CN103468752A

CN103468752A - 单体衣康酸的一种制备方法

Info

Publication number: CN103468752A
Application number: CN2013101438061A
Authority: CN
Inventors: 许波; 贺玉荣
Original assignee: BEIJING GUANHONG TECHNOLOGY GROUP Co Ltd
Current assignee: Zhongke Medical Industry Productivity and Promotion Center Co., Ltd.
Priority date: 2013-04-24
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2013-12-25

Abstract

本发明公开了单体衣康酸的一种制备方法，其具体步骤如下：以土曲霉(Aspergillus terreus)ZS01为出发菌株，微波诱变获得高产衣康酸菌株，采用气升式发酵罐发酵，过滤发酵液，经阴离子交换，真空浓缩，干燥，得到单体衣康酸，含量＝99.50％。本方法的衣康酸产酸达到100g/L以上，提高了衣康酸产率，减少了设备投资，节能效果明显，降低了生产成本，适用于大规模工业化生产。

Description

单体衣康酸的一种制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，提供了一种单体衣康酸的制备方法。

背景技术

衣康酸(Itaconic acid)又名亚甲基丁二酸、亚甲基琥珀酸或分解乌头酸，是一种不饱和的二元有机酸。常温下为白色晶体，无毒，在酸性、中性和弱碱性常温条件下其性质稳定，但在强碱性条件下，其3种异构体可以相互转化，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于氯仿、苯和乙醚，有特殊的气味，在真空下能升华。

衣康酸及其酯类是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、离子交换树脂、表面活性剂和高分子螯合剂等的良好添加剂和单体原料。它作为交联剂和乳化剂，含量在1％～5％时，生产的苯乙烯-丁二烯共聚物是质轻、易塑、绝缘、防水、抗蚀性能均好的塑料和涂料。用玻璃纤维填充则是一种高强度玻璃钢，可用于制造车，船和飞机的外壳及各种容器。含衣康酸的丙烯酸乳胶可以作为非织造纤维的粘合剂。含衣康酸单体的聚氯乙烯显示对纸张，赛璐玢和聚对苯二酸乙二醇薄膜的粘着性增强。聚丙烯腈纤维中含少量的衣康酸，就能大大改善其染色性能，使着色加深。加入多价金属氧化物(如锌和镁的硅铝酸盐或氧化物)交联的衣康酸-丙烯酸制成的牙科粘合剂具有良好的抗压性能和粘结强度，并有很好的生理适应性。衣康酸聚合物有特殊光泽，透明，适合于制造人造宝石和特种透镜，以及防水性能良好的抗化学剂和涂料等。衣康酸和丙烯酸的聚合物是一种高分子螯合物，用于作为水处理中的除垢剂，对防止碱性钙，镁垢的形成特别有效。加到海水蒸发脱盐体系中，有效成分为0.5～10mg/kg时就能有效的抑制水垢在蒸发器表面形成与附着。由衣康酸与芳香二胺生产的吡咯烷酮衍生物是润滑油的增稠剂，与其他各种胺生成的吡咯烷酮衍生物可用于洗涤剂、医药、除草剂之中。随着科学技术的发展和各个行业之间的交叉渗透，衣康酸的应用领域将会越来越多。

衣康酸自然界存在较少，最早是由Baup等人于1836年在蒸馏分解柠檬酸时发现的。1929年，日本学者木下广野首次发现了可分泌衣康酸的微生物，并命名为衣康酸曲霉(Asp.Itaconicus)。Raistrick在研究霉菌代谢产物时，发现土曲霉(Asp.terreus)也能分泌衣康酸，由此揭开了微生物发酵法生产衣康酸的研究历史。

衣康酸的生产方法主要有发酵法和化学合成法两种。化学合成法以原料的来源可以分为农产品和石油化工产品两种方法，农产品原料主要有柠檬酸、异柠檬酸、乌头酸及其酸酐等，石油化工产品原料主要有丁二酸酐、丁二酸二甲酯或丁二酸酯等。发酵法是目前工业上生产衣康酸的主要方法，国内外大多数生产厂家都采用这种方法来生产衣康酸。衣康酸的工业生产菌种主要是衣康酸曲霉(Asp.Itaconicus)和土曲霉(Asp.terreus)。所用的原料主要有葡萄糖、蔗糖以及淀粉水解糖、糖蜜等。发酵工艺主要有表面发酵工艺、深层发酵工艺以及固定化细胞生产工艺等。衣康酸表面发酵工艺具有设备简单，投资少，上马快，操作技术简单，能耗低以及原料粗放等优点，不足之处是设备占地面积大，劳动强度高，增大产量有困难，目前此方法在衣康酸的生产中已经很少使用。深层发酵工艺是现行工业上最流行、最经济的衣康酸生产方法，整个工艺过程的连续性强，自动化程度高，产品成本低。近几年，固定化全细胞生产衣康酸的研究比较活跃，使用的载体多为聚丙烯酰胺凝胶，利用包埋法固定衣康酸生产菌的全细胞，目前存在的问题是固定化细胞制备技术不过关，产率太低以及生产速度慢等，还有待于进一步的研究开发。因此，发酵技术仍然是衣康酸生产的研究点。

采用发酵法生产单体衣康酸，菌种保存过程中由于经过多次传代，衣康酸的产量都有不同程度降低，同时许多学者试图通过提高衣康酸的产酸率来降低衣康酸生产成本，例如采用固定化技术，但由于衣康酸的发酵与供氧关系甚密，采用固定化技术后，无论是发酵产酸，还是转化率均难以与以游离细胞的方式进行的工业化生产水平相比。

发明内容

本发明的目的是要寻找一种诱变方法使菌株具有较高产量，同时，采用新的生化反应器代替机械搅拌罐，以提高衣康酸产酸率。

本发明的整体技术构思是：以土曲霉为出发菌株，微波诱变获得高产衣康酸菌株，采用气升式发酵罐发酵，分离纯化单体衣康酸，其特征在于具体包括以下步骤：

1)微波诱变

土曲霉ZS01出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85％无菌氯化钠洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35℃，摇床振荡活化1h，制备单孢子悬液。微波照射15s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，35℃，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸91.3g/L；

2)种子培养

取一环经活化的高产菌种，接种于500ml三角瓶中，于35℃ 200r/min往复摇床上培养2天；

3)气升式发酵罐发酵

以10％接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.5vvm，35℃，发酵3天，产酸103.8g/L；

4)纱布过滤

用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；

5)活性炭脱色

添加1～2％的活性炭，吸附脱色1h；

6)过滤

将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；

7)离子交换树脂

用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h(Bv表示树脂床体积)，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8～9。通入衣康酸发酵液，上柱流速为4.0mL/min，最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂，洗脱流速为6.0mL/min，其回收率达86％以上；

8)浓缩

洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；

9)真空干燥

真空度低至0.08Mpa，升温至50℃干燥时间1h，得到单体衣康酸，含量＝99.50％。

本发明提供的上述一种单体衣康酸的制备方法，其特点在于：

1)采用微波诱变获得高产菌株

微波在生物学上主要用于杀菌、刺激植物种子发芽生长。随着人们对微波的生物学效应及微生物特点认识的深入，微波在工业微生物诱变育种中也应用得越来越广泛，与紫外线、离子注入、抗癌药物、染料等方法处理菌种相比较，微波处理法具有操作简单、费用低、安全性高、对环境污染小、正变率较高等特点。本项目采用微波育种方法得到高产菌株，可有效提高衣康酸的产量。

2)采用气升式发酵罐发酵衣康酸

发酵采用气升式发酵罐，该设备最主要的特征是以静态搅拌装置代替了传统的动态搅拌装置，并结合了气升原理，因而对发酵工艺的改善具有下列特点：

a、与机械搅拌式发酵罐相比节电70％-80％，能耗成本降低。

b、本设备具有工作噪音小，装料系数高，基本不用维修等特点，设备投资比搅拌罐降低20％左右。

c、传热和传氧效率高，可满足好氧性微生物的发酵生产。研究适合衣康酸发酵的通风比，可提高衣康酸产酸18％。

3)采用阴离子交换树脂法提取衣康酸

对于含杂质较多的发酵液，采用浓缩结晶法易出现不合格产品，且造成衣康酸回收率无法提高，而用离子交换来完成的分离较单纯的结晶蒸发有更理想的效果。采用离子交换树脂进行衣康酸的分离提取，衣康酸的粗品回收率达到86％以上。

本发明接种高产衣康酸菌株于气升式发酵罐中进行发酵，产酸达到100g/L以上，衣康酸含量＝99.50％，提高了衣康酸产率，减少了设备投资，节能效果明显，降低了生产成本，更能适应市场需求(注：土曲霉(Aspergillus terreus) 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2012年10月15日，保藏编号：CGMCCNo.6413)。

附图说明

附图1是以土曲霉为原料，微波诱变获得高产衣康酸菌株，种子培养，采用气升式发酵罐发酵，过滤发酵液，经阴离子交换，真空浓缩，干燥，得到单体衣康酸的工艺流程图。

具体实施方式

提出以下实例来具体说明，以更好地理解本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

土曲霉出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85％无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35℃，摇床振荡活化1h，制备单孢子悬液。微波照射15s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，35℃，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸91.6g/L。

取一环经活化的高产菌种，接种于500ml三角瓶中，于35℃200r/min往复摇床上培养2天；以10％接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.5vvm，35℃，发酵3天，产酸104.5g/L。

用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；添加1％的活性炭，吸附脱色1h；将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8～9。通入衣康酸发酵液，上柱流速为4.0mL/min，最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH 溶液为洗脱剂，洗脱流速为6.0mL/min，其回收率为86.6％；洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；真空度低至0.08Mpa，升温至50℃干燥时间1h，得到单体衣康酸，含量99.68％。

实施例2

土曲霉出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85％无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35℃，摇床振荡活化1h，制备单孢子悬液。微波照射10s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，35℃，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸92.2g/L。

取一环经活化的高产菌种，接种于500ml三角瓶中，于35℃250r/min往复摇床上培养2天；以10％接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.0vvm，35℃，发酵3天，产酸105.1g/L。

用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；添加1％的活性炭，吸附脱色1h；将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8～9。通入衣康酸发酵液，上柱流速为4.5mL/min，最佳洗脱条件为以1.5mol/L的NaOH溶液为洗脱剂，洗脱流速为6.0mL/min，其回收率为86.3％；洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；真空度低至0.08Mpa，升温至50℃干燥时间1h，得到单体衣康酸，含量99.75％。

实施例3

土曲霉出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85％无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35℃，摇床振荡活化1h，制备单孢子悬液。微波照射20s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，35℃，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸91.5g/L。

取一环经活化的高产菌种，接种于500ml三角瓶中，于35℃200r/min往复摇床上培养2天；以12％接种量转接至装有发酵培养基的气升式发酵罐中，通风量1.5vvm，35℃，发酵3天，产酸105.8g/L。

用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；添加2％的活性炭，吸附脱色1h；将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；用湿法将处理好的D311阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h，时间为2h左右，再用去离子水洗至pH8～9。通入衣康酸发酵液，上柱流速为4.5mL/min，最佳洗脱条件为以2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂，洗脱流速为5.0mL/min，其回收率为86.9％；洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；真空度低至0.08Mpa，升温至50℃干燥时间1h，得到单体衣康酸，含量99.73％。

Claims

1.一种以土曲霉(Aspergillus terreus)ZS01为出发菌株，发酵制备单体衣康酸的方法，其特征在于：

1)微波诱变：土曲霉ZS01为出发菌株，斜面活化，将孢子用无菌生理盐水洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35℃，摇床振荡活化，制备单孢子悬液。微波照射，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，上摇瓶发酵，获得衣康酸高产菌株；

2)种子培养：取一环经活化的高产菌种，接种于500ml三角瓶中，于摇床上培养2天；

3)气升式发酵罐发酵：接种至装有发酵培养基的气升式发酵罐中发酵培养；

4)纱布过滤：用洁净纱布过滤除去衣康酸发酵液中的菌丝体；

5)活性炭脱色：添加1～2％的活性炭，吸附脱色1h；

6)过滤：将经脱色处理的发酵液泵入过滤器中，去除活性炭及其它不溶物；

7)离子交换树脂：用湿法将处理好的阴离子交换树脂装入玻璃交换柱，通入1.5mol/LNaOH溶液，流速为2Bv/h(Bv表示树脂床体积)，时间为1～2h，再用去离子水洗至pH8～9，通入衣康酸发酵液，NaOH溶液洗脱；

8)浓缩：洗脱液于真空度为0.05Mpa的浓缩罐中浓缩；

9)真空干燥：真空度低至0.08Mpa，升温干燥，得到单体衣康酸，含量＝99.60％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的斜面培养基(g/L)：玉米淀粉7～10、(NH₄)₂SO₄3～6、MgSO₄·7H₂O0.4、FeSO₄·7H₂O0.4、pH4.0～4.5、琼脂10～16；平板培养基(g/L)：玉米淀粉7～10、(NH₄)₂SO₄4～8、MgSO₄·7H₂O0.4、LiCl0.05～0.2、溴甲酚绿0.2、pH4.0～4.5、琼脂10～16；发酵培养基(g/L)：玉米淀粉8～15、NH₄NO₃4～8、MgSO₄·7H₂O0.4、FeSO₄·7H₂O0.4、pH4.0～4.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的无菌生理盐水为0.85％氯化钠；摇床振荡活化温度为30～40℃，时间为0.5～1.5h；微波照射处理时间为10～25s；经筛选菌落摇瓶发酵的温度为30～40℃，时间为48～72h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的种子培养基(g/L)：玉米淀粉50～60、NH₄NO₃5～8、MgSO₄·7H₂O2、FeSO₄·7H₂O0.4、pH4.0～4.5；种子培养温度为30～40℃，摇床转速为150～250r/min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的发酵培养基(g/L)：玉米淀粉120～150、NH₄NO₃6～10、MgSO₄·7H₂O2、FeSO₄·7H₂O0.4、pH4.0～4.5。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的接种量为8％～10％，通风量1～1.5vvm，发酵温度30～40℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)所述的阴离子交换树脂为D311。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤7)所述的发酵液上柱流速为3～6mL/min，以1～2mol/L的NaOH溶液为洗脱剂，洗脱流速为5～8mL/min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤9)所述的真空干燥温度为50℃以上，干燥时间1～2h。