CN103695488B - 一种精氨酸制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种精氨酸制备方法。该方法包括下述的步骤：发酵液的制备：斜面培养、摇瓶菌种、一级种子培养、二级种子培养、后续发酵；发酵产品提取精制：发酵液预处理、二次结晶、脱色除杂处理、膜浓缩分离、干燥，包装得成品。本发明的有益效果在于，显著降低精氨酸后续提取精制液中菌体、有机物和无机物杂质含量，提高了精氨酸的得率；提高了产品质量，降低了生产成本，大大减轻了工人的劳动强度；大大减少了水、酸、碱、活性炭等固液废的排放量，减少了对环境的污染。

Description

一种精氨酸制备方法

技术领域

本发明涉及于氨基酸衍生物发酵液高效提取精制技术领域，特别是涉及一种精氨酸制备方法。

背景技术

精氨酸在医药、营养保健、食品等领域应用广泛，需求量大，被称之为氨基酸衍生物中最重要的品种之一。精氨酸是生物体尿素循环的重要中间代谢产物。在生理活性方面，除了与生长激素、胰岛素、胰高血糖素等激素诱导有关外，近年来，又作为血管舒张因子而引起关注，有望成为营养疗法的新材料。由于精氨酸不仅拥有重要的科学研究、实际生产及应用价值，同时精氨酸在生理功能重要性的作用，而且现在国内传统生产方法依旧污染严重、产能产值较低，因此，经国务院和全国人大代表批准，发酵法生产精氨酸列入国家“十一五”重点攻关科技项目。

精氨酸提取主要有两种生产工艺：即蛋白质水解提取工艺；生物发酵工艺。目前国内主要依靠蛋白质水解法来生产精氨酸，该法操作费时、收率低，且环境污染严重。国外特别是欧盟国家十分强调非动物来源性（non-animaL），使得毛发水解精氨酸产品受到很大发展限制。因此，发酵法生产精氨酸工业十分紧迫，也有良好发展前景。由于发酵液中含有大量的有机和无机杂质，发酵液产量不高的问题，提取产品纯度和收率是发酵法需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种精氨酸制备方法。该方法高效简便，且总收率显著提高。

本发明的一种精氨酸制备方法技术方案为，包括发酵液的制备和提取精制步骤，其中发酵液的制备采用黄色短杆菌MQA121。

MQA121菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，其保藏编号是：CGMCC No.8392，菌种的拉丁文名称是Brevibacterium fLavum，参据的微生物（株）：MQA121，保藏日期是2013年10月25日。

本发明所述的MQA121菌株，产酸能力强、糖酸转化率高、性能稳定。

发酵液的制备包括下述的步骤：

（1）斜面培养 ：将MQA121菌种接入灭菌的斜面培养基，在30℃培养，22小时得到斜面菌种；

（2）摇瓶菌种：将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基30℃培养18小时得到摇瓶种子液；

（3）一级种子培养：将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，30℃培养14小时得一级种液；

（4）二级种子培养：将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基30℃培养4小时得二级种子液；

（5）将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加重量百分比为1%葡萄糖和营养物质，通入无菌风，采用氨水控制pH值6.7，在30℃条件下，经过70-75小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。

步骤（1）中斜面种子培养基按重量百分比包括：葡萄糖1.0%、(NH₄)₂SO₄0.3%、KH₂PO₄0.1%、K₂HPO₄·3H₂O0.3%、MgSO₄·7H₂O0.05%、FeSO₄·7H₂O 0.002%、MnSO₄·H₂O0.002%，琼脂粉2.0%，pH6.8~7.0；

步骤（5）中营养物质包括重量百分比为3.5%的玉米浆、0.5%的 (NH₄)₂SO₄、0.1%的KH₂PO₄、0.3%的K₂HPO₄·3H₂O。

步骤（5）中氨水体积浓度为1:1。

摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基以及发酵培养基包括按重量百分比的：初糖浓度12%，尿素0.1%，玉米浆CSL3.8%,（NH₄）SO₄5.5%。

发酵产品提取精制包括以下步骤：（1）发酵液预处理；（2）絮凝、脱色、预浓缩；（3）浓缩、结晶；（4）离心得成品。

具体为：

（1）发酵液预处理 利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白；

（2）絮凝、脱色，预浓缩 将步骤（1）中得到的滤清液通过弱酸性阳离子树脂吸附产品，洗脱得到洗脱液；洗脱液通过纳滤膜设备循环脱色，纳滤清液加入活性炭脱色，经脱碳机除去活性炭得到脱色清液，脱色清液经过反渗透循环；反渗透浓缩液经过弱碱性阴离子树脂得到阴离子树脂交换液；

（3）浓缩、结晶 将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐浓缩结晶；

（4）成品 结晶液经离心分离，干燥得成品。

本发明的优点在于，本提取工艺采用陶瓷膜代替传统的板框过滤，提高了滤液质量，减少了占地面积，提高了产品收率，降低了劳动强度。

采用膜分离技术代替传统的离子交换分离技术，降低了树脂用量，提高了料液质量和透过，减少了活性炭用量，提高了产品质量。

采用膜浓缩技术代替传统的减压浓缩技术，减少了对产品的破坏，降低了能耗，提高了产品质量。

最后，通过本发明制备方法，成品对于发酵液来说总收率能达到85%以上（相对于除去菌体的净精氨酸含量计算），成品一次合格率达到100%，而传统工艺只能达到50%的总收率，一次合格率只有97%。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例１

发酵液的制备包括下述的步骤：

（1）斜面培养 ：将MQA121菌种接入灭菌的斜面培养基（配方葡萄糖1.0%、(NH₄)₂SO₄0.3%、KH₂PO₄0.1%、K₂HPO₄·3H₂O0.3%、MgSO₄·7H₂O0.05%、FeSO₄·7H₂O 0.002%、MnSO₄·H₂O0.002%，琼脂粉2.0%，pH6.8~7.0。），在30℃培养，22小时得到斜面菌种；

（2）摇瓶菌种：将培养好的斜面菌种接入摇瓶灭菌种子培养基30℃培养18小时得到摇瓶种子液；

（3）一级种子培养：将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，30℃培养14小时得一级种液；

（4）二级种子培养：将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基30℃培养4小时得二级种子液；

（5）将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加含量为1%葡萄糖和营养物质（3.5%玉米浆、(NH₄)₂SO₄0.5%、KH₂PO₄0.1%、K₂HPO₄·3H₂O0.3%），通入无菌风，采用氨水（1:1浓度）控制pH值6.7，在30℃条件下，经过70-75小时培养得到含精氨酸产品的发酵液。

摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基以及发酵培养基配方为：初糖浓度12%，尿素0.1%，玉米浆CSL3.8%,（NH₄）SO₄5.5%。

发酵产品提取精制包括以下步骤：（1）发酵液预处理；（2）絮凝、脱色、预浓缩；（3）浓缩、结晶；（4）离心得成品。

具体为：

（1）发酵液预处理 利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白。陶瓷膜孔径50-800nm，操作压差0.05-0.32MPa，膜面流速2m/s，拟稳定通量55-105L/m².h。

发酵液直接经过陶瓷膜循环过滤，过程采用循环水为循环料液降温，循环料液温度控制在70℃以下，浓缩液加入反渗透水清洗出残留的产品。过滤时间为18小时，滤清液含量为70g/L，滤液澄清、透明，预处理收率为82%。经过陶瓷膜后，清液含菌量＜0.2%。

（2）絮凝、脱色，预浓缩 将步骤（1）中得到的滤清液以树脂1倍体积/小时的流速流过弱酸性阳离子树脂D113（上海劲凯树脂有限公司）吸附产品，用2倍树脂体积的3N氨水，以1倍树脂体积的流速洗脱得到洗脱液；洗脱液通过通径为1000分子量的纳滤膜设备循环脱色，过程使用循环水降温控制循环料液温度低于60℃，用反渗透水清洗浓缩液至产品含量低于0.2%，得到透光为85%以上，含量为6%的纳滤浓缩液；纳滤清液升温至80℃，100rpm搅拌状态下加入1%活性炭脱色，保温30分钟，当清液透光率达到95%以上后经脱碳机除去活性炭得到脱色清液，脱色清液经过反渗透循环，用循环水降温控制循环料液温度低于60℃，浓缩液含量达到15%后得到反渗透浓缩液；反渗透浓缩液以1倍树脂体积/小时的流速流经经过弱碱性阴离子树脂D345（上海华震科技有限公司）得到含量为13%透光率100%的阴离子树脂交换液。

（3）浓缩、结晶 将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐，在-0.098Mpa、料液温度控制在60℃、搅拌转速为100rpm的条件下将阴离子交换液浓缩至料液含量达到80%，降低转速至60rpm，用-5℃冰水将料液降温至5℃养晶8小时。

（4）成品 将养好晶的结晶液以1200rpm转速的全自动出料离心机将结晶和母液分离，用75%的酒精清洗结晶得到湿品，湿品经双锥干燥在真空度-0.098Mpa，温度80℃条件下烘干10小时得到含水量0.5%以下的干品，干品在环境为温度18℃—25℃，湿度≤60%，无菌条件下包装得成品。

本提取工艺采用陶瓷膜代替传统的板框过滤，提高了滤液质量，减少了占地面积，提高了产品收率，降低了劳动强度。

采用膜分离技术代替传统的离子交换分离技术，降低了树脂用量，提高了料液质量和透过，减少了活性炭用量，提高了产品质量。

采用膜浓缩技术代替传统的减压浓缩技术，减少了对产品的破坏，降低了能耗，提高了产品质量。

最后，通过本发明制备方法，成品对于发酵液来说总收率能达到85%以上（相对于除去菌体的净精氨酸含量计算），成品一次合格率达到100%，而传统工艺只能达到50%的总收率，一次合格率只有97%。

陶瓷膜对精氨酸发酵液具有良好地除菌效果，除菌效果如表1所示：

表1

。

从表2可以看出本，经过本发明采用的新技术用于精氨酸的提取，一次产品合格率和提取收率比现有技术水平高。

表2

。

采用上述处理手段，成品对于发酵液来说总收率能达到85%以上（相对于除去菌体的净精氨酸含量计算），成品一次合格率达到99%。中试产品经滨州市质量技术监督局第三方检验，各项指标符合中华人民共和国国家标准，食品安全国家标准，食品添加剂，L-精氨酸GB 28306—2012标准，主要性能指标详见表3：

表3

。

Claims (6)

1.一种精氨酸制备方法，其特征在于，包括发酵液的制备和提取精制步骤，发酵液的制备包括下述的步骤：

（1）斜面培养 ：将黄色短杆菌MQA121菌种接入灭菌的斜面培养基，在30℃培养，22小时得到斜面菌种；

（2）摇瓶菌种：将培养好的斜面菌种接入摇瓶种子培养基30℃培养18小时得到摇瓶种子液；

（3）一级种子培养：将培养好的摇瓶种子液接入灭菌的一级种子培养基，30℃培养14小时得一级种液；

（4）二级种子培养：将培养好的一级种子液接入灭菌过的二级种子培养基30℃培养4小时得二级种子液；

（5）将培养好的二级种子液接种到灭菌的发酵培养基中，发酵过程补加重量百分比为1%葡萄糖和营养物质，通入无菌风，采用氨水控制pH值6.7，在30℃条件下，经过70-75小时培养得到含精氨酸产品的发酵液；

黄色短杆菌MQA121菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号是：CGMCC No.8392，菌种的拉丁文名称是Brevibacterium fLavum，保藏日期是2013年10月25日。

2. 根据权利要求1所述的一种精氨酸制备方法，其特征在于，步骤（1）中斜面培养基按重量百分比包括：葡萄糖1.0%、(NH₄)₂SO₄0.3%、KH₂PO₄0.1%、K₂HPO₄·3H₂O0.3%、MgSO₄·7H₂O0.05%、FeSO₄·7H₂O 0.002%、MnSO₄·H₂O0.002%，琼脂粉2.0%，pH6.8~7.0。

3. 根据权利要求1所述的一种精氨酸制备方法，其特征在于，步骤（5）中营养物质包括重量百分比为3.5%的玉米浆、0.5%的 (NH₄)₂SO₄、0.1%的KH₂PO₄、0.3%的K₂HPO₄·3H₂O。

4. 根据权利要求1所述的一种精氨酸制备方法，其特征在于，摇瓶种子培养基、一级种子培养基、二级种子培养基以及发酵培养基包括按重量百分比的：初糖浓度12%，尿素0.1%，玉米浆CSL3.8%,（NH₄）₂SO₄5.5%。

5. 根据权利要求1所述的一种精氨酸制备方法，其特征在于，发酵产品提取精制包括以下步骤：（1）发酵液预处理；（2）絮凝、脱色、预浓缩；（3）浓缩、结晶；（4）离心得成品。

6. 根据权利要求5所述的一种精氨酸制备方法，其特征在于，发酵产品提取精制具体为：

（1）发酵液预处理 利用陶瓷膜设备除去发酵液中的生产菌和大分子蛋白；

（2）絮凝、脱色，预浓缩 将步骤（1）中得到的滤清液通过弱酸性阳离子树脂吸附产品，洗脱得到洗脱液；洗脱液通过纳滤膜设备循环脱色，纳滤清液加入活性炭脱色，经脱碳机除去活性炭得到脱色清液，脱色清液经过反渗透循环；反渗透浓缩液经过弱碱性阴离子树脂得到阴离子树脂交换液；

（3）浓缩、结晶 将阴离子交换液吸入浓缩结晶罐浓缩结晶；

（4）成品 结晶液经离心分离，干燥得成品。