CN103320478A - 单体衣康酸的一种制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了单体衣康酸的一种制备方法,其具体步骤如下:以土曲霉(Aspergillusterreus)ZS01为出发菌株,微波诱变获得高产衣康酸菌株,采用气升式发酵罐发酵,过滤发酵液,经阴离子交换,真空浓缩,干燥,得到单体衣康酸,含量≥99.50%。本方法的衣康酸产酸达到100g/L以上,提高了衣康酸产率,减少了设备投资,节能效果明显,降低了生产成本,适用于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,提供了一种单体衣康酸的制备方法。
背景技术
衣康酸(Itaconic acid)又名亚甲基丁二酸、亚甲基琥珀酸或分解乌头酸,是一种不饱和的二元有机酸。常温下为白色晶体,无毒,在酸性、中性和弱碱性常温条件下其性质稳定,但在强碱性条件下,其3种异构体可以相互转化,易溶于水、乙醇、丙酮,微溶于氯仿、苯和乙醚,有特殊的气味,在真空下能升华。
衣康酸及其酯类是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、离子交换树脂、表面活性剂和高分子螯合剂等的良好添加剂和单体原料。它作为交联剂和乳化剂,含量在1%~5%时,生产的苯乙烯-丁二烯共聚物是质轻、易塑、绝缘、防水、抗蚀性能均好的塑料和涂料。用玻璃纤维填充则是一种高强度玻璃钢,可用于制造车,船和飞机的外壳及各种容器。含衣康酸的丙烯酸乳胶可以作为非织造纤维的粘合剂。含衣康酸单体的聚氯乙烯显示对纸张,赛璐玢和聚对苯二酸乙二醇薄膜的粘着性增强。聚丙烯腈纤维中含少量的衣康酸,就能大大改善其染色性能,使着色加深。加入多价金属氧化物(如锌和镁的硅铝酸盐或氧化物)交联的衣康酸-丙烯酸制成的牙科粘合剂具有良好的抗压性能和粘结强度,并有很好的生理适应性。衣康酸聚合物有特殊光泽,透明,适合于制造人造宝石和特种透镜,以及防水性能良好的抗化学剂和涂料等。衣康酸和丙烯酸的聚合物是一种高分子螯合物,用于作为水处理中的除垢剂,对防止碱性钙,镁垢的形成特别有效。加到海水蒸发脱盐体系中,有效成分为0.5~10mg/kg时就能有效的抑制水垢在蒸发器表面形成与附着。由衣康酸与芳香二胺生产的吡咯烷酮衍生物是润滑油的增稠剂,与其他各种胺生成的吡咯烷酮衍生物可用于洗涤剂、医药、除草剂之中。随着科学技术的发展和各个行业之间的交叉渗透,衣康酸的应用领域将会越来越多。
衣康酸自然界存在较少,最早是由Baup等人于1836年在蒸馏分解柠檬酸时发现的。1929年,日本学者木下广野首次发现了可分泌衣康酸的微生物,并命名为衣康酸曲霉(Asp.Itaconicus)。Raistrick在研究霉菌代谢产物时,发现土曲霉(Asp.terreus)也能分泌衣康酸,由此揭开了微生物发酵法生产衣康酸的研究历史。
衣康酸的生产方法主要有发酵法和化学合成法两种。化学合成法以原料的来源可以分为农产品和石油化工产品两种方法,农产品原料主要有柠檬酸、异柠檬酸、乌头酸及其酸酐等,石油化工产品原料主要有丁二酸酐、丁二酸二甲酯或丁二酸酯等。发酵法是目前工业上生产衣康酸的主要方法,国内外大多数生产厂家都采用这种方法来生产衣康酸。衣康酸的工业生产菌种主要是衣康酸曲霉(Asp.Itaconicus)和土曲霉(Asp.terreus)。所用的原料主要有葡萄糖、蔗糖以及淀粉水解糖、糖蜜等。发酵工艺主要有表面发酵工艺、深层发酵工艺以及固定化细胞生产工艺等。衣康酸表面发酵工艺具有设备简单,投资少,上马快,操作技术简单,能耗低以及原料粗放等优点,不足之处是设备占地面积大,劳动强度高,增大产量有困难,目前此方法在衣康酸的生产中已经很少使用。深层发酵工艺是现行工业上最流行、最经济的衣康酸生产方法,整个工艺过程的连续性强,自动化程度高,产品成本低。近几年,固定化全细胞生产衣康酸的研究比较活跃,使用的载体多为聚丙烯酰胺凝胶,利用包埋法固定衣康酸生产菌的全细胞,目前存在的问题是固定化细胞制备技术不过关,产率太低以及生产速度慢等,还有待于进一步的研究开发。因此,发酵技术仍然是衣康酸生产的研究点。
采用发酵法生产单体衣康酸,菌种保存过程中由于经过多次传代,衣康酸的产量都有不同程度降低,同时许多学者试图通过提高衣康酸的产酸率来降低衣康酸生产成本,例如采用固定化技术,但由于衣康酸的发酵与供氧关系甚密,采用固定化技术后,无论是发酵产酸,还是转化率均难以与以游离细胞的方式进行的工业化生产水平相比。
发明内容
本发明的目的是要寻找一种诱变方法使菌株具有较高产量,同时,采用新的生化反应器代替机械搅拌罐,以提高衣康酸产酸率。
本发明的整体技术构思是:以土曲霉为出发菌株,微波诱变获得高产衣康酸菌株,采用气升式发酵罐发酵,分离纯化单体衣康酸,其特征在于具体包括以下步骤:
1)微波诱变
土曲霉ZS01出发菌株,斜面活化,将孢子用0.85%无菌氯化钠洗下,倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中,35℃,摇床振荡活化1h,制备单孢子悬液。微波照射15s,将处理过的孢子悬液进行梯度稀释,涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落,35℃,上摇瓶发酵72h,获得衣康酸高产菌株,产酸91.3g/L;
2)种子培养
取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中,于35℃200r/min往复摇床上培养2天;
3)气升式发酵罐发酵
以10%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中,通风量1.5vvm,35℃,发酵3天,产酸103.8g/L;
4)纱布过滤
用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体;
5)活性炭脱色
添加1~2%的活性炭,吸附脱色1h;
6)过滤
将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中,去除活性炭及其它不溶物;
7)离子交换树脂
用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱,通入1.5mol/LNaOH溶液,流速为2Bv/h(Bv表示树脂床体积),时间为2h左右,再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液,上柱流速为4.0mL/min,最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂,洗脱流速为6.0mL/min,其回收率达86%以上:
8)浓缩
洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩;
9)真空干燥
真空度低至0.08Mpa,升温至50℃干燥时间1h,得到单体衣康酸,含量≥99.50%。
本发明提供的上述一种单体衣康酸的制备方法,其特点在于:
1)采用微波诱变获得高产菌株
微波在生物学上主要用于杀菌、刺激植物种子发芽生长。随着人们对微波的生物学效应及微生物特点认识的深入,微波在工业微生物诱变育种中也应用得越来越广泛,与紫外线、离子注入、抗癌药物、染料等方法处理菌种相比较,微波处理法具有操作简单、费用低、安全性高、对环境污染小、正变率较高等特点。本项目采用微波育种方法得到高产菌株,可有效提高衣康酸的产量。
2)采用气升式发酵罐发酵衣康酸
发酵采用气升式发酵罐,该设备最主要的特征是以静态搅拌装置代替了传统的动态搅拌装置,并结合了气升原理,因而对发酵工艺的改善具有下列特点:
a、与机械搅拌式发酵罐相比节电70%-80%,能耗成本降低。
b、本设备具有工作噪音小,装料系数高,基本不用维修等特点,设备投资比搅拌罐降低20%左右。
c、传热和传氧效率高,可满足好氧性微生物的发酵生产。研究适合衣康酸发酵的通风比,可提高衣康酸产酸18%。
3)采用阴离子交换树脂法提取衣康酸
对于含杂质较多的发酵液,采用浓缩结晶法易出现不合格产品,且造成衣康酸回收率无法提高,而用离子交换来完成的分离较单纯的结晶蒸发有更理想的效果。采用离子交换树脂进行衣康酸的分离提取,衣康酸的粗品回收率达到86%以上。
本发明接种高产衣康酸菌株于气升式发酵罐中进行发酵,产酸达到100g/L以上,衣康酸含量≥99.50%,提高了衣康酸产率,减少了设备投资,节能效果明显,降低了生产成本,更能适应市场需求。
附图说明
附图1是以土曲霉为原料,微波诱变获得高产衣康酸菌株,种子培养,采用气升式发酵罐发酵,过滤发酵液,经阴离子交换,真空浓缩,干燥,得到单体衣康酸的工艺流程图。
具体实施方式
提出以下实例来具体说明,以更好地理解本发明,但本发明的内容并不局限于此。
实施例1
土曲霉出发菌株,斜面活化,将孢子用0.85%无菌生理盐水洗下,倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中,35℃,摇床振荡活化1h,制备单孢子悬液。微波照射15s,将处理过的孢子悬液进行梯度稀释,涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落,35℃,上摇瓶发酵72h,获得衣康酸高产菌株,产酸91.6g/L。
取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中,于35℃200r/min往复摇床上培养2天;以10%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中,通风量1.5vvm,35℃,发酵3天,产酸104.5g/L。
用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体;添加1%的活性炭,吸附脱色1h;将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中,去除活性炭及其它不溶物;用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱,通入1.5mol/LNaOH溶液,流速为2Bv/h,时间为2h左右,再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液,上柱流速为4.0mL/min,最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂,洗脱流速为6.0mL/min,其回收率为86.6%;洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩;真空度低至0.08Mpa,升温至50℃干燥时间1h,得到单体衣康酸,含量99.68%。
实施例2
土曲霉出发菌株,斜面活化,将孢子用0.85%无菌生理盐水洗下,倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中,35℃,摇床振荡活化1h,制备单孢子悬液。微波照射10s,将处理过的孢子悬液进行梯度稀释,涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落,35℃,上摇瓶发酵72h,获得衣康酸高产菌株,产酸92.2g/L。
取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中,于35℃250r/min往复摇床上培养2天;以10%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中,通风量1.0vvm,35℃,发酵3天,产酸105.1g/L。
用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体;添加1%的活性炭,吸附脱色1h;将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中,去除活性炭及其它不溶物;用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱,通入1.5mol/LNaOH溶液,流速为2Bv/h,时间为2h左右,再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液,上柱流速为4.5mL/min,最佳洗脱条件为以1.5mol/L的NaOH溶液为洗脱剂,洗脱流速为6.0mL/min,其回收率为86.3%;洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩;真空度低至0.08Mpa,升温至50℃干燥时间1h,得到单体衣康酸,含量99.75%。
实施例3
土曲霉出发菌株,斜面活化,将孢子用0.85%无菌生理盐水洗下,倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中,35℃,摇床振荡活化1h,制备单孢子悬液。微波照射20s,将处理过的孢子悬液进行梯度稀释,涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落,35℃,上摇瓶发酵72h,获得衣康酸高产菌株,产酸91.5g/L。
取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中,于35℃200r/min往复摇床上培养2天;以12%接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中,通风量1.5vvm,35℃,发酵3天,产酸105.8g/L。
用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体;添加2%的活性炭,吸附脱色1h;将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中,去除活性炭及其它不溶物;用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱,通入1.5mol/LNaOH溶液,流速为2Bv/h,时间为2h左右,再用去离子水洗至pH8~9。通入衣康酸发酵液,上柱流速为4.5mL/min,最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂,洗脱流速为5.0mL/min,其回收率为86.9%;洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩;真空度低至0.08Mpa,升温至50℃干燥时间1h,得到单体衣康酸,含量99.73%。
Claims (9)
1.一种以土曲霉(Aspergillus terreus)ZS01为出发菌株,发酵制备单体衣康酸的方法,其特征在于:
1)微波诱变:土曲霉ZS01为出发菌株,斜面活化,将孢子用无菌生理盐水洗下,倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中,35℃,摇床振荡活化,制备单孢子悬液。微波照射,将处理过的孢子悬液进行梯度稀释,涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落,上摇瓶发酵,获得衣康酸高产菌株;
2)种子培养:取一环经活化的高产菌种,接种于500ml三角瓶中,于摇床上培养2天;
3)气升式发酵罐发酵:接种至装有发酵培养基的气升式发酵罐中发酵培养;
4)纱布过滤:用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体;
5)活性炭脱色:添加1~2%的活性炭,吸附脱色1h;
6)过滤:将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中,去除活性炭及其它不溶物;
7)离子交换树脂:用湿法将处理好的阴离子交换树脂装入玻璃交换柱,通入1.5mol/LNaOH溶液,流速为2Bv/h(Bv表示树脂床体积),时间为1~2h,再用去离子水洗至pH8~9,通入衣康酸发酵液,NaOH溶液洗脱;
8)浓缩:洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩;
9)真空干燥:真空度低至0.08Mpa,升温干燥,得到单体衣康酸,含量≥99.60%。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述的斜面培养基(g/L):玉米淀粉7~10、(NH4)2SO43~6、MgSO4·7H2O0.4、FeSO4·7H2O0.4、pH4.0~4.5、琼脂10~16;平板培养基(g/L):玉米淀粉7~10、(NH4)2SO44~8、MgSO4·7H2O0.4、LiCl0.05~0.2、溴甲酚绿0.2、pH4.0~4.5、琼脂10~16;发酵培养基(g/L):玉米淀粉8~15、NH4NO34~8、MgSO4·7H2O0.4、FeSO4·7H2O0.4、pH4.0~4.5;
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)所述的无菌生理盐水为0.85%氯化钠;摇床振荡活化温度为30~40℃,时间为0.5~1.5h;微波照射处理时间为10~25s;经筛选菌落摇瓶发酵的温度为30~40℃,时间为48~72h;
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述的种子培养基(g/L):玉米淀粉50~60、NH4NO35~8、MgSO4·7H2O2、FeSO4·7H2O0.4、pH4.0~4.5;种子培养温度为30~40℃,摇床转速为150~250r/min;
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)所述的发酵培养基(g/L):玉米淀粉120~150、NH4NO36~10、MgSO4·7H2O2、FeSO4·7H2O0.4、pH4.0~4.5;
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤3)所述的接种量为8%~10%,通风量1~1.5vvm,发酵温度30~40℃;
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤7)所述的阴离子交换树脂为D311;
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤7)所述的发酵液上柱流速为3~6mL/min,以1~2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂,洗脱流速为5~8mL/min;
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤9)所述的真空干燥温度为50℃以上,干燥时间1~2h。
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CN108251463A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-07-06 | 青岛科海生物有限公司 | 一种提高衣康酸发酵产酸量的方法 |
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PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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