CN115505607A

CN115505607A - 一种发酵生产l-谷氨酰胺的方法

Info

Publication number: CN115505607A
Application number: CN202211171808.7A
Authority: CN
Inventors: 徐庆阳; 陈志超; 刘云鹏
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2022-09-26
Filing date: 2022-09-26
Publication date: 2022-12-23

Abstract

本发明提供了一种发酵生产L‑谷氨酰胺的方法，使用NH₄ ⁺限制发酵工艺和全营养分割强迫发酵工艺，提高L‑谷氨酰胺产量和糖酸转化率，缩短发酵周期，降低副产物谷氨酸含量，从而降低L‑谷氨酰胺的提取成本，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种发酵生产L-谷氨酰胺的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是一种发酵生产L-谷氨酰胺的方法。

背景技术

L-谷氨酰胺(L-Glutamine,L-Gln)化学名为2,5-二氨基-5-氧代戊酸，分子式为C₅H₁₀N₂O₃，相对分子量为146.15，结晶形状为白色斜方晶体或结晶性粉末状，无臭，有独特的甜味。易溶于水，几乎不溶于乙醇，氯仿等多种有机溶剂，熔点为185℃，等电点为5.65，具有热不稳定性，遇热或酸碱易变性。L-谷氨酰胺含有两个氨基，一个是α-氨基，一个是末端酰胺基。由于末端酰胺基易水解，使L-谷氨酰胺不仅是生物体内嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸、核酸和其他氨基酸生物合成的必须原料之一，还是各器官间氮流动的重要载体。

近年来，随着对L-谷氨酰胺的深入研究，L-谷氨酰胺被广泛应用于医药，保健食品，饲料等领域。作为一种具有潜力的新药，L-谷氨酰胺在临床上主要应用于治疗胃肠溃疡，缓解运动疲劳，改善脑神经机能等方面。随着对L-谷氨酰胺生理作用以及应用范围的深度研究，L-谷氨酰胺的需求量和生产量都在不断增加，且药用需求量很大，具有广阔的市场前景。L-谷氨酰胺的工业生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法，其中发酵法生产L-谷氨酰胺是目前使用的主要方法。

常见的L-谷氨酰胺发酵培养基添加大量的(NH₄)₂SO₄，导致NH₄ ⁺浓度过高，导致发酵过程中菌体活力大大下降，抑制L-谷氨酰胺合成酶活性，产酸效率下降，副产物谷氨酸生成较多，造成提取困难、成本偏高等问题。

此外，目前的发酵法生产L-谷氨酰胺，由于发酵初期的培养基浓度过高，产生对菌体过高的渗透压，使菌体生长缓慢,发酵周期延长。发酵中后期，发酵液中营养物质消耗不均，营养物质不平衡，可能缺少或积累某种营养，导致菌体活力下降，生长变慢过早衰亡，产酸效率低，副产物也会随之增加，发酵周期延长，经济效益降低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种发酵生产L-谷氨酰胺的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种发酵生产L-谷氨酰胺的方法，具体步骤如下：

(1)将谷氨酸棒杆菌接种到斜面培养基活化，接入摇瓶利用种子培养基进行一级种子培养；

(2)一级种子液接入发酵罐内进行二级种子培养以及发酵培养，发酵过程中NH₄ ⁺限制发酵工艺、全营养分割强迫发酵工艺。

优选的，上述发酵生产L-谷氨酰胺的方法，具体步骤如下：

(1)将谷氨酸棒杆菌T-6接种到斜面培养基活化，活化条件：32℃，12h；

(2)将斜面活化的菌种接入摇瓶进行一级种子培养，34℃，pH7.0，220rmp/min，摇床培养10h，一级种子培养基体系100mL；一级种子液全部接入发酵罐内进行二级种子培养，34℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD₆₀₀达到40，二级种子培养基体系2L；

(3)发酵初始培养基用水定容至1.3L(发酵初始体系为2L，包括600mL二级种子液，100mL 60％葡萄糖和1.3L发酵初始培养基)；发酵流加培养基定容300mL(发酵流加培养基体系为300mL，装入瓶中待流加)；当二级种子培养完成，将二级种子液放出至剩余600mL，加入提前配制并定容好的1.3L发酵初始培养基和100mL浓度为80％的葡萄糖(定容至2.0L)；流加培养基从发酵4h开始流加至发酵结束前8h；

(4)将300g的(NH₄)₂SO₄溶于600mL水中，从发酵3h开始均匀流加至发酵结束；

(5)种子培养基中添加的尿素用来调节种子培养阶段和发酵培养初期的pH，1.5g/L的尿素可以使种子培养阶段全程pH维持在7.0-7.2，并在发酵培养初期将pH维持在7.0-7.2直至pH开始自然下降(大约发酵3h左右)，开始使用25％的氨水调节发酵培养过程中的pH值维持在6.4；

(6)发酵过程中流加补料的葡萄糖中加入3g/L甜菜碱，各0.5mg/L的V_{B1、3、5、12}、2g/L氯化胆碱、赤霉素10mg/L、磷酸吡哆醛5mg/L。

优选的，上述发酵生产L-谷氨酰胺的方法，所述斜面培养基为：牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉25g/L。

优选的，上述发酵生产L-谷氨酰胺的方法，所述种子培养基为：葡萄糖30g/L、豆浓40mL/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.9g/L、V_H 20μg/L、FeSO₄ 5mg/L、MnSO₄ 5mg/L、Vb_1,3,5,12各0.5mg/L、尿素1.5g/L。

优选的，上述发酵生产L-谷氨酰胺的方法，所述发酵初始培养基为：葡萄糖30g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、Vb_1,3,5,12各0.25mg/L、豆浓50mL/L、MnSO₄ 10mg/L、FeSO₄ 10mg/L、ZnSO₄5mg/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L、V_H 4μg/L、糖蜜1.1g/L。

优选的，上述发酵生产L-谷氨酰胺的方法，所述发酵流加培养基为：葡萄糖30g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、Vb_1,3,5,12各0.25mg/L、MnSO₄ 10mg/L、FeSO₄ 10mg/L、ZnSO₄ 5mg/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L、糖蜜1.1g/L。

优选的，上述发酵生产L-谷氨酰胺的方法，所述谷氨酸棒杆菌T-6是通过菌株CGMCC No.1.16145(菌株TCCC 11822)经过基因改造得到的高产L-谷氨酰胺菌株，可通过天津科技大学代谢工程实验室购买获得。

有益效果：

上述发酵生产L-谷氨酰胺的方法，通过NH₄ ⁺限制发酵工艺和全营养分割强迫发酵方法协同生产L-谷氨酰胺，流加葡萄糖溶液中含有丰富的微量元素以及能够增强能量代谢的赤霉素和能够提高转氨作用的磷酸吡哆醛，使L-谷氨酰胺的产量达到93.4g/L，副产物谷氨酸达到5.5g/L，转化率达到41.4％。

使用(NH₄)₂SO₄流加方式，在发酵3h开始流加(NH₄)₂SO₄，发酵前3h的NH₄ ⁺浓度维持在很低水平，处于氮饥饿状态，发酵过程中通过均匀流加(NH₄)₂SO₄，维持NH₄ ⁺浓度在生成L-谷氨酰胺的最适浓度，从而使菌体量有显著提高，L-谷氨酰胺合成酶活性相比于传统发酵工艺大大提高，L-谷氨酰胺产量得到提高，副产物谷氨酸含量降低。

本发明采用全营养分割强迫发酵工艺，解决了中后期菌体生长过程中营养不足和不平衡的缺点，发酵过程中平衡的营养补充会使代谢流更多地流向L-谷氨酰胺，从而提高菌体活力，提高发酵液中菌体密度，将发酵周期从40h缩短至36h，降低成本。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。

1.L-谷氨酰胺含量检测

发酵液预处理：将取出的发酵液13000r/min离心2min，取上清。

衍生处理：在ep管中加入200μL衍生缓冲剂，10μL样品，300μL衍生剂，混匀，65℃水浴一小时，取出并降至室温，加入690μL定容缓冲液，混匀，过膜打入液相瓶。

发酵液中L-谷氨酰胺浓度用高效液相色谱法测定。采用AgilentC18(15mm×4.6mm，3.5μm)色谱柱，衍生剂为2,4-二硝基氟苯，柱前衍生，流动相为50％的乙腈、4.1g/L的醋酸钠溶液，柱温33℃，流速1mL/min，检测波长360nm。

2.L-谷氨酰胺合成酶活力检测

谷氨酰胺合成酶活性的测定使用谷氨酰胺合成酶试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)。GS在ATP和Mg₂ ⁺存在下，催化NH₄ ⁺和谷氨酸合成谷氨酰胺；谷氨酰胺进一步转化为γ-谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与铁形成的络合物在540nm处有最大吸收峰，使用酶标仪测定。酶活单位定义为：每g组织在每mL反应体系中每小时产生1μmolγ-谷氨酰基异羟肟酸定义为一个酶活力单位。

3.涉及的菌株

下述实施例中采用的菌株为T-6，所述谷氨酸棒杆菌T-6是通过菌株CGMCCNo.1.16145经过基因改造得到的高产L-谷氨酰胺菌株，可通过天津科技大学代谢工程实验室购买获得。

实施例1

一种发酵生产L-谷氨酰胺的方法，涉及培养基如下：

斜面培养基为：牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄0.5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉25g/L。

种子培养基为：葡萄糖30g/L、豆浓40mL/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.9g/L，V_h 20μg/L，FeSO₄ 5mg/L，MnSO₄ 5mg/L，Vb_1,3,5,12各0.5mg/L。

发酵培养基为：葡萄糖30g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，Vb_1,3,5,12各0.25mg/L，豆浓50mL/L，MnSO₄ 10mg/L，FeSO₄ 10mg/L，ZnSO₄ 5mg/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，V_H 4μg/L，糖蜜1.1g/L，(NH₄)₂SO₄ 150g/L。

发酵方法的具体步骤如下：

(1)将谷氨酸棒杆菌T-6接种到斜面培养基活化，32℃，12h。

(2)将斜面活化的菌种接入1L摇瓶进行一级种子培养，32℃，pH7.0，220rmp/min，摇床培养10h，一级种子培养基体系100mL。

(3)一级种子液全部接入5L发酵罐内进行二级种子培养，34℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD₆₀₀达到40，二级种子培养基体系2L。

(4)发酵全程控制溶氧30％-50％，使用25％的氨水调节pH保持在7.0，发酵周期40h，L-谷氨酰胺产量72.5g/L，谷氨酸16.3g/L，糖酸转化率37.1％。

实施例2

斜面培养基和种子培养及同实施例1。

发酵培养基为：K₂HPO₄·3H₂O 3g/L，Vb_1,3,5,12各0.25mg/L，豆浓50mL/L，MnSO₄10mg/L，FeSO₄10 mg/L，ZnSO₄5 mg/L，MgSO₄·7H₂O2g/L，V_H 4μg/L，糖蜜1.1g/L。

(1)将谷氨酸棒杆菌T-6接种到斜面培养基活化，32℃，12h。

(2)将斜面活化的菌种接入1L摇瓶进行一级种子培养，34℃，pH7.0，220rmp/min，摇床培养10h，一级种子培养基体系100mL。一级种子液全部接入5L发酵罐内进行二级种子培养，34℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD₆₀₀达到40，二级种子培养基体系2L。

(3)将300g的(NH₄)₂SO₄溶于600mL水中，从发酵3h开始均匀流加至发酵结束。

(4)发酵全程控制溶氧30％-50％，使用25％氨水调节pH保持在7.0，发酵周期40h，L-谷氨酰胺产量82.7g/L，谷氨酸10.5g/L，糖酸转化率39.2％。

实施例3

斜面培养基和种子培养及同实施例1；

发酵初始培养基为：葡萄糖30g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、Vb_1,3,5,12各0.25mg/L、豆浓50mL/L、MnSO₄ 10mg/L、FeSO₄ 10mg/L、ZnSO₄ 5mg/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L、V_H 4μg/L、糖蜜1.1g/L；

发酵流加培养基为：葡萄糖30g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、Vb_1,3,5,12各0.25mg/L、MnSO₄10mg/L、FeSO₄ 10mg/L、ZnSO₄ 5mg/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L、糖蜜1.1g/L。

(1)将谷氨酸棒杆菌T-6接种到斜面培养基活化，32℃，12h。

(4)将300g的(NH₄)₂SO₄溶于600mL水中，从发酵3h开始均匀流加至发酵结束。

(5)发酵全程控制溶氧30％-50％，使用25％的氨水调节pH保持在7.0，发酵周期36h，L-谷氨酰胺产量86.4g/L,谷氨酸8.1g/L，糖酸转化率40.8％。

实施例4

涉及斜面培养基同实施例1，发酵初始培养基和发酵流加培养基同实施例3；

种子培养基为：葡萄糖30g/L、豆浓40mL/L，K₂HPO₄·3H₂O 2.5g/L，MgSO₄·7H₂O0.9g/L，V_H 20μg/L，FeSO₄ 5mg/L，MnSO₄ 5mg/L，Vb_1,3,5,12各0.5mg/L，尿素1.5g/L。

(1)将谷氨酸棒杆菌T-6接种到斜面培养基活化，32℃，12h。

(5)发酵全程控制溶氧30％-50％，种子培养基中添加的尿素用来调节种子培养阶段和发酵培养初期的pH，1.5g/L的尿素可以使种子培养阶段全程pH维持在7.0-7.2，并在发酵培养初期将pH维持在7.0-7.2直至发酵3h左右；当发酵3h左右，pH开始自然下降，开始使用25％的氨水调节发酵培养过程中的pH值维持在6.4；

发酵周期36h，L-谷氨酰胺产量91.6g/L,谷氨酸7.2g/L，糖酸转化率41.3％。

实施例5

涉及培养基同实施例4。

(1)将谷氨酸棒杆菌T-6接种到斜面培养基活化，32℃，12h。

(6)发酵过程中流加的葡萄糖中加入3g/L甜菜碱，各0.5mg/L的V_{B1、3、5、12}和2g/L氯化胆碱。发酵周期36h，L-谷氨酰胺产量93.4g/L，谷氨酸5.5g/L，糖酸转化率41.4％。

实施例6

涉及培养基同实施例4。

(1)将谷氨酸棒杆菌T-6接种到斜面培养基活化，32℃，12h。

(6)发酵过程中流加的葡萄糖中加入3g/L甜菜碱，各0.5mg/L的V_{B1、3、5、12}和2g/L氯化胆碱、赤霉素10mg/L、磷酸吡哆醛5mg/L。发酵周期36h，L-谷氨酰胺产量114.6g/L，谷氨酸3.1g/L，糖酸转化率43.2％。

上述各实施例所述方法发酵对比结果见表1。

表1 各实施例发酵生产谷氨酰胺结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种发酵生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：具体步骤如下：

2.根据权利要求1所述的发酵生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：具体步骤如下：

(2)将斜面活化的菌种接入摇瓶进行一级种子培养，34℃，pH7.0，220rmp/min，摇床培养10h，获得一级种子培养基体系；一级种子液全部接入发酵罐内进行二级种子培养，34℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD₆₀₀达到40，获得二级种子培养基体系；

(3)每2L二级种子培养基体系中，发酵初始培养基用水定容至1.3L；发酵流加培养基定容300mL；当二级种子培养完成，将二级种子液放出至剩余600mL，加入提前配制并定容好的1.3L发酵初始培养基和100mL浓度为80％的葡萄糖；流加培养基从发酵4h开始流加至发酵结束前8h；

(5)种子培养基中添加的尿素用来调节种子培养阶段和发酵培养初期的pH，1.5g/L的尿素可以使种子培养阶段全程pH维持在7.0-7.2，并在发酵培养初期将pH维持在7.0-7.2直至pH开始自然下降，开始使用25％的氨水调节发酵培养过程中的pH值维持在6.4；

(6)发酵过程中流加补料的葡萄糖中加入3g/L甜菜碱，各0.5mg/L的V_{B1、3、5、12}、2g/L氯化胆碱、10mg/L赤霉素、5mg/L磷酸吡哆醛。

3.根据权利要求2所述的发酵生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：所述斜面培养基为：牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、NaCl 2.5g/L、琼脂粉25g/L。

4.根据权利要求2所述的发酵生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：所述种子培养基为：葡萄糖30g/L、豆浓40mL/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.9g/L、V_H 20μg/L、FeSO₄ 5mg/L、MnSO₄ 5mg/L、Vb_1,3,5,12各0.5mg/L、尿素1.5g/L。

5.根据权利要求2所述的发酵生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：所述发酵初始培养基为：葡萄糖30g/L、K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、Vb_1,3,5,12各0.25mg/L、豆浓50mL/L、MnSO₄ 10mg/L、FeSO₄ 10mg/L、ZnSO₄ 5mg/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L、V_H 4μg/L、糖蜜1.1g/L。

6.根据权利要求2所述的发酵生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：所述发酵流加培养基为：K₂HPO₄·3H₂O 3g/L、Vb_1,3,5,12各0.25mg/L、MnSO₄ 10mg/L、FeSO₄ 10mg/L、ZnSO₄ 5mg/L、MgSO₄·7H₂O 2g/L、糖蜜1.1g/L。

7.根据权利要求2所述的发酵生产L-谷氨酰胺的方法，其特征在于：所述谷氨酸棒杆菌T-6是通过菌株CGMCC No.1.16145经过基因改造得到的高产L-谷氨酰胺菌株。