)将所述种子液接种于液体发酵培养基中进行好氧发酵18～28h获得好氧发酵液；3)将所述好氧发酵液厌氧静置20～50h获得成熟芽孢；所述活化培养、好氧发酵过程中进行通气和搅拌。
优选的，步骤3)中所述的厌氧静置的时间为24～48h。
优选的，步骤3)中获得的成熟芽孢的芽孢数为100～250亿cfu/g。
优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌或海洋芽孢杆菌。
优选的，步骤1)中所述种子液的接种量为5～10％(体积)，所述种子液的OD600为1.5～2.0。
优选的，步骤2)中所述好氧发酵过程的通气比为1：(1.2～1.8)v/v·m。
优选的，所述好氧发酵过程的搅拌转速为220～280rpm。
优选的，所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：3～5％葡萄糖、2～3％黄豆饼粉、0.1～0.15％磷酸氢二钾，0.2～0.3％磷酸二氢钾、0.1～0.15％碳酸钙、0.03～0.05％硫酸锰和余量的水。
优选的，步骤1)中所述活化培养的通气比为1：(1～1.1)v/v·m，所述活化培养的搅拌转速为200～250rpm。
优选的，所述活化培养的时间为10～18h。
本发明的有益效果：本发明提供的兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法，缩短了好氧发酵的时间，在菌体进入芽孢形成的第三个阶段-前孢子形成时，菌体耗氧量较小，采用厌氧静置20～50h，不成熟的芽孢在厌氧情况下成长为成熟的芽孢。本发明提供的方法减少了好氧发酵过程中通气和搅拌的开启时间，从而降低能源消耗和设备的损耗，根据实施例的记载，采用本发明所述的培养方法，可降低能耗40～45％，而所得产品芽孢数及稳定性与好氧发酵无明显差异。
附图说明
图1为前孢子形成阶段显微镜镜检照片；
图2为芽孢成熟后显微镜镜检照片。
具体实施方式
本发明提供了一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法，包括以下步骤：1)活化培养芽孢杆菌获得种子液；2)将所述种子液接种于液体发酵培养基中进行好氧发酵18～28h获得好氧发酵液；3)将所述好氧发酵液厌氧静置20～50h获得成熟芽孢；所述活化培养、好氧发酵过程中进行通气和搅拌。
在本发明中所述芽孢杆菌为本领域常规的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌以其所产芽孢为产品。在本发明具体实施过程中，所述芽孢杆菌优选的以枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌或海洋芽孢杆菌为例进行说明。在本发明中所述芽孢杆菌为市售商品，在本发明具体实施过程中，所述芽孢杆菌优选的购买自中国普通微生物菌种保藏中心或生物技术公司，其中所述枯草芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC1.821；所述解淀粉芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC1.936；所述海洋芽孢杆菌购买自上海泽元海洋生物科技有限公司。在本发明中，所述购买的芽孢杆菌优选的以菌种斜面的形式保存。
在本发明中，首先活化培养所述芽孢杆菌获得种子液。在本发明中活化培养的活化培养基优选的包括以下质量百分含量的组分：葡萄糖0.3～0.8％，酵母粉0.8～1.2％，蛋白胨0.3～0.7％，氯化钠0.4～0.6％和余量的水，更优选的包括葡萄糖0.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％和余量的水。
本发明将所述芽孢杆菌接入到活化培养基中进行活化培养；所述活化培养的温度优选为35～39℃，更优选为37℃；所述活化培养的时间优选为10～18h，更优选为12～16h；本发明中所述活化培养过程中伴随通气和搅拌；所述活化培养的通气比优选为1：(1～1.1)v/v·m，更优选为1:1v/v·m；本发明所述活化培养的转速优选为200～250rpm，更优选为220～230rpm。
在本发明中，所述活化培养后获得的种子液的的OD600为1.5～2.0，更优选为1.6～1.8。
本发明在获得所述种子液后，将所述种子液接种于液体发酵培养基中进行好氧发酵18～28h获得好氧发酵液。在本发明中，所述种子液的接种量优选为5～10％(体积)，更优选为6～8％(体积)。所述液体发酵培养基优选包括以下质量百分含量的组分：3～5％葡萄糖、2～3％黄豆饼粉、0.1～0.15％磷酸氢二钾，0.2～0.3％磷酸二氢钾、0.1～0.15％碳酸钙、0.03～0.05％硫酸锰和余量的水；更优选的包括4％葡萄糖、2.5％黄豆饼粉、0.13％磷酸氢二钾，0.25％磷酸二氢钾、0.13％酸钙、0.045％硫酸锰和余量的水。在本发明中，所述液体发酵培养基中的葡萄糖可替换为淀粉，所述淀粉的质量百分含量优选的为2～3％，更优选的为2.5％。
在本发明中所述好氧发酵过程的通气比优选为1：(1.2～1.8)v/v·m，更优选为1:1.5v/v·m；所述好氧发酵过程的搅拌转速优选为220～280rpm，更优选为240～260rpm，最优选为250rpm。在本发明中，所述好氧发酵过程芽孢杆菌快速生长和繁殖。在本发明中，所述好氧发酵的时间优选为20～26h，本发明在所述好氧发酵过程中，通过显微镜镜检好氧发酵液中的芽孢杆菌来确定芽孢杆菌是否进入前孢子形成阶段。在本发明中，优选的通过美兰染色法对所述芽孢杆菌染色，然后进行显微镜镜检，如附图1和2所示，图1为前孢子形成阶段显微镜镜检照片，从图中可以看出，该阶段菌体中间为清亮的与菌体部分明显不同的区域，清亮区域两端为蓝色区域。图2为芽孢成熟后显微镜镜检照片，在该阶段，蓝色区域消失，芽孢呈清亮的椭圆状。
本发明在所述好氧发酵结束后，将所述好氧发酵液厌氧静置20～50h获得成熟芽孢。在本发明中，所述的厌氧静置的时间优选为24～48h，更优选为28～44h。在本发明中，所述厌氧静置优选的在成品桶或储罐中进行。本发明中所述芽孢杆菌在前孢子形成阶段，耗氧量极少，在厌氧静置的条件下，发酵液中固有的氧气足以维持所述芽孢杆菌的进一步成熟，获得成熟芽孢。在本发明中获得的成熟芽孢的量优选为100～250亿cfu/g，更优选的为150～220亿cfu/g；本发明中，所述成熟芽孢量的测定优选的采用平板稀释法。
在本发明中，当所述成熟芽孢为液态菌剂产品时，优选的在好氧发酵结束后，前孢子形成阶段直接灌装成品桶中，在所述成品桶中进行厌氧静置，到获得成熟芽孢可直接出售，不增加任何成本和时间。当所述成熟芽孢为粉剂产品时，优选的将所述厌氧静置获得的含有成熟芽孢的料液进行喷雾干燥获得成熟芽孢粉剂产品。当所述成熟芽孢为粉剂产品时，增加厌氧静置时间约10～24小时，其余成本不增加，两种方式得到芽孢产品的质量与常规的好氧发酵得到的芽孢产品的质量无明显差异。
下面结合实施例对本发明提供的一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
对比例1
枯草芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC1.821，菌种斜面接入葡萄糖0.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％和余量的水组成的种子培养液中，培养温度37℃，通气比1:1.0(v/v),搅拌转速220rpm，培养18h后，按8％的接种量(V/V)接入4％葡萄糖、2.5％黄豆饼粉、0.12％磷酸氢二钾，0.25％磷酸二氢钾、0.13％碳酸钙，0.04％硫酸锰和余量的水组成的发酵培养基中，培养温度37℃，通气比1:1.5(v/v),搅拌转速250r/min，培养至40h，显微镜镜检基本转为芽孢，放罐芽孢数为152亿cfu/g。
实施例1
枯草芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC1.821，菌种斜面接入葡萄糖0.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％和余量的水组成的种子培养液中，种子液按300升配料，培养温度37℃，通气比1:1.0(v/v)，搅拌转速220rpm，培养18h后，按8％的接种量(V/V)接入4％葡萄糖、2.5％黄豆饼粉、0.13％磷酸氢二钾，0.25％磷酸二氢钾、0.13％碳酸钙，0.04％硫酸锰组成的培养基中，发酵液按3000升配料，培养温度37℃，通气比1:1.5(v/v)，搅拌转速250r/min，培养至25h，镜检为芽孢两头有蓝色小点，在成品桶中厌氧放置36小时，显微镜镜检基本转为芽孢，芽孢数为156亿cfu/g。
对比例2
解淀粉芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC1.936，菌种斜面接入葡萄糖0.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％和余量的水组成的种子培养液中，种子液按300升配料，培养温度37℃，通气比1:1.0(v/v)，搅拌转速210rpm，培养12h后，按5％的接种量(V/V)接入4.3％葡萄糖、2.8％黄豆饼粉、0.14％磷酸氢二钾，0.2％磷酸二氢钾、0.1％碳酸钙，0.05％硫酸锰和余量的水组成的培养基中，发酵液按3000升配料，培养温度37℃，通气比1:2(v/v)，搅拌转速250r/min，培养至40h，显微镜镜检基本转为芽孢，放罐芽孢数为215亿cfu/g。
实施例2
解淀粉芽孢杆菌购买自中国普通微生物菌种保藏中心，编号CGMCC1.936，菌种斜面接入葡萄糖0.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％和余量的水组成的种子培养液中，种子液按300升配料，培养温度37℃，通气比1:1.0(v/v)，搅拌转速250rpm，培养12h后，按10％的接种量(V/V)接入4.3％葡萄糖、2.8％黄豆饼粉、0.14％磷酸氢二钾，0.2％磷酸二氢钾、0.1％碳酸钙，0.05％硫酸锰和余量的水组成的培养基中，发酵液按3000升配料，培养温度37℃，通气比1:2(v/v)，搅拌转速250rpm，培养至22h，镜检为芽孢两头有蓝色小点，厌氧放置在成品桶中24h，显微镜镜检基本转为芽孢，放罐芽孢数为230亿cfu/g。
对比例3
海洋芽孢杆菌由上海泽元海洋生物科技有限公司提供，菌种斜面接入葡萄糖0.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％和余量的水组成的种子培养液中，种子液按300升配料，培养温度37℃，通气比1:1.0(v/v)，搅拌转速200rpm，培养14h后，按5％的接种量(V/V)接入2.5％淀粉、2％黄豆饼粉、0.15％磷酸氢二钾，0.3％磷酸二氢钾、0.15％碳酸钙，0.05％硫酸锰和余量的水组成的培养基中，发酵液按3000升配料，培养温度37℃，通气比1:1(v/v)，搅拌转速150rpm，培养至36h，显微镜镜检基本转为芽孢，放罐芽孢数为96亿cfu/g。
实施例3
海洋芽孢杆菌由上海泽元海洋生物科技有限公司提供，菌种斜面接入葡萄糖0.5％，酵母粉1.0％，蛋白胨0.5％，氯化钠0.5％组成的种子培养液中，种子液按300升配料，培养温度37℃，通气比1:1.0(v/v)，搅拌转速200-250r/min，培养14h后，按5％的接种量(V/V)接入2.5％淀粉、2％黄豆饼粉、0.15％磷酸氢二钾，0.3％磷酸二氢钾、0.15％碳酸钙，0.05％硫酸锰和余量的水组成的培养基中，发酵液按3000升配料，培养温度37℃，通气比1:1(v/v)，搅拌转速150rpm，培养至20h，镜检为芽孢两头有蓝色小点，厌氧放置在成品桶中48h，显微镜镜检基本转为芽孢，放罐芽孢数为102亿cfu/g。
计算上述各试验的能源消耗，能源消耗采用用电量表示，每批试验用电量＝搅拌用电量(用电表测定得到)+空气压缩机用电量(按1m3空气0.1kw折算)
表1上述各实例的能源消耗对比
将上述6个试验中得到的芽孢类产品进行了长期保存试验，并在30天、90天、180天、360天测定了各个样品的芽孢数，根据该数值与初始芽孢数的比值得到存活率，具体结果如表2所示。
表2不同保存周期下样品的存活率(％)
由上述实施例可知，本发明提供的兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法，缩短了好氧发酵的时间，在菌体进入芽孢形成的第三个阶段-前孢子形成阶段，采用厌氧静置，减少了发酵过程中通气和搅拌的开启时间，从而降低能源消耗和设备的损耗，而所得产品芽孢数及稳定性与好氧发酵无明显差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种兼性厌氧芽孢杆菌的培养方法，包括以下步骤：
1)活化培养芽孢杆菌获得种子液；
2)将所述种子液接种于液体发酵培养基中进行好氧发酵18～28h获得好氧发酵液；
3)将所述好氧发酵液厌氧静置20～50h获得成熟芽孢；
所述活化培养、好氧发酵过程中进行通气和搅拌。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3)中所述的厌氧静置的时间为24～48h。
3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3)中获得的成熟芽孢的芽孢数为100～250亿cfu/g。
4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌或海洋芽孢杆菌。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)中所述种子液的接种量为5～10％(体积)，所述种子液的OD600为1.5～2.0。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)中所述好氧发酵过程的通气比为1：(1.2～1.8)v/v·m。
7.根据权利要求1或6所述的培养方法，其特征在于，所述好氧发酵过程的搅拌转速为220～280rpm。
8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述液体发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：3～5％葡萄糖、2～3％黄豆饼粉、0.1～0.15％磷酸氢二钾，0.2～0.3％磷酸二氢钾、0.1～0.15％碳酸钙、0.03～0.05％硫酸锰和余量的水。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)中所述活化培养的通气比为1：(1～1.1)v/v·m，所述活化培养的搅拌转速为200～250rpm。
10.根据权利要求1或9所述的培养方法，其特征在于，所述活化培养的时间为10～18h。
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