CN106148474B - 一种发酵法生产l-谷氨酰胺的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于氨基酸发酵领域，公开了一种发酵法生产L‑谷氨酰胺的方法，包括如下步骤：将种子液按照2∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养34小时，溶氧水平控制在10‑15％，得到L‑谷氨酰胺发酵液。本发明通过对发酵培养基配方以及发酵培养工艺条件等参数的优化，产品产量高，成本低廉，具有广阔的应用前景。

Description

一种发酵法生产L-谷氨酰胺的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵法生产L-谷氨酰胺的方法，属于发酵技术领域。
背景技术
L-谷氨酰胺是由L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一种氨基酸，为人体最重要的条件性必需氨基酸之一，占人体游离氨基酸总量的61％，是氨在肾脏中合成及尿素在肝脏中合成的氮的载体。L-谷氨酰胺广泛分布于人体骨骼肌、血液、胃肠道、肝、肾脏、脑中，在细胞内可以清除氨以及生物合成氨基糖、核酸和氨基酸。
L-谷氨酰胺不仅在维持小肠代谢、结构和功能，促进免疫细胞的生长，预防感染，加快伤口愈合中起着重要作用，还是胰腺生长和功能的一种重要燃料或氮的来源。L-谷氨酰胺在调节人体蛋白质的合成、抑制蛋白质的降解、刺激细胞生长、激活免疫、提高生长激素水平方面具有重要的生理作用。
L-谷氨酰胺在加热条件下具有各种香味，在食品上可作为香味添加剂。临床上主要应用于治疗胃溃疡、缓解腹泻、炎性肠道疾病和胃肠道综合症，减轻癌症病人化疗放疗的副作用。L-谷氨酰胺可调节血糖和胰岛素水平，控制高血压、心脏病及糖尿病的发展，因此L-谷氨酰胺有巨大的潜在市场。
现有技术研究L-谷氨酰胺发酵工艺主要集中在菌株改进，对于发酵培养基的改进比较少。开发成本低廉，而且产酸量高的培养基，最大限度地降低企业成本是我们研究的方向。基于上述技术问题，发展先进的酶法和化学法的水解新技术，制备高产率的碳源与可利用性氮源极有可能取得突破性进展。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术发酵培养基成本高的缺陷，提供了一种利用农作物秸秆制备聚谷氨酸的新工艺。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种发酵法生产L-谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌CCTCC NO.M205028和黄色短杆菌ATCC14067分别培养至浓度为1×108个/mL的菌液，按照2∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％(v/v)接种量接种到发酵培养基中，发酵培养34小时，溶氧水平控制在10-15％，得到L-谷氨酰胺发酵液。
所述发酵培养基由如下重量份的原料制备而得：玉米秸秆酶解液18％，鱼骨粉水解液15％，葡萄糖5％，米糠提取物2％，麦麸2％，贝壳粉0.02％，糖蜜0.01％，生物素0.0005％，其余为水。
所述玉米秸秆酶解物按照如下工艺制备而得：
将玉米秸秆投入到粉碎机中进行粉碎得到秸秆粉，然后紫外线照射15min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡2小时，随后添加占秸秆粉0.5％重量份的纤维素酶，升温至50℃，保持50℃水解12小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得；
所述鱼骨粉水解液按照如下工艺制备而得：
将鱼骨粉置于反应罐中，加入5M的盐酸，在50℃温度下搅拌水解12小时，搅拌速度为200转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.2，即得；
所述米糠提取物按照如下工艺制备而得：
将米糠用紫外线照射8min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1小时，随后添加占米糠1％重量份的α-淀粉酶，升温至70℃，保持70℃水解1小时，然后灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得。
本发明取得的有益效果主要包括：
本发明对玉米秸秆废弃物进行了粉碎和水解处理，使得氮、磷、钾、钙、镁以及纤维素多糖等得到有效利用：米糠属于农业废弃物，其含有大量的蛋白质，脂肪，糖以及维生素等，但是菌株利用率较低，通过生化处理后，提高了各养分的浸出率，菌株利用率大大提高；通过水解鱼骨粉作为发酵原料，提供了丰富的氯化铵以及氨基酸氮源，可作为微生物发酵养料。本发明通过添加玉米秸秆和米糠处理物，可部分取代葡萄糖，降低了成本，提高了企业利润。本发明通过正交试验确定合适的原料添加量和工艺参数，使得产酸量大大提高。
具体实施方式
本发明实施公开了一种发酵法生产L-谷氨酰胺的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。
实施例1
一种发酵法生产L-谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌CCTCC NO.M205028(参见中国专利200510043704)和黄色短杆菌ATCC14067(可参见“用黄色短杆菌ATCC 14067生产L一谷氨酰胺的培养基选择”，氨基酸和微生物资源)分别培养至浓度为1×108个/mL的菌液，按照2∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％体积比接种量接种到发酵培养基中，发酵培养34小时，溶氧水平控制在10-15％，得到L-谷氨酰胺发酵液；所得L-谷氨酰胺发酵液中L-谷氨酰胺的浓度为109g/L。
所述发酵培养基由如下重量份的原料制备而得：
玉米秸秆酶解液18％，鱼骨粉水解液15％，葡萄糖5％，米糠提取物2％，麦麸2％，贝壳粉0.02％，糖蜜0.01％，生物素0.0005％，其余为水；
所述玉米秸秆酶解物按照如下工艺制备而得：
将玉米秸秆投入到粉碎机中进行粉碎得到秸秆粉，然后铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射15min，紫外线强度为3000uW/cm2，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡2小时，随后添加占秸秆粉0.5％重量份的纤维素酶(酶活力为3000U/g)，升温至50℃，保持50℃水解12小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状(含水量20％重量份)，即得；
所述鱼骨粉水解液按照如下工艺制备而得：
将鱼骨粉置于反应罐中，加入占鱼骨粉两倍重量的5M的盐酸，在50℃温度下搅拌水解12小时，搅拌速度为200转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.2，即得；
所述米糠提取物按照如下工艺制备而得：
将米糠铺成1cm厚度的平层，然后紫外线照射8min，紫外线强度为1000uw/cm2，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1小时，随后添加占米糠1％重量份的α-淀粉酶(36U/mg，Sigma公司)，升温至70℃，保持70℃水解1小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得。
对照例1
发酵工艺同实施例1，其中，发酵培养基组分为：葡萄糖140g/L，玉米浆67g/L，(NH4)2SO490g/L、KH2PO410g/L、MgSO41.5g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，ZnSO4·H2O 10mg/L，CuSO4·5H2O 1mg/L，硫胺素0.4mg/L、0.6g/L糖蜜和10mg/L生物素，检测L-谷氨酰胺产酸达到91g/L。
对比例2
发酵工艺同实施例1，其中，发酵培养基组分为：葡萄糖15％、玉米浆8％、(NH4)2SO48％、MgSO4·7H2O 0.5％、K2HPO4·3H2O 0.1％、NaCl 0.01％、MnSO40.001％、FeSO40.001％、VB10.0001％，生物素0.0001％，检测L-谷氨酰胺产酸达到96g/L。
实施例2
本发明实施例1部分培养基组分对产酸量的影响：表1为不同浓度鱼骨粉水解液对L-谷氨酰胺产酸的影响。通过实验说明氮源浓度对L-谷氨酰胺产量的影响，鱼骨粉水解液不仅为菌体生长提供了氮源，也为L-谷氨酸向L-谷氨酰胺的顺利转化提供了所必需的NH4 +，但过高浓度NH4 +会抑制谷氨酰胺合成酶的活性，不利于由L-谷氨酸到L-谷氨酰胺的转化，而且影响发酵液的提取精制，降低提取收率。
表1
鱼骨粉水解液浓度％ L-谷氨酰胺(g/L)
5 92
10 99
12 105
15 109
25 102
本实施案例说明不同溶氧对L-谷氨酰胺产酸的影响，试验以三种不同方式(A.溶氧DO 0-5％；B.溶氧DO 10％-20％；C.溶氧DO 30％-40％)，其余条件相同。考察不同溶氧浓度对发酵过程中最终积累L-谷氨酰胺的影响。结果如表2可知，当发酵溶氧控制在10％-20％时，L-谷氨酰胺产酸最高。
表2
发酵结果 A B C
L-谷氨酸(g/L) 2.3 3.9 6.8
L-谷氨酰胺(g/L) 93 109 101
本发明还通过实验说明亚适量谷氨酰胺生长因子对L-谷氨酰胺产量的影响。培养基中生物素过低，总菌体量不足，L-谷氨酰胺产率低，发酵时间延长；生物素含量过高，会造成菌体量过多且细胞膜透性差；因此，控制合适的生物素含量对产酸量也有较大提高。
发酵产酸工艺最大的投入是发酵培养基的消耗，培养基成本决定着企业的收益；通过成本核验本发明实施例1的发酵培养基成本仅占对照例1培养基成本的60％左右，并且实现了变废为宝，节约了企业投入，提高了企业净收入。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种发酵法生产L-谷氨酰胺的方法，其包括如下步骤：
将谷氨酸棒杆菌CCTCC NO.M205028和黄色短杆菌ATCC14067分别培养至浓度为1×108个/mL的菌液，按照2∶1的体积比混合得到混合菌液，然后按照5％接种量接种到发酵培养基中，发酵培养34小时，得到L-谷氨酰胺发酵液；所述发酵培养基由如下重量份的原料制备而得：玉米秸秆酶解液18％，鱼骨粉水解液15％，葡萄糖5％，米糠提取物2％，麦麸2％，贝壳粉0.02％，糖蜜0.01％，生物素0.0005％，其余为水；
所述玉米秸秆酶解物按照如下工艺制备而得：将玉米秸秆粉碎得到秸秆粉，然后紫外线照射15min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡2小时，随后添加占秸秆粉0.5wt％的纤维素酶，升温至50℃，保持50℃水解12小时，然后100℃灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得；
所述鱼骨粉水解液按照如下工艺制备而得：将鱼骨粉置于反应罐中，加入5M的盐酸，在50℃温度下搅拌水解12小时，搅拌速度为200转/min，反应终止后用氨水中和残余盐酸，控制溶液的pH为7.2，即得；
所述米糠提取物按照如下工艺制备而得：将米糠用紫外线照射8min，再投入到容器中，添加两倍重量的水浸泡1小时，随后添加占米糠1wt％的α-淀粉酶，升温至70℃，保持70℃水解1小时，然后灭酶，最后将酶解液浓缩至膏状，即得。
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