CN103320366B - 一株厌氧利用合成培养基高产丁二酸大肠杆菌的筛选及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株能够在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸的大肠杆菌及其筛选方法和用途，其分类命名为埃希氏菌属大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）BA308，其保藏号登记号为：CCTCC NO：M2013159。本发明采用常压低温等离子体诱变大肠杆菌，利用合成培养基平板筛选出能够在厌氧条件下快速生长的菌株，该菌株可以在厌氧条件下，利用无机氮源消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液生长并积累丁二酸。由于原始出发菌株在纯厌氧，合成培养基条件下，生长非常慢，产酸量也很低，因此该突变株BA308具有重大的社会意义和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株通过常温低压等离子诱变选育得到的在纯厌氧条件下可利用合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液生长产丁二酸的大肠杆菌，以及其在发酵工业中的应用，属于工业微生物育种及其发酵技术领域。
背景技术
丁二酸又称琥珀酸，是三羧酸循环的中间产物，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。其作为优秀的C4平台化合物，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制品之一。
丁二酸是一些厌氧和兼性厌氧微生物代谢途径中的共同中间产物，可经由多种细菌的代谢途径获得。微生物发酵法生产丁二酸因其具有利用可再生资源，固定温室气体CO2等优点而越来越引起人们的关注。而大肠杆菌由于具有培养条件简单，代谢网络较明确，易改造，易操作等特点，近年来成为生物法合成丁二酸的研究热点。目前,丁二酸工业发酵菌株的研究主要集中在产丁二酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillumsucciniciproducens)，产丁二酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，和大肠杆菌(Escherichia coli)等。其中Escherichia coli由于遗传背景清楚，基因操作简单，生长速度快，易调控以及所用培养基较为廉价，近年来成为生物法制备丁二酸的研究热点。
大肠杆菌在氧气缺乏的情况下，丁二酸主要的产生途径为葡萄糖经过糖酵解途经生成磷酸烯醇式丙酮酸，并进而代谢合成草酰乙酸、苹果酸、富马酸，最终以丁二酸的形式积累。G.N.Vemuri等人报道利用大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸的方法，原理是有氧阶段是菌体得到快速积累，然后转为厌氧使菌体产生大量的丁二酸。然而两阶段发酵过程中，需要消耗大量的营养成分用于菌体的生长，导致丁二酸总得率下降，同时由于菌体有氧生长对溶氧要求较高，搅拌及冷却等所需要较高的能耗及成本投入，因此，一步厌氧发酵产丁二酸受到越来越多的关注。然而在纯厌氧条件下，大肠杆菌生产丁二酸需要酵母粉、蛋白胨等复合氮源作为培养基成分，与无机氮源(NH4)2HPO4组成的合成培养基等相比，价格过于昂贵，为此，需要通过对生产菌株进行进一步的筛选，获得能够利用合成培养基生长合成丁二酸的生产菌株。
本申请人的在先专利中国专利申请菌株BA204（公开号CN102399738A，保藏编号CCTCCNO：M2011207），该菌株能够在厌氧条件下利用复合培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸，但在合成培养基中只能积累少量丁二酸，因此，本发明在该申请的基础上，通过菌株改良，使BA204可以在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸，在今后的丁二酸生产工业中具有长远意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于培育一株能够在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸的大肠杆菌，同时提供该大肠杆菌的筛选方法。
本发明要解决的技术问题之二在于提供所述大肠杆菌菌株的在发酵生产丁二酸中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一、本发明培育了一株能够在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA308，其保藏号登记号为：CCTCCNO：M2013159。
二、本发明所述的在纯厌氧条件下利用廉价合成培养基消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液合成丁二酸的大肠杆菌Escherichia coliBA308的筛选方法。
本发明所采用的筛选方法是将大肠杆菌的出发菌株经等离子体诱变后，筛选得到在厌氧条件下能够利用合成培养基，消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液生长的菌株，再经厌氧摇瓶发酵筛选获得可以高产丁二酸的目标菌株。
其中，所述的大肠杆菌出发菌为BA204，其保藏编号CCTCCNO：M2011207。
具体的筛选菌体步骤如下：
1）等离子诱变：将大肠杆菌出发菌株在试管中活化，37℃，200r/min，过夜培养。得到的菌液用无菌生理盐水稀释至OD600=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80～120W为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～20s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变；
2）合成培养基平板初筛：将诱变后的载片置于装有1ml的生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌液洗脱，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃厌氧培养24h。挑选生长较大，较为饱满的菌落；
3）合成培养基平板复筛：将步骤2）中筛选到的菌株在合成培养基上反复转点培养，37℃厌氧培养24h，挑选生长较大，较为饱满的菌落；
4）厌氧摇瓶发酵筛选：将步骤3）中筛选出的菌株接种到种子培养基中扩大培养，37℃，200r/min，培养6h，然后在发酵培养基中发酵，接种量为2%（v/v），37℃，200r/min，培养48h；考察步骤3）中筛选出的菌落中筛选出生长速度快，产酸量高的菌株。
在上述筛选方法中，步骤1）中所述的等离子体诱变方法中，选择100W为射频功率，20SLM为气体流量，15s为辐照时间。
本发明进一步提供了上述大肠杆菌在发酵生产丁二酸中的应用。具体利用上述大肠杆菌发酵生产丁二酸的步骤如下：
（1）平板培养：将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA308接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为35-40℃，培养时间为20-25h；
（2）种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）BA308接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量100ml，培养温度为35-40℃，200r/min，培养时间为5-8h；
（3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，100ml厌氧摇瓶装液量为30ml，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳2-3min；培养温度为35-40℃，200r/min，培养时间为45-96h。
作为本发明的一种最佳实施方式，具体应用步骤如下：
（1）平板培养：将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA308接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为24h；
（2）种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA308接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量100ml，培养温度为37℃，200r/min，培养时间为6h；
（3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，100ml厌氧摇瓶装液量为30ml，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳2min；培养温度为37℃，200r/min，培养时间为48h。
在上述发酵生产丁二酸的方法中
种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
固体合成培养基平板配方为：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，维生素B140mg·L-1，生物素4mg.L-1，琼脂15g/L，木糖10g/L，pH7。
本发明所述发酵培养基优选以木糖或玉米水解液为碳源。更优选具体配方为：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，维生素B140mg·L-1，生物素4mg.L-1，碱式碳酸镁16g/L，木糖20g/L；
或柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，碱式碳酸镁16g/L，含30g/L还原性糖的玉米芯水解液。
采用上述技术方案，本发明的有益效果在于：本发明用常压低温等离子体诱变大肠杆菌，筛选出在厌氧条件下能够利用合成培养基快速生长，并高产丁二酸的菌株。该菌株可以以无机氮为氮源，在厌氧条件下消耗木糖及含高组分木糖的木质纤维素水解液快速生长，并积累大量丁二酸；在1.5L厌氧发酵罐中，利用合成培养基，玉米芯水解液生长产酸，96h菌体密度达到了OD600=3.03，丁二酸产量为23g/L，而原始出发菌株在该条件生长极其缓慢，因此该菌株具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1为大肠杆菌的等离子体诱变存活率曲线；
图2为突变菌株BA308利用合成培养基混合糖一步厌氧发酵96h实验结果曲线图；
图3为突变菌株BA308利用合成培养基玉米芯水解液一步厌氧发酵96h实验结果曲线图。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权力要求书中所详细描述的本发明。
本发明的微生物分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA308，于2013年4月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学），保藏编号为CCTCCNO：M2013159。
实施例1
本实施例说明将大肠杆菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法
大肠杆菌出发菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：
将出发菌株大肠杆菌BA204在LB试管中活化，37℃，200r/min过夜培养；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度OD600=1.0，滴加在无菌载片上，用无菌风吹干；以氦气为放电气体，以80～120W为射频功率，以10～30SLM作为气体流量，以10～30s为辐照时间，对菌株进行等离子体诱变（优选100W为射频功率，20SLM为气体流量，15s为辐照时间）；诱变后，将载片上的菌膜用1ml的无菌生理盐水洗脱下来，涂布在合成培养基平板上，在厌氧箱中培养（存活率曲线图见图1）。
实施例2
本实例说明筛选优良大肠杆菌的方法
其中，所使用的培养基配方如下：
平板培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，维生素B140mg·L-1，生物素4mg.L-1，琼脂15g/L，木糖10g/L，pH7。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
摇瓶发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，维生素B140mg·L-1，生物素4mg.L-1，碱式碳酸镁16g/L，木糖20g/L。
筛选步骤：
1、合成培养基平板初筛将诱变后的载片置于装有1ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的菌体完全洗脱下来，稀释成不同的浓度涂布于合成培养基平板上，37℃厌氧培养24h，挑选出挑选生长速度快，较为饱满的菌落。
2、合成培养基平板复筛将筛选到的菌株在平板上反复转点培养，最终得到了菌株BA303、BA308，B311和BA323显示了较强的生长速率和生长稳定性。
3、摇瓶发酵筛选
4、将菌株BA303、BA308、B311和BA323接入种子培养基中扩大培养，37℃，200r/min，培养48h。然后接种到发酵培养基中，100ml厌氧血清瓶装液量30ml，接种量2%（v/v），充二氧化碳2min，37℃，200r/min，培养48h。检测各个菌株菌体密度和丁二酸产量如表1所示：
表1突变菌株和出发菌株的生长及产率比较
在纯厌氧条件下，出发菌株生长速度极其缓慢，而且丁二酸的积累也很低，但是经常温低压等离子诱变后得到可以在纯厌氧条件下利用合成培养基快速生长的菌株。经摇瓶发酵筛选，BA308的菌株生长速率较快，产酸较高。
实施例3
本实施例说明突变株BA308的传代稳定性
在合成培养基平板上，将突变株BA308多次转点培养，并将得到菌株分别进行发酵验证，实验结果如表2所示：
表2突变株BA308传代稳定性分析
从实验结果可知，经过8次连续传代，突变株BA308的丁二酸产量和丁二酸转化率都较为稳定，具有很好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌种。
实施例4
本实施例说明大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308发酵生产丁二酸的工艺
本实施例所述的培养基配方：
平板培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，维生素B140mg·L-1，生物素4mg.L-1，琼脂15g/L，木糖10g/L，pH7。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，碱式碳酸镁16g/L，木糖20g/L。
将大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308涂布至平板培养基，在厌氧箱中培养，培养温度37℃，培养时间24h。将平板培养的BA308接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量100ml，培养温度37℃，200r/min，培养时间6h；将种子接种到发酵培养基中，接种量2%（v/v），100ml血清瓶装液量30ml，充二氧化碳2min，发酵培养48h后检测丁二酸的产量为7.89g/L，丁二酸转化率为89%。
实施例5
本实施例说明大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308利用木糖发酵生产丁二酸的工艺
本实施例所述的培养基配方：
平板培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，维生素B140mg·L-1，生物素4mg.L-1，琼脂15g/L，木糖10g/L，pH7。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，碱式碳酸镁16g/L，木糖30g/L。
将大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308涂布至平板培养基，在厌氧箱中培养，培养温度37℃，培养时间24h。将平板培养的BA308接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量100ml，培养温度37℃，200r/min，培养时间6h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v）,3L发酵罐装液量1.5L,CO2流速为每分钟0.2L，200转每分钟37°C培养96h。
发酵结果如图2所示，发酵培养96h后检测到丁二酸的产量为23.6g/L，丁二酸转化率为84.8%，发酵过程实现了利用合成培养基同步消耗葡糖糖和木糖。
实施例6
本实施例说明大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308利用玉米芯水解液发酵生产丁二酸的工艺
本实施例所述的培养基配方：
平板培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，维生素B140mg·L-1，生物素4mg.L-1，琼脂15g/L，木糖10g/L，pH7。
种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl5g/L。
发酵培养基：柠檬酸3g·L-1，Na2HPO4·12H2O4g·L-1，KH2PO48g·L-1，(NH4)2HPO48g·L-1，NH4Cl0.2g·L-1，(NH4)2SO40.75g·L-1，MgSO4·7H2O1g·L-1，CaCl2·2H2O10.0mg·L-1，ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1，CuCl2·2H2O0.25mg·L-1，MnSO4·H2O2.5mg·L-1，CoCl2·6H2O1.75mg·L-1，H3BO30.12mg·L-1，Al2(SO4)31.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1，柠檬酸铁16.1mg·L-1，碱式碳酸镁16g/L，含30g/L还原性糖的玉米芯水解液。玉米芯水解液的主要成分如表3所示。
表3玉米芯水解液的主要成分
将大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308涂布至平板培养基，在厌氧箱中培养，培养温度37℃，培养时间24h。将平板培养的BA308接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量100ml，培养温度37℃，200r/min，培养时间6h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），,3L发酵罐装液量1.5L,CO2流速为每分钟0.2L，200转每分钟37°C培养96h。
发酵结果如图3所示，突变菌株BA308利用玉米芯水解液厌氧发酵与利用混合糖厌氧发酵没有较大的差别，乙酸是唯一的副产物。培养96h后检测到丁二酸的产量为23g/L，丁二酸转化率为76.6%。
实施例7
与实施例6相比，区别点仅在于：
将大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308涂布至平板培养基，在厌氧箱中培养，培养温度35℃，培养时间25h。将平板培养的BA308接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量100ml，培养温度35℃，200r/min，培养时间5h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），,3L发酵罐装液量1.5L,CO2流速为每分钟0.2L，200转每分钟35℃培养45h。发酵结束后检测到丁二酸的产量为15.3g/L，丁二酸转化率为83.6%。
实施例8
与实施例6相比，区别点仅在于：
将大肠埃希氏菌Escherichia coliBA308涂布至平板培养基，在厌氧箱中培养，培养温度40℃，培养时间20h。将平板培养的BA308接种到种子培养基中，500ml三角瓶装液量100ml，培养温度40℃，200r/min，培养时间8h；将种子接种到发酵培养基中，接种量10%（v/v），,3L发酵罐装液量1.5L,CO2流速为每分钟0.2L，200转每分钟37℃培养50h。培养50h后检测到丁二酸的产量为16.9g/L，丁二酸转化率为83.5%。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一株利用合成培养基纯厌氧合成丁二酸的大肠杆菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BA308，其保藏号登记号为：CCTCC NO：M 2013159。
2.权利要求1所述的大肠杆菌菌株在发酵生产丁二酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：具体应用步骤如下：
（1）平板培养：将大肠埃希氏菌Escherichia coli BA308接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为35-40℃，培养时间为20-25 h；
（2）种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌Escherichia coli BA308接种到种子培养基中，500 ml三角瓶装液量100 ml，培养温度为35-40℃，200 r/min，培养时间为5-8 h；
（3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，100 ml厌氧摇瓶装液量为30 ml，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳2-3 min；培养温度为35-40℃，200 r/min，培养时间为45-96 h。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：具体应用步骤如下：
（1）平板培养：将大肠埃希氏菌Escherichia coli BA308接种在平板培养基上厌氧培养，培养温度为37℃，培养时间为24 h；
（2）种子培养：将平板培养的大肠埃希氏菌Escherichia coli BA308接种到种子培养基中，500 ml三角瓶装液量100 ml，培养温度为37℃，200 r/min，培养时间为6 h；
（3）发酵生产丁二酸：将种子培养液接种到发酵培养基中，100 ml厌氧摇瓶装液量为30 ml，碱式碳酸镁作为pH调节剂，充二氧化碳2 min；培养温度为37℃，200 r/min，培养时间为48 h。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述种子培养基的配方包括：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L ；
固体合成培养基平板配方：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，维生素B1 40 mg·L-1，生物素4 mg.L-1，琼脂15 g/L，木糖10 g/L，pH 7。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基以木糖或玉米水解液为碳源；
配方为：柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，维生素B1 40 mg·L-1，生物素4 mg.L-1，碱式碳酸镁16 g/L，木糖20 g/L；
或柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，碱式碳酸镁16 g/L，含30 g/L还原性糖的玉米芯水解液。
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