CN104630290A - 一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，它是：在一次厌氧发酵结束时，培养基中一次性添加海藻酸钠、壳聚糖或聚乙烯亚胺中的一种或者多种，其使用总量在0.25～0.75g/L之间，絮凝回收菌体细胞，并且絮凝的细胞仍然具有活性，可以再次转入新鲜培养基中厌氧发酵生产丁二酸，有效延迟了有氧培养获得的细胞的总的产酸周期。

Description

一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法
技术领域
本发明涉及细菌发酵生产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸作为最重要的碳四平台化合物，被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，同时可作为基础原料，合成1,4-丁二醇，四氢呋喃，γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，具有巨大的市场潜力。采用生物法利用细菌发酵将二氧化碳固定，并将糖转化为丁二酸的生物技术具有潜在的经济和社会效益，包括：（1）采用生物发酵生产丁二酸的代谢路径明确，代谢产物简单，因此结晶产物丁二酸的纯度高，不含有不饱和的二元酸和单酸，因此作为聚合单体质量高，而石化法丁二酸是在一系列催化剂作用下，经氧化、加氢、还原等步骤得到的，因此产品丁二酸中会含有微量的不饱二元酸和单酸，这些杂质对于丁二酸与二元醇聚合生产聚酯是不利的。（2）生物法丁二酸生产中每生产1t丁二酸，将会有0.37t的CO2被菌体利用，有利于减少温室气体的排放。（3）生物合成丁二酸可利用可再生生物质资源，如各种植物秸秆废弃物等作为生产原料，可利用丰富的农林生物质资源，确保生物基丁二酸不受石油价格波动的影响。（4）生物法制备丁二酸可以减少石油、煤等不可再生资源的消耗，达到节能减排的效果，为我国循环经济的发展和绿色GDP增长作出重要贡献。
大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。
重组大肠杆菌在有氧条件下，菌体生长迅速，糖基原料主要通过三羧酸循环被消耗，并产生能量物质用于菌体细胞大量繁殖；在厌氧发酵条件下，菌体生长缓慢，主要通过还原三羧酸途径和乙醛酸途径积累有机酸。因此，目前利用重组大肠杆菌生长丁二酸过程中采用先有氧培养菌体后厌氧发酵产丁二酸的方法。Jiang等人在利用E.coli AFP111两阶段发酵生产丁二酸过程中，厌氧阶段丁二酸产物收率>90%，浓度>100g/L，生产速率达到1.8～2.5g/Lh（Applied andEnvironmental Microbiology.2010,76(4):1298-1300），但若考虑有氧阶段菌体培养的时间和消耗的碳源，丁二酸的的收率、浓度和生产速率均大幅下降。因此采用合适的方法回收细胞将可有效降低丁二酸的菌种成本，从而使总的生产成本得到有效控制。Ma等人在在利用E.coli AFP111两阶段发酵生产丁二酸过程中，在两阶段发酵结束时通过离心的方法回收细胞并再次转入新鲜培养基中厌氧发酵合成丁二酸（Biotechnology Letter.2010,32(10):1413-1418）。但是离心过程细胞回收率一般只能在80%左右，而且离心过程的能耗相对较高，因此采用一种温和、高效的细胞回收策略是重组大肠杆菌两阶段发酵产丁二酸过程需要解决的关键问题之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在生产丁二酸重组大肠杆菌两阶段发酵结束时，通过一种温和、高效的方法回收菌体细胞，并最终能够转入新鲜培养基中再次转化合成丁二酸。
为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其包括下列步骤：
（1）菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；
（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6～8h，至菌体密度（OD600）值在0.6～0.8之间；
（3）发酵产丁二酸过程：按3～10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌体密度（OD600）值在30～40之间，再以0.1～0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4～7.2，控制温度在35～40℃；
（4）在一次厌氧发酵结束时，培养基中一次性添加絮凝剂，其使用总量在0.25～0.75g/L之间，然后停止发酵罐的搅拌，使发酵液静置5～10分钟后，用泵从预先插入发酵罐四分之三液位处的管子将发酵液抽出四分之三发酵液，发酵液中的细胞此时绝大多数沉在发酵罐的底部，随后补入相同体积的新鲜培养基，开启搅拌继续发酵。如此循环3～5次。
上述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，步骤（1）所述的菌种是产丁二酸重组大肠杆菌。
上述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，生产丁二酸发酵菌是大肠埃希氏菌BA308。它的中国典型培养物保藏中心的保存编号为CCTCCNo:M2013159，并已申请专利，专利申请号为201310288669.0。
上述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，步骤（4）所述的絮凝剂是海藻酸钠、壳聚糖或聚乙烯亚胺中的一种或者多种混合物。
技术效果
本发明的有益效果在于产丁二酸重组大肠杆菌在两阶段发酵结束后可以采用添加絮凝剂的方法回收菌体细胞，并且絮凝的细胞仍然具有活性，可以再次转入新鲜培养基中厌氧发酵生产丁二酸，有效延迟了有氧培养获得的细胞的总的产酸周期。
附图说明
图1为海藻酸钠作为絮凝剂其添加量对絮凝效果的影响。
图2为壳聚糖作为絮凝剂其添加量对絮凝效果的影响。
图3为聚乙烯亚胺作为絮凝剂其添加量对絮凝效果的影响。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细说明，但是需要指出的是，本发明的保护范围并不受这些具体实施方式的限制，而是由权利要求书来确定。
实施例1
菌种活化与培养方法如下：（1）菌种活化：从甘油冻存管中取少量大肠埃希氏菌BA308菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6～8h，至菌体密度（OD600）值在0.6～0.8之间；（3）发酵产丁二酸过程：按3～10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌体密度（OD600）值在30～40之间，再以0.1～0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4～7.2。考虑到厌氧发酵结束时，pH在6.4，因此絮凝过程都在pH6.4条件下进行。当海藻酸钠作为絮凝剂时，其添加量对絮凝效果的影响如图1所示。由图可知，过多或者过少的絮凝剂均会使絮凝效率有所下降，因此单独添加海藻酸钠时，0.5g/L的用量是最佳的，其絮凝率可达97%。
实施例2
菌种活化与培养方法同上。考虑到厌氧发酵结束时，pH在6.4，因此絮凝过程都在pH6.4条件下进行。当壳聚糖作为絮凝剂时，其添加量对絮凝效果的影响如图2所示。由图可知，过多或者过少的絮凝剂均会使絮凝效率有所下降，因此单独添加壳聚糖时，0.625g/L的用量是最佳的，其絮凝率可达95%。
实施例3
菌种活化与培养方法同上。当聚乙烯亚胺作为絮凝剂时，其添加量对絮凝效果的影响如图3所示。由图可知，过多或者过少的絮凝剂均会使絮凝效率有所下降，因此单独添加聚乙烯亚胺时，0.25g/L的用量是最佳的，其絮凝率可达98%。
实施例4
菌种活化与培养方法同上。考虑到絮凝剂的使用弹性，考察了分别添加不同絮凝剂对絮凝效率，同时将絮凝后菌种细胞进行沉降收集再次用于发酵产丁二酸，结果见表1。由表中结果可知，单独或者配伍使用这三种絮凝剂具有较好的絮凝效果，且絮凝细胞仍然具有厌氧发酵生产丁二酸的能力。
表1絮凝剂的絮凝效果

Claims (5)

1.一种利用絮凝作用延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是包括下列步骤：（1）菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；
（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6～8h，至菌体密度（OD600）值在0.6～0.8之间；
（3）发酵产丁二酸过程：按3～10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌体密度（OD600）值在30～40之间，再以0.1～0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4～7.2，控制温度在35～40℃；
（4）在一次厌氧发酵结束时，培养基中一次性添加絮凝剂，其使用总量在0.25～0.75g/L之间，然后停止发酵罐的搅拌，使发酵液静置5～10分钟后，用泵从预先插入发酵罐四分之三液位处的管子将发酵液抽出四分之三发酵液，发酵液中的细胞此时绝大多数沉在发酵罐的底部，随后补入相同体积的新鲜培养基，开启搅拌继续发酵。
2.根据权利要求1所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：步骤（1）所述的菌种是产丁二酸重组大肠杆菌。
3.根据权利要求2所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：产丁二酸重组大肠杆菌是大肠埃希氏菌BA308。
4.根据权利要求1所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：步骤（4）所述的絮凝剂是海藻酸钠、壳聚糖或聚乙烯亚胺中的一种或者多种混合物。
5.根据权利要求1所述的延长细菌发酵生产丁二酸周期的方法，其特征是：所述的絮凝的细胞能重复循环发酵3～5次。
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