CN104745666A - 一种提取l-谷氨酰胺的新工艺 - Google Patents

Abstract

本发明属于发酵技术领域，公开了一种提取L-谷氨酰胺的新工艺，其包括发酵，微膜过滤，浓缩，结晶，离子交换，再结晶以及制备肥料等步骤。本发明工艺发酵效率高，提取工艺简单可行，环保无污染，实现了变废为宝。

Description

一种提取L-谷氨酰胺的新工艺

技术领域

本发明涉及一种提取L-谷氨酰胺的新工艺，属于发酵技术领域。

背景技术

L-谷氨酰胺(L-Gln)，又名左旋麸氨酰胺，是L-谷氨酸γ-羧基酰胺化的一种氨基酸，具有许多特殊功能，被归类为条件必需性氨基酸。临床上将它应用于治疗酒精中毒、精神萎靡及胃和十二指肠溃疡等疾病。另外它还具有增进神经机能，改善脑出血后的记忆障碍，提高机体免疫力，促进智力发育不良儿童的智力发展，防止癫痫发作等功能，目前被广泛应用于临床医药、保健食品和动物饲料工业上。

日本最早使用发酵法生产L-谷氨酰胺，1977年L-谷氨酰胺产量为100吨，到1979年为500吨，到1990年L-谷氨酰胺产量已达1200吨，年产量逐年增加。我国发酵生产L-谷氨酰胺起步较晚，由于技术落后及国外技术封锁，导致国产L-谷氨酰胺产品进不了高端市场，医药级谷氨酰胺长期依赖进口。

作为下游工程的分离纯化技术是影响其产品质量和成本的重要原因之一，在增加其应用范围方面有重要意义。目前L-谷氨酰胺提取分离工艺采用直接浓缩结晶法、冰析法、双柱法、单柱法、溶媒萃取法、制备型液相色谱分离法等。这些方法都不能有效地解决产品纯度和收率问题，并且交换树脂用量大，洗脱和再生时消耗大量酸碱，给环境造成严重污染。发酵产生大量的废液，由于发酵氨基酸废水中具有COD、SO₄ ^2-和NH₃-N含量高及酸性强等特点，此外，废水中还含有大量的还原糖、氨氮，如果任意排放不仅造成严重的环境污染，而且浪费了宝贵资源。如果将废水进行处理，投资巨大，也不符合循环经济发展要求。将发酵生产氨基酸废水综合利用起来，对于生物发酵氨基酸企业可持续发展，具有重要的战略意义。将生物发酵生产氨基酸废水加工成有机-无机复混肥料，即解决了废水的处理难，污染环境的问题，又给企业带来显著的经济效益。

发明内容

本发明为解决现有提取方法存在的问题，本发明的目的是提供一种提取L-谷氨酰胺的新工艺，该工艺纯度和收率高，生产周期短、成本低、工艺简单、节能降耗减排效果明显。

本发明是通过如下技术方案完成的：

一种提取L-谷氨酰胺的新工艺，包括如下步骤：

1)将谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌分别培养至浓度为1×10⁸个/mL的菌液，按照3∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照3％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养32小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；

2)L-谷氨酰胺发酵液采用微滤膜过滤，收集滤过液和截留物；

3)将收集的滤过液进行负压浓缩，收集浓缩液；然后将浓缩液进行一次结晶，离心收集母液和粗品；往粗品中加入去离子水进行溶解，收集得到的溶液；加入的去离子水的温度为40℃，加水量大约为粗品质量的40％；

4)将步骤3)所得溶液pH调5-6，温度25℃，先通过阳离子交换树脂过滤除去阳离子，再通过阴离子交换树脂除去阴离子，收集流出液；

5)调整步骤4)所得流出液的pH为6.5，温度为35℃，加入活性炭脱色，搅拌1小时，然后超滤膜过滤除去活性炭，收集滤液；

6)将步骤5)所得滤液加到单效浓缩锅中进行低温真空浓缩，至滤液体积的25％为止，收集浓缩液；将浓缩液进行冷却结晶，温度每小时降低10℃，降至5℃后，保持20小时；最后离心、烘干制得L-谷氨酰胺成品；

7)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得母液、腐植酸、磷酸一铵、氯化钾以及尿素混合搅拌均匀，加入到双螺杆挤出造粒机中进行造粒，然后喷洒微生物制剂，搅拌均匀，最后20℃干燥，控制水分含量为5％，包装制得复混肥。

所述发酵培养基中各组分按照质量百分比为：葡萄糖12％、玉米浆0.6％、MgSO₄·7H₂O0.3％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、NaCl 0.2％、MnSO₄ 0.001％、FeSO₄ 0.001％、V_B1 0.0001％，pH 7.0。

所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，孔径大小为5μm，微滤温度为20℃，工作压力：进压为3.3bar，出压为1bar。

所述超滤膜为PVDF，截留分子量为1000Da，孔径大小为10nm，超滤温度为20℃，工作压力：进压为6bar，出压为1bar。

所述步骤7)中，步骤2)所得截留物、步骤3)所得母液、腐植酸、磷酸一铵、氯化钾、尿素以及微生物制剂的质量比例为1∶5∶2∶1∶1∶1∶1；

所述微生物制剂按照如下方法制备而成：将粪肠球菌、藤黄微球菌以及圆褐固氮菌分别培养成浓度为1×10⁸个/ml的菌液，按照2∶1∶1的体积比混合搅拌均匀即得。

所述粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212；所述藤黄微球菌为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 49442；所述圆褐固氮菌为圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ATCC4412。

上述复混肥的使用方法可为：耕种土壤时播撒，耕种土壤深度为15-30cm，每亩地的施加量为40-60kg；也可采用其他常规施肥方式。

注，上述步骤中菌种扩大培养及制备菌剂的方法不是唯一的，本领域技术人员可以根据常识选择合适的培养基及扩大培养方法，使活菌数达到10⁸个/克，以及按照常规制备菌剂的方法制备。本发明所述菌种均可以从美国模式培养物集存库(ATCC)购买得到。

本发明的技术方案具有以下突出的优点和独创性：

1.本发明采用混合菌株发酵技术，配伍合理，大大提高了发酵效率；采用陶瓷膜微滤除去菌体及其他大分子物质后，将滤液进行浓缩、结晶、溶解处理，再过离交柱时，由于处理的料液量变少，大大节省了树脂用量；

2.本发明技术工艺在整个离交过程中，极大地减少了树脂再生所用的酸碱用量，降低了生产成本，同时缩短了生产周期，提高了生产效率；

3.本发明技术工艺活性炭脱色处理后，利用超滤膜过滤，使产品的透光度和纯度明显提高，提高了产品收率和品质。L-谷氨酰胺提取过程绿色环保，达到节能减排，可持续发展的目的。

4.本发明技术工艺将发酵生产氨基酸过程中产生的废弃物和废水有效的利用起来，制成复混肥料，不仅解决了环保问题，而且给企业带来显著经济效益。

5.本发明复混肥各原料配伍合理，结合微生物技术，使得肥料更加持久；本发明肥料中加补充了多种养料，肥效全面，增强作物抗病抗逆能力；本发明微生物制剂中各菌种之间合理配伍，协同作用强，活性高繁殖快。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1

一种提取L-谷氨酰胺的新工艺，其包括如下步骤：

1)将谷氨酸棒杆菌CCTCC NO.M205028(参见中国专利200510043704)和黄色短杆菌ATCC14067(可参见“用黄色短杆菌ATCC 14067生产L-谷氨酰胺的培养基选择”，氨基酸和微生物资源1984)分别培养至浓度为1×10⁸个/mL的菌液，按照3∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照3％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养32小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；其中发酵培养基为(质量百分比)：葡萄糖12％、玉米浆0.6％、MgSO₄·7H₂O0.3％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、NaCl 0.2％、MnSO₄ 0.001％、FeSO₄ 0.001％、V_B1 0.0001％，pH 7.0；所得L-谷氨酰胺发酵液中L-谷氨酰胺的浓度为95g/L；

2)L-谷氨酰胺发酵液采用微滤膜过滤，收集滤过液和截留物；所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，孔径大小为5μm，微滤温度为20℃，工作压力：进压为3.3bar，出压为1bar；

3)将收集的滤过液进行负压浓缩，收集浓缩液；控制负压为-0.085MPa，浓缩温度为40℃，将浓缩液浓缩至原料液的体积的60％为止；然后将浓缩液进行一次结晶，离心收集母液和粗品；往粗品中加入去离子水进行溶解，收集得到的溶液；加入去离子水的温度为40℃，加水量约为粗品质量的40％；

4)将溶液pH调6，温度25℃，先通过阳离子交换树脂过滤除去所有的阳离子，再通过阴离子交换树脂除去OH^-、SO₄ ^2-等阴离子，最后再通过阳离子交换树脂除去NH₄ ⁺等阳离子，收集流出液；所用的阳离子、阴离子和阳离子交换树脂分别为强酸型阳离子交换树脂、弱碱型阴离子交换树脂和弱酸型阳离子交换树脂；

5)调整流出液pH为6.5，温度为35℃，加入活性炭脱色，搅拌1小时，经活性炭脱色后料液透光度达到95％以上，然后超滤膜过滤除去活性炭，收集滤液；所述超滤膜为PVDF，截留分子量为1000Da，孔径大小为10nm，超滤温度为20℃，工作压力：进压为6bar，出压为1bar；

6)将步骤5)所得滤液加到单效浓缩锅中进行低温真空浓缩，至滤液体积的25％为止，收集浓缩液；将浓缩液进行冷却结晶，温度每小时降低10℃，降至5℃后，保持20小时；将下沉物离心收集晶体，烘干制得L-谷氨酰胺成品；总提取收率67％，纯度98％；

7)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得母液、腐植酸、磷酸一铵、氯化钾以及尿素混合搅拌均匀，加入到双螺杆挤出造粒机中进行造粒，然后喷洒微生物制剂，搅拌均匀，最后20℃干燥，控制水分含量为5％，包装制得复混肥。

步骤2)所得截留物、步骤3)所得母液、腐植酸、磷酸一铵、氯化钾、尿素以及微生物制剂的质量比例为1∶5∶2∶1∶1∶1∶1；

所述微生物制剂按照如下方法制备而成：将粪肠球菌、藤黄微球菌以及圆褐固氮菌分别培养成浓度为1×10⁸个/ml的菌液，按照2∶1∶1的体积比混合搅拌均匀即得；所述粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212；所述藤黄微球菌为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 49442；所述圆褐固氮菌为圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ATCC4412。

上述复混肥的使用方法可为：耕种土壤时播撒，耕种土壤深度为20cm，每亩地的施加量为50kg。

实施例2

本发明制备的复混肥的肥效试验

一、种植高粱的效肥实验：

对照组采用氮磷钾复合肥(氮16磷22钾7)，实验组采用本发明实施例1制备的复混肥，试验田的土质和种植条件完全相同，面积均为10亩；施肥量均为50kg/亩；具体试验结果见表1：

表1

注：复合肥按照2.8元/kg计算，本发明有机肥按照2.4元/kg计算，高粱按照3.0元/kg。

二、种植红薯肥效实验：

设置两个处理试验田，面积均为10亩，为对照组和实验组。对照组采用复合肥(N15-P15-K15)，实验组采用本发明实施例1制备的复混肥，试验田的土质和种植条件完全相同，施肥量均为60kg/亩。实验组亩产量为2513Kg，对照组亩产量为2391Kg，亩均可增加创收百元以上。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种提取L-谷氨酰胺的新工艺，其特征在于，所述工艺包括如下步骤：

1)将谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌分别培养至浓度为1×10⁸个/mL的菌液，按照3∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照3％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养32小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；

2)L-谷氨酰胺发酵液采用微滤膜过滤，收集滤过液和截留物；

3)将收集的滤过液进行负压浓缩，收集浓缩液；然后将浓缩液进行一次结晶，离心收集母液和粗品；往粗品中加入去离子水进行溶解，收集得到的溶液；加入的去离子水的温度为40℃，加水量大约为粗品质量的40％；

4)将步骤3)所得溶液pH调5-6，温度25℃，先通过阳离子交换树脂过滤除去阳离子，再通过阴离子交换树脂除去阴离子，收集流出液；

5)调整步骤4)所得流出液的pH为6.5，温度为35℃，加入活性炭脱色，搅拌1小时，然后超滤膜过滤除去活性炭，收集滤液；

6)将步骤5)所得滤液加到单效浓缩锅中进行低温真空浓缩，至滤液体积的25％为止，收集浓缩液；将浓缩液进行冷却结晶，温度每小时降低10℃，降至5℃后，保持20小时；最后离心、烘干制得L-谷氨酰胺成品；

7)将步骤2)所得截留物、步骤3)所得母液、腐植酸、磷酸一铵、氯化钾以及尿素混合搅拌均匀，加入到双螺杆挤出造粒机中进行造粒，然后喷洒微生物制剂，搅拌均匀，最后20℃干燥，控制水分含量为5％，包装制得复混肥。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述发酵培养基中各组分按照质量百分比为：葡萄糖12％、玉米浆0.6％、MgSO₄·7H₂O 0.3％、K₂HPO₄·3H₂O 0.2％、NaCl 0.2％、MnSO₄ 0.001％、FeSO₄ 0.001％、V_B1 0.0001％，pH 7.0。

3.根据权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，所述微滤膜为无机陶瓷膜，截留分子量为10000Da，孔径大小为5μm，微滤温度为20℃，工作压力：进压为3.3bar，出压为1bar。

4.根据权利要求3所述的工艺，其特征在于，所述超滤膜为PVDF，截留分子量为1000Da，孔径大小为10nm，超滤温度为20℃，工作压力：进压为6bar，出压为1bar。

5.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述步骤7)中，

步骤2)所得截留物、步骤3)所得母液、腐植酸、磷酸一铵、氯化钾、尿素以及微生物制剂的质量比例为1∶5∶2∶1∶1∶1∶1；

所述微生物制剂按照如下方法制备而成：将粪肠球菌、藤黄微球菌以及圆褐固氮菌分别培养成浓度为1×10⁸个/ml的菌液，按照2∶1∶1的体积比混合搅拌均匀即得。

6.根据权利要求4或5所述的工艺，其特征在于，所述粪肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)ATCC 29212；所述藤黄微球菌为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC 49442；所述圆褐固氮菌为圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ATCC 4412。