CN113913356A - 高产l-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高产L‑谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用，所述谷氨酸棒杆菌通过菌株TCCC 11822经过五步改造获得，相比原菌株TCCC 11822L‑谷氨酰胺产量提高了74.9％、副产物谷氨酸降低了67.4％，GS酶活大幅度提高，糖酸转化率达到37.1％；所述构建方法通过敲除谷氨酰胺酶基因Ncgl2395和Ncgl2500，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸和NH4 +，谷氨酸作为谷氨酰胺发酵过程中的主要副产物，在提取过程中较难与谷氨酰胺分离，因此降低发酵液中谷氨酸的含量，可以大大降低谷氨酰胺提取难度，降低成本，具有广泛的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其是高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用。
背景技术
L-谷氨酰胺(L-Glutamine,L-Gln)化学名为2,5-二氨基-5-氧代戊酸，分子式为C5H10N2O3，相对分子量为146.15，结晶形状为白色斜方晶体或结晶性粉末状，无臭，有独特的甜味。易溶于水，几乎不溶于乙醇，氯仿等多种有机溶剂，熔点为185℃，等电点为5.65，具有热不稳定性，遇热或酸碱易变性。L-谷氨酰胺含有两个氨基，一个是α-氨基，一个是末端酰胺基。由于末端酰胺基易水解，使谷氨酰胺不仅是生物体内嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸、核酸和其他氨基酸生物合成的必须原料之一，还是各器官间氮流动的重要载体。
谷氨酰胺(L-Glutamine，L-Gln)是L-谷氨酸的γ羧基酰胺化的一种中性氨基酸，是构成生物体蛋白质的20种基本氨基酸之一，在维持人体机能和生命活动方面具有重要作用，其在人体内含量非常高，占人体游离氨基酸的61％。近年来，随着对L-谷氨酰胺的深入研究，L-谷氨酰胺被广泛应用于医药、保健食品、饲料等领域。作为一种具有潜力的新药，L-谷氨酰胺在临床上主要应用于治疗胃肠溃疡，缓解运动疲劳，改善脑神经机能等方面。随着对L-谷氨酰胺生理作用以及应用范围的深度研究，谷氨酰胺的需求量和生产量都在不断增加，且药用需求量很大，具有广阔的市场前景。谷氨酰胺的工业生产方法主要有化学合成法，酶法和发酵法，其中发酵法生产谷氨酰胺是目前使用的主要方法。
L-谷氨酰胺生产菌大多是由L-谷氨酸生产菌经诱变或基因工程改造而来。1963年，木下祝郎等发现在谷氨酸的发酵液中发现了少量谷氨酰胺。1979年，中西透等人通过进一步研究证实，可以改变发酵条件，使谷氨酸生产菌生产谷氨酰胺。谷氨酸为谷氨酰胺的直接前提物质，在高浓度NH4 +和微酸环境下，谷氨酸经谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase)催化消耗ATP生成谷氨酰胺。目前用来生产谷氨酰胺的菌株主要包括：谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、嗜乙酞乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)、北京棒状杆菌(C.pekinense)、黄色短杆菌((B.flavun)、乳糖发酵短杆菌(B.revibacterium lactofentum)及钝齿杆菌(C.crenatum)等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株。
本发明所要解决的技术问题在于提供上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。
本发明所要解决的技术问题在于提供上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株T-1，是通过菌株CGMCC No.1.16145(菌株TCCC 11822于2017年9月由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收到并登记入册，受理保存，登记入册编号为CGMCC No.1.16145)改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶(glutamate synthase)基因Ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株T-1。
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株T-2，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶(glutaminase)Ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建出菌株T-2。
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株T-3，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，同时敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因，构建出菌株T-3。
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株T-4，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株T-3的基础上，在基因组Ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)基因glnAbsu，构建出菌株T-4。
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株T-5，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株T-4的基础上，在基因组Ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAlcb，构建出菌株T-5。
一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，为谷氨酸棒杆菌菌株T-6，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株T-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pXT01质粒，将来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu插入pXT01质粒，构建质粒pXT01-glnAbsu，并将pXT01-glnAbsu电转化进入菌株T-5，构建出菌株T-6。
对上述谷氨酸棒杆菌菌株T-1～T-6进行发酵实验验证其谷氨酰胺发酵能力的提高。
上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，具体步骤如下：
(1)以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶(glutamatesynthase)基因Ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株T-1；
(2)以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶(glutaminase)Ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建菌株T-2；
(3)以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，同时敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因，构建菌株T-3，通过发酵实验分析敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因对谷氨酰胺发酵的影响；
(4)在菌株T-3的基础上，在基因组Ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)基因glnAbsu，构建菌株T-4；在菌株T-4的基础上，在基因组Ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAlcb，构建菌株T-5。通过发酵实验分析在基因组Ncgl0182位点上整合一拷贝glnAbsu和在基因组Ncgl2500位点上整合一拷贝glnAlcb对谷氨酰胺发酵的影响；
(5)在菌株T-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pXT01质粒，将来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu插入pXT01质粒，构建质粒pXT01-glnAbsu，并将pXT01-glnAbsu电转化进入菌株T-5，构建出菌株T-6，达到多拷贝过表达glnAbsu的目的。
上述步骤(5)中使用带有tuf强启动子的pXT01质粒过表达来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu。谷氨酸棒杆菌中的GS会受到腺苷酰化的影响，AMP以共价方式与GS的肽链上的酪氨酸残基结合，产生GS(AMP)。受到腺苷酰化的影响，GS的催化性质会发生明显变化，催化谷氨酸生成谷氨酰胺的活性会明显降低。但是枯草芽孢杆菌中的GS不受腺苷酰化影响。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pK18mobsacB-ΔNcgl0181，将构建好的质粒电转化进入菌株TCCC 11822感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例1和图2)，敲除Ncgl0181基因，构建出菌株T-1。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pK18mobsacB-ΔNcgl2395，将构建好的质粒电转化进入菌株TCCC 11822感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例2和图2)敲除Ncgl2395基因，构建出菌株T-2。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pK18mobsacB-ΔNcgl2395，将构建好的质粒电转化进入菌株T-1感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例3和图2)敲除Ncgl2395基因，构建出菌株T-3。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pK18mobsacB-Ncgl0182::PtufglnAbsu，并将构建好的质粒电转化进入菌株T-3感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例4)，在基因组Ncgl0182位点上整合一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu构建出菌株T-4。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建pK18mobsacB-Ncgl2500::PtufglnAlcb，并将构建好的质粒电转化进入菌株T-4感受态细胞，进行两步同源重组，单交换和双交换(详细步骤和原理见实施例5)，在基因组Ncgl2500位点上整合一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAlcb，构建出菌株T-5。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，通过构建带有tuf强启动子的质粒pXT01-glnAbsu，将构建好的质粒电转化进入菌体，过表达glnAbsu，构建出菌株T-6，达到多拷贝过表达glnAbsu的目的。
上述谷氨酸棒杆菌菌株生产L-谷氨酰胺的应用，具体发酵生产方法如下：
(1)将谷氨酸棒杆菌菌株T-1～T-6中任一菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入斜面活化培养，培养条件为32℃、12h；
(2)三个1L一级种子摇瓶，定容种子培养基100mL，32℃，pH 7.0，220rmp/min，摇床培养10h；
(3)5L发酵罐二级种子培养，一级种子液全部接入5L发酵罐内进行二级种子培养，培养基定容2L，34℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD600达到40；
(4)5L发酵罐发酵培养，接种量20％，培养基定容3L，34℃，溶氧30-50％。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，采用的种子培养基为：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉15g/L，豆浓15ml/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L。
优选的，上述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，采用的发酵培养基为：K2HPO4·3H2O 1.8g/L，VB1 0.1mg/L，豆浓10ml/L，玉米浆干粉4g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4 10mg/L，ZnSO4 5mg/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO4 60g/L。
有益效果：
本发明构建的谷氨酸棒杆菌T-6相比原菌株TCCC 11822L-谷氨酰胺产量提高了74.9％、副产物谷氨酸降低了67.4％，GS酶活大幅度提高，糖酸转化率达到37.1％；所述构建方法通过敲除谷氨酰胺酶(glutaminase)基因Ncgl2395和Ncgl2500，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸和NH4 +，谷氨酸作为谷氨酰胺发酵过程中的主要副产物，在提取过程中较难与谷氨酰胺分离，因此降低发酵液中谷氨酸的含量，可以大大降低谷氨酰胺提取难度，降低成本，具有广泛的工业应用前景。
经测定，构建的谷氨酸棒杆菌T-6可以生产L-谷氨酰胺84.3g/L，副产物谷氨酸9.9g/L。
附图说明
图1为谷氨酰胺代谢路径示意图；
图2为以敲除基因Ncgl0181为例的原理示意图；
图3为pK18mobsacB-ΔNcgl0181图谱；
图4为pK18mobsacBΔNcgl2395图谱；
图5为pK18mobsacB-Ncgl0182::PtufglnAbsu图谱；
图6为pK18mobsacB-Ncgl2500::PtufglnAlcb图谱；
图7为过表达质粒pXT01-glnAbsu的图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
实施例1
pK18mobsacB-ΔNcgl0181载体构建和Ncgl0181(谷氨酸合酶基因)敲除操作
1.pK18mobsacB-ΔNcgl0181载体构建
(1)以谷氨酸棒杆菌TCCC 11822基因组为模板，以Ncgl0181基因上游同源臂扩增引物N0up-s和N0up-a，下游同源臂扩增引物N0down-s和N0down-a作为扩增引物(其中N0up-s和N0down-a的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，N0up-a和N0down-s有25bp的重叠区域)。扩增出上下同源臂片段进行回收。
(2)用扩增出的上下游同源臂作为模板，以N0up-s和N0down-a作为引物，进行重叠PCR，获得Ncgl0181中间部分缺失的重叠片段ΔNcgl0181。
(3)用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段ΔNcgl0181进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图3所示)
2.谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
(1)将构建好的质粒pK18mobsacBΔNcgl0181电击转化到TCCC 11822感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段，长度为重组片段ΔNcgl0181的长度加pk18mobsacB鉴定引物M13-47(pk18mobsacB上的一段基因序列，用于鉴定同源重组是否发生)的长度为1300，为发生单交换的单菌落。
(2)将发生单交换的单菌落接入BHI摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为1600(重组片段ΔNcgl0181的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即敲除成功的单菌落T-1。(Ncgl0181谷氨酸合酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
实施例2
pK18mobsacB-ΔNcgl2395载体构建和Ncgl2395(谷氨酰胺酶基因)敲除操作
pK18mobsacB-ΔNCgl02395载体构建和谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
3.pK18mobsacB-ΔNcgl2395载体构建
(1)以谷氨酸棒杆菌TCCC 11822基因组为模板，以Ncgl2395基因上游同源臂扩增引物N2up-s和N2up-a，下游同源臂扩增引物N2down-s和N2down-a作为扩增引物(其中N2up-s和N2down-a的5’端分别加入限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的线性载体同源序列，N2up-a和N2down-s有25bp的重叠区域)。扩增出上下同源臂片段进行回收。
(2)用扩增出的上下游同源臂作为模板，以N2up-s和N2down-a作为引物，进行重叠PCR，获得Ncgl2395中间部分缺失的重叠片段ΔNcgl2395。
(3)用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段ΔNcgl2395进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图4所示)
4.谷氨酸棒杆菌基因敲除操作
(1)将构建好的质粒pK18mobsacBΔNcgl2395电击转化到TCCC 11822感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段，长度为重组片段ΔNcgl2395的长度加pk18mobsacB鉴定引物M13-47(pk18mobsacB上的一段基因序列，用于鉴定同源重组是否发生，序列见表1)的长度为850，为发生单交换的单菌落。
(2)将发生单交换的单菌落接入BHI摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为1000(重组片段ΔNcgl2395的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即敲除成功的单菌落T-2。(Ncgl2395谷氨酰胺酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
实施例3
使用实施例1中构建得到的菌株T-1，进行实施例2的操作得到菌株T-3。
实施例4
在基因组Ncgl0182(谷氨酸合酶基因)位点整合一拷贝glnAbsu的菌株构建
(1)pK18mobsacB-Ncgl0182::PtufglnAbsu载体构建
以谷氨酸棒杆菌TCCC 11822基因组为模板，以Ncgl0182基因上游同源臂扩增引物N0182up-s和N0182up-a，下游同源臂扩增引物N0182down-s和N0182down-a作为扩增引物，扩增出上下游同源臂片段进行回收。以质粒pXT01-glnAbsu(构建方法见实施例5，序列见表4)为模板，以N0182tuf-s和N0182glnA-a作为扩增引物，扩增出带有tuf启动子的glnAbsu基因片段并回收。
用扩增出的上下游同源臂和带有tuf启动子的glnAbsu基因片段(tuf启动子序列见表4)作为模板，以N0182up-s和N0182down-s作为引物，进行重叠PCR，获得重叠片段Ncgl0182::PtufglnAbsu。
用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Ncgl0182::PtufglnAbsu进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图5所示)
(2)在Ncgl0182位点整合一拷贝glnAbsu菌株构建
将构建好的质粒pK18mobsacB-Ncgl0182::PtufglnAbsu电击转化到T-3的感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段，长度为重组片段Ncgl0182::PtufglnAbsu长度加pk18mobsacB鉴定引物M13-47长度为2500，为发生单交换的单菌落。
将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为2650(重组片段Ncgl0182::PtufglnAbsu的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即敲除成功的单菌落T-4。(Ncgl0182谷氨酸合酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
实施例5
在基因组Ncgl2500(谷氨酰胺酶基因)位点整合一拷贝glnAlcb的菌株构建
(1)pK18mobsacB-Ncgl2500::PtufglnAlcb载体构建
以谷氨酸棒杆菌TCCC 11822基因组为模板，以Ncgl2500基因上游同源臂扩增引物N2500up-s和N2500up-a，下游同源臂扩增引物N2500down-s和N2500down-a作为扩增引物，扩增出上下游同源臂片段进行回收。以质粒pXT01-glnAlcb(构建方法见实施例五，序列见表4)为模板，以N2500tuf-s和N2500glnA-a作为扩增引物，扩增出带有tuf启动子的glnAlcb基因片段并回收。
用扩增出的上下游同源臂和带有tuf启动子的glnAlcb基因片段(tuf启动子序列见表4)作为模板，以N2500up-s和N2500down-s作为引物，进行重叠PCR，获得重叠片段Ncgl2500::PtufglnAlcb。
用XbaⅠ和HindⅢ将pK18mobsacB质粒双酶切，与重叠片段Ncgl2500::PtufglnAlcb进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于0.05mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，进行验证，筛选出携带质粒的单菌落。BHI培养基摇管培养，并提出质粒。(质粒图谱如图6所示)
(2)在Ncgl2500位点整合一拷贝glnAlcb菌株构建
将构建好的质粒pK18mobsacB-Ncgl2500::PtufglnAlcb电击转化到T-4的感受态细胞中，涂布于0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段，长度为重组片段Ncgl2500::PtufglnAlcb长度加pk18mobsacB鉴定引物M13-47长度为2460，为发生单交换的单菌落。
将发生单交换的单菌落接入摇管，32℃培养。分别在2h、4h、6h接50μL发酵液涂布于含有15％蔗糖的BHI平板，32℃，培养24h。将单菌落对点于含有15％蔗糖的BHI平板和0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板，挑取在15％蔗糖的BHI平板生长且在0.01mg/mL浓度的卡那霉素抗性平板不生长的单菌落，进行菌落PCR，琼脂糖凝胶电泳检验，长度为2600(重组片段Ncgl2500::PtufglnAlcb的长度加上下游鉴定引物的长度)，为发生双交换即整合成功的单菌落。(Ncgl2500谷氨酰胺酶基因代谢路径如图1所示，敲除原理如图2所示)
实施例6
glnAbsu(来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因)过表达菌株的构建
(1)pXT01-glnAbsu重组质粒构建
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.subtilis 168，购自天津科技大学代谢工程实验室)基因组为模板，以枯草芽孢杆菌中的谷氨酰胺合成酶基因的上游引物bsu-glnA-s和下游引物bsu-glnA-a为扩增引物(上游引物和下游引物的5’端分别加入限制性内切酶BamH1和EcoR1的线性载体同源序列)，PCR扩增出长度为1335的glnAbsu基因片段。
将pXT01质粒进行BamH1和EcoR1双酶切，与glnAbsu基因片段进行重组，化转至大肠杆菌DH5α感受态中，涂布于0.0005mg/mL浓度的氯霉素抗性平板，进行PCR菌落验证，筛选出携带质粒的单菌落。32℃摇管培养12h，并提出质粒。(质粒图谱如图7所示)
(2)glnAbsu过表达菌株构建
将pXT01-glnAbsu质粒电击转化到T-5的感受态细胞中，涂布于0.0005mg/mL浓度的氯霉素抗性平板，32℃培养24小时。挑选单菌落进行PCR，琼脂糖凝胶电泳检验PCR片段长度是1335为成功导入质粒的单菌落，得到菌株T-6。
本发明构建的高产谷氨酰胺谷氨酸棒杆菌的基因型为TCCC 11822ΔNcgl0181ΔNcgl2395 Ncgl0182::Ptuf-glnAbsuNcgl2500::Ptuf-glnAlcb/pXT01-glnAbsu，将其命名为T-6(对应实施例6)。
该高产菌株经5L发酵罐发酵实验验证(具体实验步骤见发明内容中的具体发酵生产方法)，谷氨酰胺产量可达到84.3g/L，比原菌TCCC 11822提高了74.9％，糖酸转化率从32.5％提高到37.1％，副产物谷氨酸的含量9.9g/L，比原菌TCCC 11822降低了67.4％。此菌株具有良好的生产能力和较高的转化率，为L-谷氨酰胺的产业化生产奠定了基础。
上述实施例中构建菌株所用引物序列见表1。
上述实施例中所述菌株和质粒见表2。
上述实施例中各所述菌株发酵生产谷氨酰胺结果见表3。
表1构建菌株所用引物序列
表2菌株和质粒
表3各菌株发酵生产谷氨酰胺结果
上述实施例中基因改造涉及的基因表4如下：
表4本发明涉及的基因序列
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，均在保护范围内。本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株及其构建方法与应用
<130> 2021
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4533
<212> DNA
<213> glutamate synthase
<220>
<221> gene
<222> (1)..(4533)
<400> 1
atgaaaccac aaggactcta caaccctgcg catgaacatg acgcctgcgg tgtggcgttt 60
attgcggata tccacggtcg acccagccgc agcattgttg atcgtgcact tgaggcgctt 120
cgcaacattg accaccgagg tgccgccggt gcagagaaga acactggcga tggtgcgggc 180
atcctcatgc agattccgga cggcttttat cgtgaagtat ctggcattga gcttcctgag 240
gcaggggagt atgccactgg tattgcgttc ttgcctcgcg gtcgcatggc gatgatggat 300
gctcagaagg aaattgagcg catcgcaaag caagaaggtg ccgatgtgct tggttggcgc 360
atggttcctt ttgattctcg tgatttgggt tccatggctg aggaggcgat gcctagtttc 420
gcgcagattt tccttactgt gcctggaaaa tctggtgaag atcttgaccg tgtgatgttc 480
tttatccgta agcgttgtga gcgtgagctg ggcaccacca atggtcgcga tacggtgtat 540
ttcccgtcgc tatcttcacg caccatcatt tacaaaggca tgttgaccac tctgcagctt 600
gagggcttct ttgaggatct gggtgatgct cgcctggagt cggccattgc tattgtgcac 660
tcgcgtttct ccacgaacac tttcccaagc tggccgctgg cgcacccgta ccgtttcgtt 720
gcccacaacg gtgagatcaa cactgtgcgt ggcaatgaaa actggatgcg cgcccgcgag 780
gcgcttatca aaaacgacaa gctgggcaat ttgagcagcg tgctgcctat ctgcaccccg 840
gagggctcgg ataccgcgcg tttcgacgag gctttggagc ttttgcacct gggcggatac 900
tcacttccgc atgctgttgc gatgatgatc cctcaggcgt gggaacacaa caagacgctg 960
agccctgagc tgcgtgattt ctacgaatac cactcttgtc tgatggagcc atgggatggt 1020
cctgcagcgc tggcatttac tgacggtcgt tttgtgggtg ccgtgctgga ccgtaatggc 1080
ctgcgacctg ggcgaatcac cattactgat tcgggtttgg ttgtgatggc ttctgaatcg 1140
ggagtgttgg acttgaggga ggagagcgtc gtaaagcgta ctcgcgtaca gcctggacgc 1200
atgttccttg ttgacactgc cgagggccgc atcgttgaag acgaggaaat caagcagaaa 1260
ttaagcgaag cgcagccata tggtgagtgg attcgcgata attttgtgca tctggatcgt 1320
ctgcctcaga cacgctacaa ctacatggcg cactctcgtg ctgtgttgcg tcagcgtgtt 1380
ttcggaatca ctgaagaaga tgtggatttg ttgctgctgc cgatggcccg ccagggtgct 1440
gaggcgattg gttccatggg ttcggatacg ccaattgcgg cgctatccca gcgaccacgc 1500
atgctttatg atttcttcgc gcagcgcttt gctcaggtga caaacccacc gttggactct 1560
atccgcgaaa agcctgtgac cagcatgttc actttgttgg gtgcgcagtc tgacgtgctc 1620
aatccgggtc ctgatgcggc gcgacgtatc cgtttggaat cgccgatcat tgataaccat 1680
gagctggcca ccttgatcaa tgccaacgcg catggtgagt gggattcctt tggtgctgct 1740
gtaatttctg gtttgtaccc agtggctcac catggtgccg gcatgaaggc tgcgattgct 1800
cgtgtgcgcc gcgaggtttc tgaagcaatc cgcaatggca agacgttgat cgtgctgtcg 1860
gatcgtgaat ctgatgagcg catggcacct atccctgcgc tgctgctgac ttccgctgtg 1920
catcagtact tggtgcagca acgtacccgt acccagtgct ccctggtggt ggaatccggc 1980
gatgcccgcg aggttcatca cctggcgatg ctcattggtt ttggtgccga tgcgatcaac 2040
ccgtacatgg catttgaaac catcgatgag ctgcgcatga agggtcagtt gggtgatctt 2100
tctttggatg aggcatcccg aaactacatc aaggcagcca ccactggtgt gctgaaggtg 2160
atgtccaaga tgggcattgc aacggtgtct tcgtaccgtg gcgcgcagct tgccgatgtc 2220
actggtctgc accaggatct cctggacaac tacttcggtg gtattgcttc accaatttct 2280
ggcatcggtc tggatgaagt tgcagctgac gtagaagctc gtcaccgcag cgcatttttg 2340
ccacgccctg aagagcacgc tcaccgtgaa ttggatttgg gtggtgaata caagtggcgc 2400
cgcgaaggtg aataccacct gttcaaccca gaaaccatct tcaagctgca gcatgcaacg 2460
cgttctggca gctacgagat tttcaaggat tacacccgca aggttgatga tcaatccact 2520
cgcttgggta ctattcgtgg actgtttgag ttcagcacgg accgcaagcc aatttcggtg 2580
tctgaggtgg agccggtcag tgagatcgtg aagcgtttct ccactggtgc gatgtcttat 2640
ggctcgattt ctgctgaagc ccatgaggtc ttggccatcg ccatgaaccg actgggcggt 2700
atgtccaact ccggcgaagg tggcgaggac gcccgccgat ttgatgtgga acccaacggt 2760
gactggaagc gctctgccat taagcaggtg gcctcgggac gtttcggcgt gaccagccac 2820
tacttgaaca actgcaccga tattcagatc aagatggcac agggcgcaaa gcccggtgaa 2880
ggtggccagc tgccaccaaa caaggtgtac ccatgggttg cagaagtccg catcaccacc 2940
ccaggcgttg gtctgatttc ccctccacca caccacgata tttactccat tgaggatctg 3000
gctcagctga tccacgacct gaagaacgct aacccacgcg cacgaatcca cgtgaagcta 3060
gtggcagaac aaggcgtggg caccgttgcc gcaggtgtgt ccaaagcaca cgctgatgtg 3120
gtgcttattt ccggccacga tggcggaact ggcgcatctc ctttgacctc cctgaagcat 3180
gccggtggtc catgggagtt gggcttggct gaaacccagc aaacgttgct gctcaacggc 3240
ctgcgcgatc gtattcgcgt gcagtgcgat ggtcagctga aaactggccg agacgtggtt 3300
atcgcagctc ttctcggtgc cgaagaattc ggttttgcca ccgcaccgct ggtggttgaa 3360
ggctgcatca tgatgcgcgt ctgccacctg gacacctgcc cggtgggtat cgctacccag 3420
aacccggatt tgcgttccaa gttcaccggc aaggctgaac acgtggtcaa cttcttcacc 3480
ttcatcgccc aggaagtccg tgagtacttg gcacagcttg gtttccgctc tattgatgaa 3540
gccgtcggac aagcccaggt gctgcgcaag cgttccggaa tcccagctga ttcccgcgca 3600
gcacacctgg atttgagccc aattttccat cgcccagaaa ctccacactt cccaactcag 3660
gatgtgcgtt gcaccaagac ccaggaacac agcctagaaa aagccctgga caacgcattt 3720
attgataagg cttcggacac gatcacccgt gccgcagcgg gtgtggaaac cagcattgtt 3780
attgatagct ccatcagcaa cgtcaaccgt tcagttggca cgatgctggg ttctgcagtc 3840
agccgcgtgg ctggtgccca aggtttgcca gacggcacca tcaccttgaa tcttcaaggc 3900
tgcgccggta actcctttgg cgcgttcatc ccacgaggca tcaccatcaa cctcaccggc 3960
gatgccaatg actttgtggg caagggatta tctggcggaa agattgtgat caagccttcc 4020
gctcaggctc cgaagcagct gaagaacaat ccaaatatca ttgccggaaa cgtgcttgga 4080
tacggcgcaa ccagtggtga attgttcatt cgtggccagg tcggcgaacg tttctgcgtc 4140
cgtaactctg gcgccaccgc agtggttgaa ggtatcggaa accacggttg tgagtacatg 4200
actggcggcc gagtcctggt tttgggcccg gttggtgaga actttggtgc cggcatgtct 4260
ggtggcattg catacctggc taattccccg gacctaaacc agaagatcaa tggcgaattg 4320
gtggatgttg ttccactgag cgctgacgat ctgacgtggg ctgatgagct cattgctcgc 4380
caccgcgaac tcaccggatc cgagaccaag ctgcgtgcac aagatttggt gaaaatcatg 4440
ccgcgcgatt tccaaaaagt actcaacatc atcgaaacgg cccacgctga gggccaagac 4500
ccagcaatca agatcatgga ggcagtgagc taa 4533
<210> 2
<211> 1242
<212> DNA
<213> glutaminase
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1242)
<400> 2
atgttgacga tgccgatacc cgagtacctg cacgaaattt tagatgatgt ccgcgacacc 60
acctccggcg agttggccga ttacatcccg gaactaaaat ctgcggaccc aaacccgctg 120
gcagtagccc tgtgcaccgt taacggacac atctacagcg caggcgatga cgacatcgaa 180
ttcaccatgc aaagtatttc caagccattt gcctacgcac tcgcactcca agaatgcggc 240
tttgatgagg tctctgcatc cgtggccttg gagccctccg gtgaggcctt caacgaactt 300
tccctcgacg gcgaaaaccg ccccatgaac cccatgatca acgccggcgc gatcgccatc 360
aaccagctga tcaacggctc cgattccacc gtggaagacc gcgtggaaaa aatccgacac 420
tacttctctg aacttgctgg acgcgaactc accatcgacc gcgtgcttgc cgaatccgaa 480
ctcgccggcg ccgaccgcaa cctctccatc gcccacatgc tgcgcaatta cggcgtcatc 540
gaagacgaag cccacgacgc cgtcctcagc tacacgctgc aatgcgccat caaagtaacc 600
acgcgcgacc tcgcagtcat gaccgccacg ctcgccgccg gcggcacaca cccaattacc 660
ggcaagaagc ttctcgacgc ccgcgtctgc cgcctcaccc tctccgtcat ggcttcagca 720
ggcatgtacg acgaggcagg gcagtggctc tccaccgtag gcatccccgc gaaatcagga 780
gtcgccggcg gactcatcgg cattctgcca ggtcagctgg gcatcgccac attttcccca 840
cgcctgaacc ccaaaggcaa cagcgtgcgc ggcgtaaaaa tattcaaaca gctttccgac 900
gacatgggcc tccacctcat gtccaccgag caggtatccg gccacgcagt acgatccatc 960
acgcgggacg gcgacaccac cttcatccaa atgcagggcg ccatgaactt ctccgccagc 1020
gaaagcttcc tccacgccat cgtggaacac aactttgaag gcaccgaagt tgttcttgat 1080
ctcacccgag tacttagctt ccaccccgta gccatccgca tgatcaaaga aggcctcaaa 1140
cgcatccgcg acgcaggctt tgaggtgttc atcctcgacc cagatgacgt actgcccgat 1200
ttcatgtttt ccgacggcac catctgcaaa gaacgagtgt ga 1242
<210> 3
<211> 1335
<212> DNA
<213> glutamine synthetase
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1335)
<400> 3
atggcaaagt acactagaga agatatcgaa aaattagtaa aagaagaaaa cgtgaagtat 60
atccgccttc aatttactga cattcttgga acaatcaaga atgttgagat tcctgtaagc 120
cagcttggaa aagcgcttga taataaagtc atgtttgacg gttcttctat tgagggattc 180
gttcgtatcg aagagtcaga catgtacctg tatccagatc taaatacatt tgttatcttc 240
ccatggacag ctgaaaaagg taaagtagca cgtttcatct gtgatattta caatccggat 300
ggcacacctt ttgaaggtga cccgcgaaac aacttaaaac ggattctgaa agaaatggaa 360
gacctcggct tcagtgattt taaccttggg cctgagcctg aattcttctt attcaaattg 420
gacgaaaaag gcgagccgac gcttgaacta aacgacaaag gcggatattt cgacttagct 480
ccaactgatt taggagaaaa ctgccgccgc gatatcgtac ttgagcttga agagatgggc 540
tttgaaatcg aagcgtctca ccacgaagta gcacctggtc agcacgaaat cgactttaaa 600
tatgctggag cagtccgctc ttgtgatgac atccaaacat ttaaactagt tgtcaaaaca 660
attgcccgta aacacggcct gcatgcgaca tttatgccaa aaccattgtt cggtgtaaac 720
ggttcaggta tgcactgcaa tctatcactc ttcaaaaatg gtgttaacgc attctttgac 780
gaaaacgcag atcttcagtt aagtgaaaca gcgaagcact tcattgcagg tatcgtgaag 840
cacgcaacaa gctttacagc agtaacaaac ccgacagtaa actcttacaa acgtcttgtt 900
cctggctatg aagcaccttg ttatgtagca tggagcgcgc aaaacagaag cccgcttatc 960
cgtatcccgg cttctcgcgg catcagcaca cgtgttgaag tacgcagtgt agacccagct 1020
gcaaacccat accttgcact tagcgtattg cttgctgcag gattagacgg aatcaaaaac 1080
aaactggaag cgccggctcc aatcgaccgc aacatctatg tgatgagcaa agaagagcgc 1140
atggaaaacg gaatcgttga ccttccagca acacttgcgg aagcactaga agaattcaaa 1200
tcaaacgaag tcatggtcaa agcgctgggc gagcacctat tcgaacactt catcgaagca 1260
aaagaaatcg aatgggatat gttccgcacg caagtacatc cttgggaacg cgaacagtat 1320
atgtctcagt attaa 1335
<210> 4
<211> 1344
<212> DNA
<213> glutamine synthetase
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1344)
<400> 4
atgggcgatg aagccgtcat cgagcagctg acagagaagc aaactgagct gatcgagttt 60
ctgtatgtgg attataacgg gttaacgcgt ggtaaggtga ttccgcttgc cagcttgaag 120
gccaagctgg ctgatgggat tgggttgacc aaagcaacct tgaatgtcag tgaacgtgat 180
acgattttgc cggtggcgga catgacgcct attggcgaac tgcgccttgt tggtgatccg 240
gcgtcggcac atgtcctacc ctatatgccg caagtcgcca ccttaatggg ggatatttac 300
aatcttgata aaaccccgta cgcatctgat ccgcggtcca ttttgaaaaa agtcgtcaag 360
cagcttgctg atgctggctt cacggtcaaa atggcctatg aaaatgaatt cgagttattt 420
actggagata aagatcatcg cgaaccggca atgccacatg tcgccttttc caccgagtcc 480
atggattttg cgtatccatt cattctgaag gcgatcgatc aactgcaaaa agtcggcatt 540
atgccgaacg cttattaccc agaaggtggc attggtcagc atgagctgag catgttgccg 600
agtgatccgg tgactgctgc ggacaatgag gtgatttaca aacggatcat caaaaatacc 660
gcgaaggctt ttgacctata tgcctcattc gcgccaaagc cgctagttga ttcggcaggg 720
tcaggggcac acattcactt gtcactttgg caagataaag aggatgcttt ctttgatgac 780
aaggcagcga tgcaactatc cacgattggg cagtattttg tcggcggtgt tttgaaacat 840
attcaaggtt tgctggcatt gacctgtcca tcggctaatt catatcagcg cttggcacct 900
ggtcattgga gcagtgcata cgccacatat ggtcaagaca atcgtgaggc ggcaattcgc 960
attccgtcaa ccagttgggg tgatccggcc agctcgatga acatcgaact caaggcaagt 1020
gatgcgacgg ctaatcctta tttggctttt gctggtttgc tggcggcagg acttgacggc 1080
atcacaaatc acatgcaacc ggatggctat tgcgatgttg atccagccag cctcagtcaa 1140
gctgagcgcg atgccaaagg gattcagctt ctgccacgca cactgagcca agcggttgac 1200
gcttttgagg cagattcgct attccagcaa gtatttggca agcaattggt cgatgcctac 1260
gcgaaaatca agcgcgagga cgatcagtat tatgccaaat tggcattgga aaaaattgct 1320
gccttgcatc gcgaattgta ttaa 1344
<210> 5
<211> 362
<212> DNA
<213> plasmid
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(362)
<400> 5
gttaacagat cgtttagatc cgaaggaaaa cgtcgaaaag caatttgctt ttcgacgccc 60
caccccgcgc gttttagcgt gtcagtaggc gcgtagggta agtggggtag cggcttgtta 120
gatatcttga aatcggcttt caacagcatt gatttcgatg tatttagctg gccgttaccc 180
tgcgaatgtc cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc ttaggattca 240
gtaactggca cattttgtaa tgcgctagat ctgtgtgctc agtcttccag gctgcttatc 300
acagtgaaag caaaaccaat tcgtggctgc gaaagtcgta gccaccacga agtccaggag 360
ga 362
<210> 6
<211> 7038
<212> DNA
<213> plasmid
<220>
<221> gene
<222> (1)..(7038)
<400> 6
gttaacagat cgtttagatc cgaaggaaaa cgtcgaaaag caatttgctt ttcgacgccc 60
caccccgcgc gttttagcgt gtcagtaggc gcgtagggta agtggggtag cggcttgtta 120
gatatcttga aatcggcttt caacagcatt gatttcgatg tatttagctg gccgttaccc 180
tgcgaatgtc cacagggtag ctggtagttt gaaaatcaac gccgttgccc ttaggattca 240
gtaactggca cattttgtaa tgcgctagat ctgtgtgctc agtcttccag gctgcttatc 300
acagtgaaag caaaaccaat tcgtggctgc gaaagtcgta gccaccacga agtccaggag 360
gaaagcttgc atgcctgcag gtcgactcta gaggatccat ggcaaagtac actagagaag 420
atatcgaaaa attagtaaaa gaagaaaacg tgaagtatat ccgccttcaa tttactgaca 480
ttcttggaac aatcaagaat gttgagattc ctgtaagcca gcttggaaaa gcgcttgata 540
ataaagtcat gtttgacggt tcttctattg agggattcgt tcgtatcgaa gagtcagaca 600
tgtacctgta tccagatcta aatacatttg ttatcttccc atggacagct gaaaaaggta 660
aagtagcacg tttcatctgt gatatttaca atccggatgg cacacctttt gaaggtgacc 720
cgcgaaacaa cttaaaacgg attctgaaag aaatggaaga cctcggcttc agtgatttta 780
accttgggcc tgagcctgaa ttcttcttat tcaaattgga cgaaaaaggc gagccgacgc 840
ttgaactaaa cgacaaaggc ggatatttcg acttagctcc aactgattta ggagaaaact 900
gccgccgcga tatcgtactt gagcttgaag agatgggctt tgaaatcgaa gcgtctcacc 960
acgaagtagc acctggtcag cacgaaatcg actttaaata tgctggagca gtccgctctt 1020
gtgatgacat ccaaacattt aaactagttg tcaaaacaat tgcccgtaaa cacggcctgc 1080
atgcgacatt tatgccaaaa ccattgttcg gtgtaaacgg ttcaggtatg cactgcaatc 1140
tatcactctt caaaaatggt gttaacgcat tctttgacga aaacgcagat cttcagttaa 1200
gtgaaacagc gaagcacttc attgcaggta tcgtgaagca cgcaacaagc tttacagcag 1260
taacaaaccc gacagtaaac tcttacaaac gtcttgttcc tggctatgaa gcaccttgtt 1320
atgtagcatg gagcgcgcaa aacagaagcc cgcttatccg tatcccggct tctcgcggca 1380
tcagcacacg tgttgaagta cgcagtgtag acccagctgc aaacccatac cttgcactta 1440
gcgtattgct tgctgcagga ttagacggaa tcaaaaacaa actggaagcg ccggctccaa 1500
tcgaccgcaa catctatgtg atgagcaaag aagagcgcat ggaaaacgga atcgttgacc 1560
ttccagcaac acttgcggaa gcactagaag aattcaaatc aaacgaagtc atggtcaaag 1620
cgctgggcga gcacctattc gaacacttca tcgaagcaaa agaaatcgaa tgggatatgt 1680
tccgcacgca agtacatcct tgggaacgcg aacagtatat gtctcagtat taagaattca 1740
gcttggctgt tttggcggat gagagaagat tttcagcctg atacagatta aatcagaacg 1800
cagaagcggt ctgataaaac agaatttgcc tggcggcagt agcgcggtgg tcccacctga 1860
ccccatgccg aactcagaag tgaaacgccg tagcgccgat ggtagtgtgg ggtctcccca 1920
tgcgagagta gggaactgcc aggcatcaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg 1980
cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg 2040
gagcggattt gaacgttgcg aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat 2100
aaactgccag gcatcaaatt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc 2160
tacaaactct tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa 2220
taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc 2280
cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa 2340
acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa 2400
ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg 2460
atgagcactt ttgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 2520
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 2580
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 2640
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 2700
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 2760
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 2820
tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 2880
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 2940
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 3000
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 3060
tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 3120
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 3180
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3240
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 3300
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttggg gtgggcgaag 3360
aactccagca tgagatcccc gcgctggagg atcatccagc cattcggggt cgttcactgg 3420
ttcccctttc tgatttctgg catagaagaa cccccgtgaa ctgtgtggtt ccgggggttg 3480
ctgatttttg cgagacttct cgcgcaattc cctagcttag gtgaaaacac catgaaacac 3540
tagggaaaca cccatgaaac acccattagg gcagtagggc ggcttcttcg tctagggctt 3600
gcatttgggc ggtgatctgg tctttagcgt gtgaaagtgt gtcgtaggtg gcgtgctcaa 3660
tgcactcgaa cgtcacgtca tttaccgggt cacggtgggc aaagagaact agtgggttag 3720
acattgtttt cctcgttgtc ggtggtggtg agcttttcta gccgctcggt aaacgcggcg 3780
atcatgaact cttggaggtt ttcaccgttc tgcatgcctg cgcgcttcat gtcctcacgt 3840
agtgccaaag gaacgcgtgc ggtgaccacg acgggcttag cctttgcctg cgcttctagt 3900
gcttcgatgg tggcttgtgc ctgcgcttgc tgcgcctgta gtgcctgttg agcttcttgt 3960
agttgctgtt ctagctgtgc cttggttgcc atgctttaag actctagtag ctttcctgcg 4020
atatgtcatg cgcatgcgta gcaaacattg tcctgcaact cattcattat gtgcagtgct 4080
cctgttacta gtcgtacata ctcatattta cctagtctgc atgcagtgca tgcacatgca 4140
gtcatgtcgt gctaatgtgt aaaacatgta catgcagatt gctgggggtg cagggggcgg 4200
agccaccctg tccatgcggg gtgtggggct tgccccgccg gtacagacag tgagcaccgg 4260
ggcacctagt cgcggatacc ccccctaggt atcggacacg taaccctccc atgtcgatgc 4320
aaatctttaa cattgagtac gggtaagctg gcacgcatag ccaagctagg cggccaccaa 4380
acaccactaa aaattaatag tccctagaca agacaaaccc ccgtgcgagc taccaactca 4440
tatgcacggg ggccacataa cccgaagggg tttcaattga caaccatagc actagctaag 4500
acaacgggca caacacccgc acaaactcgc actgcgcaac cccgcacaac atcgggtcta 4560
ggtaacactg agtaacactg aaatagaagt gaacacctct aaggaaccgc aggtcaatga 4620
gggttctaag gtcactcgcg ctagggcgtg gcgtaggcaa aacgtcatgt acaagatcac 4680
caatagtaag gctctggcgg ggtgccatag gtggcgcagg gacgaagctg ttgcggtgtc 4740
ctggtcgtct aacggtgctt cgcagtttga gggtctgcaa aactctcact ctcgctgggg 4800
gtcacctctg gctgaattgg aagtcatggg cgaacgccgc attgagctgg ctattgctac 4860
taagaatcac ttggcggcgg gtggcgcgct catgatgttt gtgggcactg ttcgacacaa 4920
ccgctcacag tcatttgcgc aggttgaagc gggtattaag actgcgtact cttcgatggt 4980
gaaaacatct cagtggaaga aagaacgtgc acggtacggg gtggagcaca cctatagtga 5040
ctatgaggtc acagactctt gggcgaacgg ttggcacttg caccgcaaca tgctgttgtt 5100
cttggatcgt ccactgtctg acgatgaact caaggcgttt gaggattcca tgttttcccg 5160
ctggtctgct ggtgtggtta aggccggtat ggacgcgcca ctgcgtgagc acggggtcaa 5220
acttgatcag gtgtctacct ggggtggaga cgctgcgaaa atggcaacct acctcgctaa 5280
gggcatgtct caggaactga ctggctccgc tactaaaacc gcgtctaagg ggtcgtacac 5340
gccgtttcag atgttggata tgttggccga tcaaagcgac gccggcgagg atatggacgc 5400
tgttttggtg gctcggtggc gtgagtatga ggttggttct aaaaacctgc gttcgtcctg 5460
gtcacgtggg gctaagcgtg ctttgggcat tgattacata gacgctgatg tacgtcgtga 5520
aatggaagaa gaactgtaca agctcgccgg tctggaagca ccggaacggg tcgaatcaac 5580
ccgcgttgct gttgctttgg tgaagcccga tgattggaaa ctgattcagt ctgatttcgc 5640
ggttaggcag tacgttctcg attgcgtgga taaggctaag gacgtggccg ctgcgcaacg 5700
tgtcgctaat gaggtgctgg caagtctggg tgtggattcc accccgtgca tgatcgttat 5760
ggatgatgtg gacttggacg cggttctgcc tactcatggg gacgctacta agcgtgatct 5820
gaatgcggcg gtgttcgcgg gtaatgagca gactattctt cgcacccact aaaagcggca 5880
taaaccccgt tcgatatttt gtgcgatgaa tttatggtca atgtcgcggg ggcaaactat 5940
gatgggtctt gttgttggcg tcccggaaaa cgattccgaa gcccaacctt tcatagaagg 6000
cggcggtgga atcgaaatct cgtgatggca ggttgggcgt cgcttggtcg gtcatttcga 6060
agggcaccaa taactgcctt aaaaaaatta cgccccgccc tgccactcat cgcagtactg 6120
ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca cagacggcat gatgaacctg 6180
aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca tggtgaaaac 6240
gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga aactcaccca 6300
gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat aggccaggtt 6360
ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga aatcgtcgtg 6420
gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg tgtaacaagg 6480
gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgga actccggatg 6540
agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt gcttattttt 6600
ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat aggtacattg 6660
agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata tatcaacggt 6720
ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa atctcgtcga 6780
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tccggatcgg tcaaatacgc tgccagctca tagaccgtat ccaaagcatc cggggctgat 6900
ccccggcgcc agggtggttt ttcttttcac cagtgagacg ggcaacagct gattgccctt 6960
caccgcctgg ccctgagaga gttgcagcaa gcggtccacg tggtttgccc cagcaggcga 7020
aaatcctgtt tgatggtg 7038
<210> 7
<211> 46
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(46)
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 8
gtgaagcaat accaccgaag tagttgattc agaagccatc acaaccaaac 50
<210> 9
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 9
gtttggttgt gatggcttct gaatcaacta cttcggtggt attgcttcac 50
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(46)
<400> 10
ggtacccggg gatcctctag attcagcaga aatcgagcca taagac 46
<210> 11
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(46)
<400> 11
acgacggcca gtgccaagct tgacatcata aatggtggct tttgag 46
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 12
agctgtttga atatttttac gccgcgtagg caaatggctt ggaaatactt 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(50)
<400> 13
aagtatttcc aagccatttg cctacgcggc gtaaaaatat tcaaacagct 50
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<212> DNA
<213> primer
<220>
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<222> (1)..(46)
<400> 14
ggtacccggg gatcctctag actgcaacaa tcaaaggcaa cataag 46
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
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<400> 15
ctgcaggtcg actctagagg atccatggca aagtacacta gagaagatat cg 52
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(52)
<400> 16
cgccaaaaca gccaagctga attcttaata ctgagacata tactgttcgc gt 52
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<213> primer
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<222> (1)..(49)
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<210> 18
<211> 49
<212> DNA
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<222> (1)..(49)
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cgccaaaaca gccaagctga attctgcctt gcatcgcgaa ttgtattaa 49
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<213> primer
<220>
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<222> (1)..(47)
<400> 19
cgagctcggt acccggggat ccacccacaa ggattcatca aatactc 47
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(51)
<400> 20
ccttcggatc taaacgatct gttaacatcc agcggttctc cattttgtat t 51
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(51)
<400> 21
aatacaaaat ggagaaccgc tggatgttaa cagatcgttt agatccgaag g 51
<210> 22
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<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(53)
<400> 22
gtgttgacag caaatttacg ttcacttaat actgagacat atactgttcg cgt 53
<210> 23
<211> 53
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(53)
<400> 23
acgcgaacag tatatgtctc agtattaagt gaacgtaaat ttgctgtcaa cac 53
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<211> 47
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(47)
<400> 24
ttgtaaaacg acggccagtg ccactgctac agggagtgca gtttcac 47
<210> 25
<211> 47
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(47)
<400> 25
cgagctcggt acccggggat ccaaaatcgg tgtcattacc ttcccag 47
<210> 26
<211> 51
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(51)
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ccttcggatc taaacgatct gttaaccagt ggtgttgttc tctacaacga g 51
<210> 27
<211> 51
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(51)
<400> 27
ctcgttgtag agaacaacac cactggttaa cagatcgttt agatccgaag g 51
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<212> DNA
<213> primer
<220>
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<400> 28
atctgctgac ccttttccaa agtgtttacc aattcatgta gcgttggc 48
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<211> 48
<212> DNA
<213> primer
<220>
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<222> (1)..(48)
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gccaacgcta catgaattgg taaacacttt ggaaaagggt cagcagat 48
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<213> primer
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<222> (1)..(47)
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ttgtaaaacg acggccagtg ccgaacagct ccaggccatc aatagat 47
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<213> primer
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<221> primer_bind
<222> (1)..(24)
<400> 31
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
Claims (10)
1.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株T-1，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶基因Ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株T-1。
2.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株T-2，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶Ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建出菌株T-2。
3.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株T-3，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：以谷氨酸棒杆菌CGMCCNo.1.16145为出发菌株，同时敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因，构建出菌株T-3。
4.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株T-4，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株T-3的基础上，在基因组Ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu，构建出菌株T-4。
5.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株T-5，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株T-4的基础上，在基因组Ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAlcb，构建出菌株T-5。
6.一种高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株，其特征在于：为谷氨酸棒杆菌菌株T-6，是通过菌株CGMCC No.1.16145改造得到的，获得方法如下：在菌株T-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pXT01质粒，将来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu插入pXT01质粒，构建质粒pXT01-glnAbsu，并将pXT01-glnAbsu电转化进入菌株T-5，构建出菌株T-6。
7.权利要求1-6所述高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酸合酶基因Ncgl0181，阻断谷氨酰胺与α-酮戊二酸生成两分子谷氨酸，构建出菌株T-1；
(2)以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，敲除谷氨酰胺酶Ncgl2395基因，阻断谷氨酰胺生成谷氨酸，构建菌株T-2；
(3)以谷氨酸棒杆菌CGMCC No.1.16145为出发菌株，同时敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因，构建菌株T-3，通过发酵实验分析敲除Ncgl0181和Ncgl2395基因对谷氨酰胺发酵的影响；
(4)在菌株T-3的基础上，在基因组Ncgl0182位点上整合了一拷贝的来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu，构建菌株T-4；在菌株T-4的基础上，在基因组Ncgl2500位点上整合了一拷贝的来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAlcb，构建菌株T-5；
(5)在菌株T-5的基础上，使用带有tuf强启动子的pXT01质粒，将来自枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnAbsu插入pXT01质粒，构建质粒pXT01-glnAbsu，并将pXT01-glnAbsu电转化进入菌株T-5，构建出菌株T-6。
8.权利要求1-6所述谷氨酸棒杆菌菌株生产L-谷氨酰胺的应用，其特征在于：具体发酵生产方法如下：
(1)将谷氨酸棒杆菌菌株T-1～T-6中任一菌株从-80℃的20％甘油保菌管接入斜面活化培养，培养条件为32℃、12h；
(2)一级种子摇瓶定容种子培养基100mL，32℃，pH 7.0，220rmp/min，摇床培养10h；
(3)发酵罐二级种子培养，一级种子液全部接入5L发酵罐内进行二级种子培养，培养基定容2L，34℃，pH7.0，溶氧30-50％，培养至OD600达到40；
(4)发酵罐发酵培养，接种量20％，培养基定容3L，34℃，溶氧30-50％。
9.根据权利要求8所述的高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，其特征在于：采用的种子培养基为：葡萄糖25g/L，玉米浆干粉15g/L，豆浓15ml/L，K2HPO4·3H2O 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L。
10.根据权利要求8所述的高产L-谷氨酰胺的谷氨酸棒杆菌菌株的应用，其特征在于：采用的发酵培养基为：K2HPO4·3H2O 1.8g/L，VB1 0.1mg/L，豆浓10ml/L，玉米浆干粉4g/L，MnSO4·H2O 10mg/L，FeSO4 10mg/L，ZnSO45mg/L，MgSO4·7H2O 1g/L，(NH4)2SO4 60g/L。
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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|---|---|---|---|---|
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