CN107603938A - 过表达异源谷氨酰胺合成酶的基因工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌及其构建方法。合成并优化来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA；通过酶切连接的方法，将基因glnA连接在大肠杆菌‑谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA；将表达载体pXMJ19glnA导入谷氨酸棒杆菌GM34或谷氨酸棒杆菌TP607，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA或TP607/pXMJ19glnA。本发明所述基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶，显著提高了L‑谷氨酰胺的产量。同时在L‑色氨酸生产菌中过表达该酶，L‑色氨酸产量显著提高。

Description

过表达异源谷氨酰胺合成酶的基因工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒状杆菌基因工程菌及其构建方法与应用，属于微生物代谢调控和基因工程技术领域。

背景技术

细胞内一些重要的酶促反应依赖L-谷氨酰胺提供氨基供体转氨反应，L-谷氨酰胺脱氨基后生成L-谷氨酸。L-谷氨酰胺的再生是通过谷氨酰胺合成酶催化L-谷氨酸和铵盐反应来完成的。细胞内L-色氨酸、氨基葡萄糖、透明质酸等的合成涉及谷氨酰胺转氨反应，其大量积累需要L-谷氨酰胺的快速合成。

然而，谷氨酰胺合成酶会发生腺苷酰化现象，导致其酶活急剧降低。AMP以共价键方式与谷氨酰胺合成酶肽链上的酪氨酸残基(Tyr)结合使得其发生腺苷酰化反应，进而使谷氨酰胺合成酶活性降低甚至丧失。在铵盐极大程度地超过需求量时，腺苷酰化程度加强，谷氨酰胺合成酶活性下降甚至失活，但L-谷氨酰胺的生成又不可缺少铵盐供应。此外，在氨基酸、有机酸等发酵过程中，由于胞内产物积累导致pH下降，此时常规微生物谷氨酰胺合成酶的酶活较低。目前，L-谷氨酰胺的生成菌株由于谷氨酰胺合成酶会发生腺苷酰化的现象，其活力会急剧降低，严重限制了L-谷氨酰胺的合成和生产。因此，寻求高活性谷氨酰胺合成酶来强化细胞内L-谷氨酰胺的再生，在生物合成L-色氨酸等产品中具有重要的应用价值。专利申请CN 106635946A公开了一种谷氨酸棒杆菌，具有L-谷氨酰胺生产能力并且其细胞内编码腺苷酰基转移酶的glnE基因和编码谷氨酰胺酶的glsA基因被敲除。专利申请CN1884501A公开了一种可解除腺苷酰化修饰作用的谷氨酰胺合成酶，是自氨基端第405位氨基酸残基突变为L-苯丙氨酸的谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的谷氨酰胺合成酶。专利申请CN 1550546A公开了一种具有L-精氨酸或L-赖氨酸生产能力的棒杆菌，该棒状杆菌经过修饰，使其通过腺苷酰化对谷氨酰胺合成酶的活性调节作用被减少或消除，使其谷氨酰胺合成酶的活性得到提高。

发明内容

本发明目的是提供一种过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌。

本发明技术方案如下：

所述谷氨酰胺合成酶来源于嗜酸乳杆菌，由基因glnA编码，在GENEBANK上的编号为3251394。本发明在谷氨酸棒杆菌基因工程菌中过表达来自嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶。为了保证该异源基因的表达水平，在蛋白质氨基酸序列保持不变的前提下，对该异源基因进行了密码子优化，优化前后的基因序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明的克隆载体为pUC57，该载体用来保存合成基因glnA。

本发明的表达载体为pXMJ19，该载体是大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型载体，自身包含tac启动子同时该启动子受IPTG诱导。

本发明的宿主细胞为谷氨酸棒杆菌GM34，该菌株是一株L-谷氨酰胺产生菌株。

本发明的另一宿主细胞为谷氨酸棒杆菌TP607，该菌株是一株L-色氨酸产生菌株。

本发明谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据Genbank ID：3151394，合成并优化来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA；

(2)通过酶切连接的方法，将基因glnA连接在大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA；

(3)将表达载体pXMJ19glnA导入谷氨酸棒杆菌GM34，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA；

(4)通过酶切连接的方法，将谷氨酸棒杆菌自身的谷氨酰胺合成酶基因glnA1连接在大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA1；

(5)将表达载体pXMJ19glnA1和对照载体pXMJ19导入谷氨酸棒杆菌GM34，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19；

(6)将表达载体pXMJ19glnA和对照载体pXMJ19导入谷氨酸棒杆菌TP607，构建基因工程重组菌TP607/pXMJ19glnA和TP607/pXMJ19。

本发明构建基因工程菌的应用：

基因工程菌合成谷氨酰胺合成酶应用于发酵法和酶法生产L-谷氨酰胺，以及强化发酵过程中细胞内的转氨反应，有利于L-色氨酸等产品的生产。

基因工程菌合成谷氨酰胺合成酶应用于酶法和发酵法生产L-谷氨酰胺，同时也能够应用于L-色氨酸、氨基葡萄糖和透明质酸等产品的生产。

本发明所述基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶，显著提高了L-谷氨酰胺的产量。同时在L-色氨酸生产菌中过表达该酶，L-色氨酸产量显著提高。

本发明具有如下优点和有益效果：

(1)据本发明，在谷氨酸棒杆菌GM34中分别过表达内源和来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶得到菌株GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19glnA，在pH 5.0，pH 6.0，pH 7.0条件下，分别测定谷氨酸棒杆菌GM34、GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺合成酶的酶活。发现在pH 7.0条件下，3株菌的谷氨酰胺合成酶活最高，其中过表达内源谷氨酰胺合成酶菌株的酶活比出发菌GM34的酶活略高，而GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺合成酶的酶活是菌株GM34/pXMJ19glnA1的3.9倍。此外，3株菌谷氨酰胺合成酶的酶活随着pH的降低而减小，其中菌株GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺合成酶的酶活分别是GM34/pXMJ19glnA1酶活的3.8倍(pH 6.0)和4.5倍(pH 5.0)。说明来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶无论是在中性条件还是酸性条件下，均显著高于谷氨酸棒杆菌自身的酶活。

(2)GM34/pXMJ19glnA和GM34/pXMJ19分别进行5L发酵罐补料分批发酵，发酵时间到48h，发现过表达嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶的菌株GM34/pXMJ19glnA L-谷氨酰胺的产量达到39±1g/L，是原菌株GM34/pXMJ19(29±1g/L)的1.34倍。

(3)对菌株TP607/pXMJ19glnA和TP607/pXMJ19分别进行摇瓶发酵，发酵时间48h，发现过表达嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶的菌株GM34/pXMJ19glnA L-色氨酸产量达到11.4±0.20g/L，是原菌株TP607/pXMJ19(8.0±0.15g/L)的1.43倍。

附图说明

图1：pXMJ19glnA单双酶切凝胶电泳验证；其中，M:1 kb DNA marker；1:pXMJ19glnA双酶切产物；2：pXMJ19glnA单酶切产物。

图2：不同浓度蛋白质的标准曲线。

图3：不同pH下3菌株谷氨酰胺合成酶的酶活。

图4：HPLC测定L-谷氨酰胺标准曲线。

图5：谷氨酸棒杆菌GM34/pXMJ19谷氨酰胺发酵过程曲线。

图6：谷氨酸棒杆菌GM34/pXMJ19glnA谷氨酰胺发酵过程曲线。

图7：谷氨酸棒杆菌TP607/pXMJ19和TP607/pXMJ19glnA L-色氨酸摇瓶发酵结果。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

实施例1：重组菌GM34/pXMJ19glnA、GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19，以及TP607/pXMJ19glnA和TP607/pXMJ19的构建

1.过表达载体pXMJ19glnA的构建

(1)glnA基因合成

根据NCBI中的GENBANK上公布的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)谷氨酰胺合成酶编码基因序列(Gene ID:3251394)，用谷氨酸棒杆菌中常用密码子软件对其进行密码子优化(密码子优化前后的序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示)，使其可以在谷氨酸棒杆菌中可以高效转录。将优化后序列送到金唯智公司进行合成，得到带有glnA基因的重组质粒pUC57glnA，其中酶切位点为Hind III和BamH I，其保存在大肠杆菌中。

(2)酶切

将带有基因glnA的载体pUC57glnA和大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭质粒pXMJ19，使用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切，酶切反应体系见表1，酶切时间0.5-1h，酶切温度37℃。

表1双酶切体系

(3)目的片段glnA和线性化载体pXMJ19回收

载体pUC57glnA通过HindIII和BamHI双酶切后，为目的片段glnA和线性化载体pUC57，其中glnA基因大小1350bp，线性化载体pUC57为2458bp。为得到目的片段glnA，需要进行切胶回收。

pXMJ19酶切回收体系直接系采用液相回收纯化DNA试剂盒回收。

(4)Solution I连接

连接反应体系10μL：目的片段glnA与线性化载体pXMJ19测定核酸浓度后加入体系中，摩尔比为3:1-9:1之间，Solution I连接酶5μL，其余用去离子水补齐。连接反应条件：16℃，4h。

(5)连接体系的转化与鉴定

用CaCl₂法将上述连接体系转化入大肠杆菌DH5α化转感受态细胞，放在37℃培养箱培养12h左右后，通过氯霉素抗性平板筛选出阳性转化子。菌落PCR鉴定阳性转化子，引物采用pXMJ19的鉴定引物见表2。将阳性转化子转接到带有氯霉素抗性的摇管中培养12h左右，碱性裂解法提取质粒pXMJ19glnA，进行质粒的酶切鉴定见图1，并将提取的质粒送到金唯智公司进行测序。

表2引物序列

注：“____”标注的为酶切位点

2.过表达载体pXMJ19glnA1的构建

(1)glnA1片段扩增和回收

根据GENBANK上公布的谷氨酸棒杆菌的谷氨酰胺合成酶的编码基因(NCgl2133)的序列，设计引物glnA1-F和glnA1-R(见表2)，以Corynebacterium glutamicum ATCC 13032基因组为模板，使用TaKaRa公司的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，扩增片段glnA1，该片段大小为1434bp。使用液相回收纯化DNA试剂盒回收PCR片段。

(2)酶切(方法同上述载体pXMJ19glnA的构建)。

(3)目的片段glnA1和载体pXMJ19的回收(方法同上述载体pXMJ19glnA的构建)。

(4)Solution I连接(方法同上述载体pXMJ19glnA的构建)

(5)连接体系的转化与鉴定(方法同上述载体pXMJ19glnA的构建)。

3.谷氨酸棒杆菌GM34和TP607电转化感受态细胞的制备

(1)从-80℃甘油保菌管中用接种针挑取谷氨酸棒杆菌，在LB平板培养基上三区划线，放于32℃培养箱中，过夜培养。

(2)在划线平板培养基上挑取单菌落，接种到5mL的BHIS培养基试管中，30℃，200rpm培养12-14h。

(3)按1％接种量转接到装液量为100mL BHIS培养基(含150μL Tween 80和2.5g甘氨酸)的500mL圆底瓶中，在18℃低温条件下以160rpm培养至少18h开始测定OD600值。

(4)待OD600大约在0.5-0.7之间时放于冰上静置20min。

(5)在超净台中，将菌液收集到50mL离心管中，4℃，6500rpm，离心10min，弃上清。

(6)用50mL预冷的10％甘油重悬洗菌，4℃，6500rpm，离心10min，弃上清，重复洗三次。

(7)用2mL预冷的10％甘油将菌体重悬，用预冷的EP管，100μL/管分装，备注感受态名称、制作时间，-80℃保存备用。

BHIS培养基(g/L)：Brain-Heart Infusion(脑心浸提物)37，Sorbitol(山梨醇)91，pH 7.0～7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。

4.电转化和阳性转化子的鉴定

(1)分别将质粒pXMJ19glnA、pXMJ19glnA1和pXMJ19，各约200ng左右，加到100μLGM34电转化感受态细胞中，混匀后加到2mm预冷的电转化杯中；分别将质粒pXMJ19glnA和pXMJ19(各约200ng左右)，加到100μL TP607电转化感受态细胞中，混匀后加到2mm预冷的电转化杯中；

(2)电压2.5KV，电容25μF，电阻200Ω，电击5ms，加入800μL BHIS复苏液，立即放入46℃水浴锅热激6min；

(3)将菌液放在32℃，200rpm摇床上复苏2h；

(4)取适量菌液涂布含有10ug/mL氯霉素的BHIS平板，32℃培养箱倒置培养24h以上；

(5)待平板上长出菌落，从平板上挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定引物见表2，挑取阳性转化子即得到目的菌株GM34/pXMJ19glnA、GM34/pXMJ19glnA1和GM34/pXMJ19，以及TP607/pXMJ19glnA和TP607/pXMJ19。

实施例2:谷氨酰胺合成酶酶活的测定

1.粗酶液中蛋白质浓度的测定

(1)菌体的培养和表达

用平板划线法将-80℃保藏的菌株谷氨酸棒杆菌GM34和GM34/pXMJ19glnA接种在丰富营养的培养皿上(其中菌株GM34/pXMJ19glnA带有氯霉素抗性)，32℃恒温培养24h，挑取生长良好的单菌落接种到含有相应的斜面培养基上，32℃恒温培养24h，挑取一环转接二代斜面培养基，32℃恒温培养12h，将其刮下接到装液量为30mL的圆底锥形瓶中，32℃摇床，200rpm培养。在摇瓶培养至OD₆₀₀为12-15时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导重组质粒表达(其中菌株GM34不加IPTG)。

(2)细胞破碎制备粗酶液

液氮研磨法：20mL菌液4℃6000rpm离心10min，用0.7％的生理盐水洗菌体2次，得到菌体细胞沉淀。用液氮将研钵预冷后加入一定量的石英砂和菌体沉淀，研磨2min，期间液氮耗尽前及时补加液氮，最后得到研磨完全的菌体碎片，用去离子水重悬，轻度离心1min，吸取的上清即为粗酶液，放置于-20℃冰箱保藏。

(3)粗酶液蛋白质浓度测定

使用蛋白定量方法Bicinchoninic acid法测定蛋白含量，采用普利莱公司的蛋白质定量试剂盒用来测量。试剂盒中的Cu²⁺在碱性环境下，可以被蛋白质还原成Cu⁺(biuretreaction)，然后Cu⁺和独特的BCA Solution A相互作用发生颜色反应，在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内具有很好的线性关系，因此可据此测定蛋白质浓度。

工作溶液的配制：根据说明书将50倍于Cu体积的BCA Reagent与1体积Cu Reagent混合即得WR工作溶液。

配制标准蛋白溶液：用去离子水对试剂盒中的BSA standard(4mg/mL)进行稀释，得到1600、800、400、200、100、50、25μg/mL，各管均50μL。

蛋白浓度测定：使用标准比色杯测定方案，反应终体积为1.05mL。将0.05mL标准品和1mL WR混合，37℃反应30min，将反应管冷却至室温后用分光光度计测定562nm的OD值。根据上面的测量值绘制标准曲线见图2，用Excel拟合曲线即可计算出各管实验样品各自的浓度。

本发明使用普利莱公司生产的蛋白质定量试剂盒(BCA法)对待测蛋白样品进行测定。首先测定标准样品各个浓度的OD562值，根据做出对应浓度的标准曲线图(图2)。之后根据待测样品反应后的OD562确定其蛋白浓度，即可确定下一步加入酶促反应液中的粗酶液体积。

经研磨破碎细胞后得到的粗酶液中的蛋白浓度各不相同，为保证酶活性测定时各个反应体系管加入的蛋白量一致，需要对蛋白浓度加以测定。本论文使用普利莱公司生产的蛋白质定量试剂盒(BCA法)对待测蛋白样品进行测定。首先测定标准样品各个浓度的OD₅₆₂值，根据做出对应浓度的标准曲线图。之后根据待测样品反应后的OD₅₆₂确定其蛋白浓度，即可确定下一步加入酶促反应液中的粗酶液体积，本实验中加入各反应体系的均为40.9mg蛋白。

2.谷氨酰胺合成酶酶活的测定方法

(1)反应试剂

硫酸亚铁终止试剂：2mL浓硫酸溶于480mL蒸馏水，即成0.015mol/L硫酸溶液，称取3.84g FeSO₄.7H₂O溶于上述溶液中，即成浓度0.8％(m/v)终止试剂；

钼酸铵显色试剂：称取6.6g钼酸铵溶液7.7mol/L硫酸中，定容到100mL，即成6.6％的钼酸铵溶液；

表3底物-二倍反应液成分

(3)酶活测定

取0.2mL二倍反应液(表3)于试管中，37℃温育5min，加入0.2mL经适当稀释的溶液(使反应所产生的无机磷酸在1.0μmoL左右)，37℃水浴锅中温育15min(以0.2mL ddH₂O作对照)，立即加入3.6mL FeSO₄终止液终止反应，再加入钼酸铵显色剂0.3mL振荡显色1min，于OD₆₆₀处比色。酶活力单位定义为每10min催化形成1.0μmol的无机磷酸所需的酶量。根据该测量值绘制标准曲线，X轴为各标准管对应的OD₆₆₀值，Y轴为对应的酶活力值，用Excel拟合曲线并计算各管待测样品对应的酶活力。

3.不同pH下谷氨酰胺合成酶活性的测定

对比不同pH条件下菌株GM34、GM34/pXMJ19glnA1与GM34/pXMJ19glnA的谷氨酰胺合成酶的酶活力。在摇瓶培养至20倍稀释的OD₆₀₀约为0.6～0.8左右时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导重组质粒表达，诱导30h后，提取粗酶液测定谷氨酰胺酶活。谷氨酰胺合成酶的活力对比如图3所示。

从图3可知，过表达内源谷氨酰胺合成酶的菌株GM43/pXMJ19glnA1与原菌GM43相比，谷氨酰胺合成酶酶活变化不大，而在相同条件下表达来源于嗜酸乳杆菌谷氨酰胺合成酶菌株GM43/pXMJ19glnA的酶活力均显著高于其他两株菌。在pH 7.0条件下，菌株GM34/pXMJ19glnA和GM34/pXMJ19glnA1的谷氨酰胺合成酶活性分别为620mU和160mU。在酸性条件下，二者的酶活力均出现下降，但菌株GM34/pXMJ19glnA酶活性仍然分别是GM34/pXMJ19glnA1的3.8倍(pH 6.0)和4.5倍(pH 5.0)。

实施例3：L-谷氨酰胺的发酵罐补料分批发酵

1.培养基

(1)活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖1.0，蛋白胨10，牛肉膏10，NaCl 2.5，酵母浸出粉5，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.4，琼脂条25，pH 7.0-7.2。

(2)种子罐培养基(g/L)：口服葡萄糖25，玉米浆25mL/L，KH₂PO₄ 2.2，V_B1 0.01，酵母浸出粉3，硫酸镁0.9，尿素0.3％。

(3)5L罐发酵培养基(g/L)：玉米浆3mL/L，豆粕水解液20mL/L，KH₂PO₄ 1.5，初始葡萄糖100，V_B1 0.013，MnSO₄ 0.01，FeSO₄ 0.01，ZnSO₄ 0.01，MgSO₄ 1.6，(NH₄)₂SO₄ 30，pH7.0-7.2。

2.L-谷氨酰胺的测定

(1)衍生方法：取经处理后的发酵液1mL，12,000r/min离心3min，取上清液过滤膜。取过膜后的发酵液适量于50mL棕色容量瓶中，加入已经配制好的衍生缓冲溶液5mL，摇匀后再加入衍生试剂溶液5mL，摇匀，将容量瓶置于60℃水浴中暗处恒温加热1h后取出，放置待溶液了冷却至室温后，加入定容缓冲液稀释至刻度并摇匀，放置15min后可以开始进行色谱分离。

(2)色谱条件：色谱柱为Kromasil C18柱(250mm×460mm,5μm)，流动相A为100％的乙腈溶液，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液，流速1.0mL/min，柱温33℃，检测波长360nm，进样量设定为20μL。

(3)标准曲线的绘制

分别取L-谷氨酰胺浓度为5g/L，10g/L，15g/L，20g/L，25g/L，30g/L的标准样品，按照上述方法测定。标准曲线如图4所示。

3.发酵条件

(1)摇瓶种子培养

菌种活化：用接种环从菌种保藏管中取一环划线接种于活化斜面，32℃恒温静置培养20～24h，即可得到一代活化斜面。然后取该斜面上菌体一小环接种于另一支空白斜面上，32℃恒温静置培养12h，即为生长状况良好的二代斜面。

种子培养：取上一步活化较好的斜面试管1支，用接种环将斜面表层菌体刮取干净到装液量为60mL种子培养基的1000mL圆底三角瓶中，使用灭菌后的纱布将瓶口缠好，放于往复旋转式摇床上，200rpm，32℃振荡培养7h。

(2)发酵罐培养

按10％接种量将上一步的摇瓶种子液接入初始装液量为3L的5L发酵罐中；开始时通风为2L/min；搅拌转速150rpm并随DO向上调节；转型之前时期为菌体生长阶段，溶氧控制在30％左右，pH控制在7.2以上，向发酵液中流加40％氨水调节pH；发酵时间到达6h后，每30min取样，经生物传感仪SBA-40C测得发酵液中产生3g/L的谷氨酸时，停止向发酵罐中补加氨水，使pH由7.2自然降至5.8～6.0，一次性添加2％硫酸铵，此为转型期。转型后即为发酵产酸阶段，该时段内将pH控制在6.0以下，溶氧控制在15％左右，产酸期时还需要向发酵罐中流加硫酸铵进罐以保证铵的供给，发酵液中残余葡萄糖保持在5g/L～20g/L。

4.发酵罐发酵结果

(1)对照菌株GM34/pXMJ19发酵情况

谷氨酸棒杆菌GM34/pXMJ19可利用葡萄糖生产L-谷氨酰胺，实验使用浓度为10％(重量/体积)的初始葡萄糖为初始发酵培养基进行5L发酵罐发酵，实验过程监测菌体生长、葡萄糖、L-谷氨酰胺以及主要副产物L-谷氨酸浓度。在8h内，GM34/pXMJ19菌株的OD₆₀₀达到81(见图5)。当在发酵液中检测出有3g/L的L-谷氨酸时，停止加入氨水，使发酵液pH自然降低到6.0。在此之后将细胞倾向于缓慢生长和开始高速合成L-谷氨酰胺。发酵时间48h，最终L-谷氨酰胺产量达到了29g/L，同时L-谷氨酸达到20g/L。

(2)重组菌株GM34/pXMJ19glnA发酵情况

为了提高L-谷氨酰胺的积累量，降低副产物L-谷氨酸的浓度，实验对菌株GM34/pXMJ19glnA进行了补料分批培养。GM34/pXMJ19glnA最终副产物L-谷氨酸进一步下降至13g/L，表明从嗜酸乳杆菌体内导入的谷氨酰胺合成酶在谷氨酸棒杆菌中功能正常。

当进行补料分批发酵研究时，在生长阶段给予充足的氧气情况下，谷氨酸棒杆菌GM34/pXMJ19glnA在16h内的最大OD₆₀₀增长到约57。发酵时间到48h，谷氨酸棒杆菌GM34/pXMJ19glnA产生大约39g/L的L-谷氨酰胺和13g/L的L-谷氨酸(见图6)，其Y_P/S为0.096，说明每摩尔的葡萄糖产生0.096mol L-谷氨酰胺；其产品生产率为3.25mmol h^-1。

将重组菌GM34/pXMJ19glnA与对照菌株GM34/pXMJ19在补料分批发酵过程中取得的结果相比较时，其菌体生长时增长率以及每摩尔葡萄糖所产生的生物量较低。然而，重组菌GM34/pXMJ19glnA的L-谷氨酰胺产量高于对照菌株，并且L-谷氨酸降低到原始水平的60％左右。

实施例4：L-色氨酸摇瓶发酵

1.菌种活化

斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，32℃培养12h，并传代一次。

活化培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏10，酵母粉5，NaCl 2.5，玉米浆15mL/L，琼脂25，pH 7.0-7.2，灭菌条件：121℃、20min。

2.种子培养

种子培养：使用500mL三角瓶培养种子，装液量为30mL，菌种使用二代斜面，接种方法为用接种环刮取二代斜面种子，转移到相应的种子培养基中。培养温度32℃，pH 7.0±0.2，转速200rpm，培养时间12h，菌体生物量OD₆₀₀达到10±2左右，接种到发酵培养基中。

种子培养基(g/L)：葡萄糖35，酵母粉5，玉米浆60mL/L，豆粕水解液20mL/L，KH₂PO₄1.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，V_B1 0.001，pH 7.0-7.2，灭菌条件：121℃、20min。

3.摇瓶发酵培养

发酵培养：采用摇瓶培养，使用500mL挡板瓶，装液量30mL，接种量为10％，接种方法为使用5mL无菌移液管吸取3mL培养好的种子，接种到发酵培养基中。培养条件为培养温度32℃，转速200rpm，pH 7.0±0.2使用氨水调节pH，发酵周期为36h。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，玉米浆25mL/L，豆粕水解液25mL/L，(NH₄)₂SO₄ 3，KH₂PO₄ 2.2，MgSO₄ 0.7，FeSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，V_B1 0.001，pH 7.0-7.2，灭菌条件：121℃，20min。

4.L-色氨酸产量的测定

使用HPLC测定。检测条件为：仪器Agilent 1100高效液相色谱仪；色谱柱Phenomenex Gemini 5u C18(150*4.6mm，美国菲罗门公司)；流动相：流动相A(50％乙腈)和流动相B(4.1％乙酸钠)；柱温33℃；检测波长360nm；流速1.0m L/min，梯度洗脱。

5.摇瓶发酵结果

为了展示嗜酸乳杆菌来源的谷氨酰胺合成酶在发酵合成其他产品中的作用，以L-色氨酸生产为例进行了研究。将重组质粒pXMJ19glnA和空质粒pXMJ19分别导入谷氨酸棒杆菌TP607。对两菌株进行摇瓶培养36h后，取样测定培养基中L-色氨酸积累量，如图7。过表达谷氨酸合成酶的菌株的L-色氨酸产量比对照菌株高出43.5％。以上结果说明，对L-色氨酸这类在合成过程中需要L-谷氨酰胺作为氨基供体的产品，过表达嗜酸乳杆菌来源的谷氨酰胺合成酶具有重要的作用。

虽然上述已公开了本发明较佳的实施方式，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的为准。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 过表达异源谷氨酰胺合成酶的基因工程菌及其构建方法

<141> 2017-10-30

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1353

<212> DNA

<213> 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)

<400> 1

aggtggataa atactatgag taaacaatac actgcagaag aaattaaaac agaagttgaa 60

gataagaacg ttagattttt acgtttatgc ttcactgata ttaacggtac tgaaaaggca 120

gttgaagtac caactagtca attagataaa gtattgacca acgacattcg ctttgacgga 180

tcatcaattg atggatttgt tcgtcttgaa gaaagtgaca tggttctata tccagacttt 240

tcaacttggt cagtattacc atggggtgat gaacacggcg gcaagatcgg tcgtttgatt 300

tgttcagttc acacaactga tggtaaagct tttgcaggtg atccaagaaa taacttgaaa 360

cgagttattg gtgaaatgga aaatgcaggc tttgatgcat ttgacattgg ttttgaaatg 420

gaattccacc tcttcaagtt agatgataat ggtaactgga ctactgaagt tccagatcac 480

gcttcatact ttgatatgac ttcagatgat gaaggtgcac gctgccgtcg tgaaattgtt 540

gaaactttgg aagatatggg ctttgaagtt gaagctgctc accacgaagt aggtgatggt 600

caacaagaaa ttgactttag attcgacaat gctttagcaa ctgctgatag atgccaaacc 660

tttaagatgg ttgctcgcac cattgctaga aaacacggtt tgtttgctac atttatggct 720

aagcctcttg aaggtcaagc tggtaacggg atgcacaaca acatgtcact ctttaagggt 780

aagaagaacg tattctacga caaagatggt gaattccacc tttcagatac tgctctttat 840

ttcttgaatg gtattttgga acatgctcgt gcaattactg caattggtaa cccaactgtt 900

aactcataca agcgtttaat tccaggttac gaagcacctt gttacattgc ttgggctgct 960

aagaaccgtt caccacttgt tcgtattcca agtgctggtg aaattaacac tcgtttggaa 1020

atgcgttcag ctgatccaac tgctaaccca tacttattac ttgctgcatg tttaactgct 1080

ggtttaaacg gtattaagga acaaaagatg ccaatgaagc cagttgaaga aaacatcttt 1140

gaaatgactg aagaagaaag agcaaagaag ggtattaagc cattaccaac tactcttcac 1200

aacgcagtta aggcatttaa ggaagatgat ttaattaaga gtgcattagg tgatcactta 1260

actcgcagct ttattgaatc caaggaattg gaatggtcta agtattcaca atcagtttca 1320

gattgggaac gtcaacgtta catgaactgg taa 1353

<210> 2

<211> 1353

<212> DNA

<213> 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)

<400> 2

gggaacgagg aaatcatgtc caaacagtac accgccgagg agattaagac cgaagtcgag 60

gataagaatg tgcgctttct ccgcctgtgc tttaccgaca tcaacggcac cgagaaagca 120

gtggaggtcc ctacctccca gctggacaag gtcctgacca acgacatccg cttcgatggc 180

tcttctatcg acggcttcgt gcgcctcgaa gagtccgaca tggtcctgta cccagatttc 240

tccacctggt ccgtgctgcc atggggcgat gaacacggcg gtaagatcgg ccgcctcatc 300

tgttccgtgc acaccaccga cggcaaggca ttcgcaggtg atccacgcaa caacctcaaa 360

cgcgtgatcg gcgaaatgga aaacgccggc ttcgatgcct tcgatattgg tttcgagatg 420

gagtttcacc tgttcaagct ggacgacaac ggcaactgga ctaccgaggt gccagatcac 480

gcatcctact tcgacatgac ctctgatgat gaaggcgcac gctgccgccg tgagatcgtg 540

gagaccctgg aggatatggg tttcgaagtg gaagccgccc accatgaagt cggcgatggc 600

cagcaggaaa tcgacttccg cttcgataac gccctggcaa ccgccgatcg ctgccagacc 660

ttcaagatgg tggcccgcac tattgcacgc aagcatggcc tcttcgcaac cttcatggcc 720

aagccactgg agggtcaggc cggtaacggc atgcacaaca atatgtctct cttcaagggt 780

aagaaaaacg tgttctacga caaggatggc gagttccacc tgtccgacac cgccctgtac 840

tttctgaacg gcatcctgga gcacgcccgc gcaattactg ccatcggcaa cccaaccgta 900

aacagctaca agcgcctcat ccctggttac gaagcaccat gctatatcgc ctgggccgca 960

aagaaccgct ctccactcgt gcgtatccca tccgcaggcg aaatcaacac ccgcctggaa 1020

atgcgctccg cagatccaac cgccaatcca tacctgctgc tcgccgcatg cctcacggcg 1080

gggctgaacg gtattaagga gcagaaaatg cctatgaagc cagtggagga gaacatcttc 1140

gagatgaccg aagaggaacg cgccaagaag ggcatcaagc cactgcctac taccctccac 1200

aatgccgtca aagccttcaa ggaggacgat ctcatcaagt ccgcactggg tgatcacctg 1260

acccgctctt ttatcgagtc caaggagctg gagtggtcca aatactccca gtccgtgtcc 1320

gactgggaac gccaacgcta catgaattgg taa 1353

<210> 3

<211> 445

<212> PRT

<213> 嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)

<400> 3

Met Ser Lys Gln Tyr Thr Ala Glu Glu Ile Lys Thr Glu Val Glu Asp

1 5 10 15

Lys Asn Val Arg Phe Leu Arg Leu Cys Phe Thr Asp Ile Asn Gly Thr

20 25 30

Glu Lys Ala Val Glu Val Pro Thr Ser Gln Leu Asp Lys Val Leu Thr

35 40 45

Asn Asp Ile Arg Phe Asp Gly Ser Ser Ile Asp Gly Phe Val Arg Leu

50 55 60

Glu Glu Ser Asp Met Val Leu Tyr Pro Asp Phe Ser Thr Trp Ser Val

65 70 75 80

Leu Pro Trp Gly Asp Glu His Gly Gly Lys Ile Gly Arg Leu Ile Cys

85 90 95

Ser Val His Thr Thr Asp Gly Lys Ala Phe Ala Gly Asp Pro Arg Asn

100 105 110

Asn Leu Lys Arg Val Ile Gly Glu Met Glu Asn Ala Gly Phe Asp Ala

115 120 125

Phe Asp Ile Gly Phe Glu Met Glu Phe His Leu Phe Lys Leu Asp Asp

130 135 140

Asn Gly Asn Trp Thr Thr Glu Val Pro Asp His Ala Ser Tyr Phe Asp

145 150 155 160

Met Thr Ser Asp Asp Glu Gly Ala Arg Cys Arg Arg Glu Ile Val Glu

165 170 175

Thr Leu Glu Asp Met Gly Phe Glu Val Glu Ala Ala His His Glu Val

180 185 190

Gly Asp Gly Gln Gln Glu Ile Asp Phe Arg Phe Asp Asn Ala Leu Ala

195 200 205

Thr Ala Asp Arg Cys Gln Thr Phe Lys Met Val Ala Arg Thr Ile Ala

210 215 220

Arg Lys His Gly Leu Phe Ala Thr Phe Met Ala Lys Pro Leu Glu Gly

225 230 235 240

Gln Ala Gly Asn Gly Met His Asn Asn Met Ser Leu Phe Lys Gly Lys

245 250 255

Lys Asn Val Phe Tyr Asp Lys Asp Gly Glu Phe His Leu Ser Asp Thr

260 265 270

Ala Leu Tyr Phe Leu Asn Gly Ile Leu Glu His Ala Arg Ala Ile Thr

275 280 285

Ala Ile Gly Asn Pro Thr Val Asn Ser Tyr Lys Arg Leu Ile Pro Gly

290 295 300

Tyr Glu Ala Pro Cys Tyr Ile Ala Trp Ala Ala Lys Asn Arg Ser Pro

305 310 315 320

Leu Val Arg Ile Pro Ser Ala Gly Glu Ile Asn Thr Arg Leu Glu Met

325 330 335

Arg Ser Ala Asp Pro Thr Ala Asn Pro Tyr Leu Leu Leu Ala Ala Cys

340 345 350

Leu Thr Ala Gly Leu Asn Gly Ile Lys Glu Gln Lys Met Pro Met Lys

355 360 365

Pro Val Glu Glu Asn Ile Phe Glu Met Thr Glu Glu Glu Arg Ala Lys

370 375 380

Lys Gly Ile Lys Pro Leu Pro Thr Thr Leu His Asn Ala Val Lys Ala

385 390 395 400

Phe Lys Glu Asp Asp Leu Ile Lys Ser Ala Leu Gly Asp His Leu Thr

405 410 415

Arg Ser Phe Ile Glu Ser Lys Glu Leu Glu Trp Ser Lys Tyr Ser Gln

420 425 430

Ser Val Ser Asp Trp Glu Arg Gln Arg Tyr Met Asn Trp

435 440 445

Claims (7)

1.过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶来源于嗜酸乳杆菌，其在谷氨酸棒杆菌基因工程菌中的编码基因的序列如SEQ IDNO：2所示。

2.如权利要求1所述过表达异源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主菌为谷氨酸棒杆菌GM34或谷氨酸棒杆菌TP607，表达载体为pXMJ19。

3.权利要求1或2所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的用途，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶，应用于发酵生产L-谷氨酰胺或L-色氨酸。

4.如权利要求3所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的用途，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌应用于发酵生产L-谷氨酰胺，5L发酵罐补料分批发酵48h，L-谷氨酰胺的产量达到39±1g/L，和/或达到原宿主菌产量的1.34倍。

5.如权利要求3所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的用途，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌应用于发酵生产L-色氨酸，摇瓶发酵48h，L-色氨酸产量达到11.4±0.20g/L，和/或达到原宿主菌的1.43倍。

6.如权利要求3所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的用途，其特征在于，在pH 7.0条件下所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌过表达外源谷氨酰胺合成酶的酶活为620mU，和/或是过表达内源谷氨酰胺合成酶的谷氨酸棒杆菌的3.9倍。

7.权利要求1或2所述谷氨酸棒杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成并优化来源于嗜酸乳杆菌的谷氨酰胺合成酶基因glnA，基因序列如SEQ IDNO：2所示；

(2)通过酶切连接的方法，将基因glnA连接在大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭型表达载体pXMJ19上，构建了表达载体pXMJ19glnA；

(3)将表达载体pXMJ19glnA导入谷氨酸棒杆菌GM34或谷氨酸棒杆菌TP607，构建基因工程重组菌GM34/pXMJ19glnA或TP607/pXMJ19glnA。